專利名稱：一種細(xì)菌脂多糖的沉降方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌脂多糖的沉降方法，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
G_細(xì)菌在自然界廣泛存在，能從水、土壤、動植物及人體中分離出G_細(xì)菌。細(xì)菌脂多糖(LPS)是G—細(xì)菌外膜的組成成分，其是由脂質(zhì)A、核心多糖和0-側(cè)鏈三部分組成。LPS會引起廣譜非特異性的病理生理反應(yīng)，比如發(fā)燒、白細(xì)胞數(shù)變化、彌散性血管內(nèi)凝血、低血壓、休克或者死亡，其抗原性很強，極小劑量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致大部分動物死亡，因此，人用藥物尤其是注射制劑需要對內(nèi)毒素(熱原質(zhì))限量，例如葡萄糖注射液、白蛋白、球蛋白、細(xì)胞因子、多糖類疫苗、蛋白類疫苗均要對產(chǎn)品進(jìn)行熱原質(zhì)檢測并控制在一定水平，超限熱原質(zhì)必須從產(chǎn)品中除去。另一方面，LPS是重要的保護(hù)性抗原，在各種動物模型中，LPS抗原表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫保護(hù)作用，可以將純化的LPS制作成為疫苗，預(yù)防疾病發(fā)生。從含有LPS的溶液中除去或者純化細(xì)菌脂多糖的方法包括化學(xué)純化方法和物理分離方法，化學(xué)純化是用乙醇、核酸酶、蛋白酶、丙酮等化學(xué)試劑純化，成本高且污染環(huán)境。物理分離方法主要是超速離心分離方法，如，周炳榮等，“細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)提取及純化技術(shù)”，藥用微生物學(xué)，藥學(xué)情報通訊1989年第7卷第I期中LPS純化方法即采用最常用的超速離心(4萬轉(zhuǎn)X4小時，共三次)，在這一條件下，LPS可沉淀下去，而蛋白質(zhì)、核酸多糖則保留在上清液中，除去上清液即可得到較為純化的LPS，經(jīng)計算，4萬轉(zhuǎn)應(yīng)大于15萬g。超速離心的方法可以克服化學(xué)純化方法的缺陷，但是因為超速離心的離心力大，通常大于100，OOOg,離心時間長，通常大于10h，處理量小，并且，現(xiàn)有技術(shù)中，離心力大于IOOOOOg的離心機的價格會顯著高于離心力低于IOOOOOg的離心機，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，難以大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的物理方式沉降細(xì)菌脂多糖的方法。本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步驟(I)取含有細(xì)菌脂多糖的溶液，冷凍至完全凝固，解凍；(2)將步驟(I)處理后的溶液離心，得到的沉淀，即為細(xì)菌脂多糖。其中，步驟(I)所述冷凍的溫度為-10 °C -80 °C。優(yōu)選地，所述冷凍的溫度為-20 0C -40。。。其中，步驟(I)所述解凍的溫度大于0°C且小于80°C。優(yōu)選地，所述解凍的溫度大于0°C且小于等于70°C，可以保證蛋白制品不會失活。其中，步驟(2)所述離心條件是,離心力為100(T30000g,離心時間大于lOmin。優(yōu)選地，所述離心力為6000g,離心時間為30 60min。其中，所述含有細(xì)菌脂多糖的溶液是細(xì)菌脂多糖提取液，或者污染細(xì)菌脂多糖的生物制品或藥品。
生物制品是指用基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等生物學(xué)技術(shù)制成的免疫制劑或有生物活性的制劑。所述細(xì)菌脂多糖提取液可以采用細(xì)菌脂多糖提取液的常用提取方法提取，如，采用三氯醋酸法、酚水法、高壓超聲處理法或者DMSO法。其中，DMSO是二甲基亞砜。所述污染細(xì)菌脂多糖的生物制品是疫苗、抗毒素、血清、免疫球蛋白、凝血因子、生長因子、干擾素或者白蛋白。本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法，先對細(xì)菌脂多糖的溶液進(jìn)行冷凍和解凍后，僅需低速離心即可達(dá)到分離細(xì)菌脂多糖的目的，克服了傳統(tǒng)物理分離細(xì)菌脂多糖需超速離心的缺陷，成本低廉，操作方便，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法取三氯醋酸法提取的細(xì)菌脂多糖提取液，-80°C下冷凍，10°C解凍，2000g離心60min，所得沉淀即為細(xì)菌脂多糖。實施例2本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法取酚水法提取的細(xì)菌脂多糖提取液，-10°C下冷凍，70°C解凍，30000g離心lOmin，
所得沉淀即為細(xì)菌脂多糖。實施例3本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法取被LPS污染的人血白蛋白，-20 °C下冷凍，50 V解凍，6000g離心30min，沉淀即為
除掉的細(xì)菌脂多糖。實施例4本發(fā)明細(xì)菌脂多糖的沉降方法取被LPS污染的疫苗，_50°C下冷凍，80°C解凍，4000g離心50min，沉淀即為除掉的
細(xì)菌脂多糖。以下通過銅綠假單胞菌IATS分型系統(tǒng)的菌株實驗，證明本發(fā)明有益效果實驗例ILPS純化銅綠假單胞菌購自ATCC (美國模式菌種保藏中心，American Type CultureCollection)，其保藏號為銅綠假單胞菌IATS 11型ATCC33358。I、實驗方法(I)菌體收集銅綠假單胞菌IATS 11型ATCC33358菌株按常規(guī)方法培養(yǎng)。菌體制備可采用液體發(fā)酵或固體克氏瓶培養(yǎng)收集，在菌種啟封、菌種檢定后，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、殺菌脫毒，最后離心收集菌體。( 2 )酚水法提取LPSLPS的提取采用酚水法提取，首先用注射用水將菌體配制成20%的菌液，再加入等體積的事先配制好的90%苯酹液,置65 68°C水浴振蕩提取60min,冷卻后400(T8000rmp離心50min，抽取水相層LPS提取液，用預(yù)熱至68°C注射用水補充提取液到原體積，重復(fù)提取3次。匯總水相層LPS提取液，再次離心后用進(jìn)行透析，透析采用級別為純化水以上的水液透析，每天換水2 3次,至少透析3天。(3)本發(fā)明方法處理透析結(jié)束后抽取5ml做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，其余收集起來并放置于_20°C低溫冰柜，7d后將其轉(zhuǎn)移至室溫進(jìn)行解凍，解凍完成后裝于容量為IOOOml離心杯，每次離心6個離心杯，在6000g離心力的情況下離心50min。離心完成后，抽取5ml上清液做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，另取IOOml凍干瓶5個，每瓶裝30ml上清液并進(jìn)行凍干，凍干后分析核酸和蛋白質(zhì)含量。取一個離心杯所得沉淀，用注射用水進(jìn)行復(fù)溶至原體積1000ml,抽取5ml復(fù)溶液做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測按中國藥典2010版附錄XII E細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法中的動態(tài)濁度法進(jìn)行；蛋白質(zhì)含量檢測按中國藥典2010版附錄XI B蛋白質(zhì)測定法第二法Lowry法進(jìn)行，牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)；核酸含量檢測按中國藥典2010版附錄II A紫外-可見分光光度法進(jìn)行；凍干制品水分檢測按中國藥典2010版附錄XII D水分測定法第二法甲苯法進(jìn) 行。2、實驗結(jié)果經(jīng)檢測，檢測結(jié)果見表I和表2 表I細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測結(jié)果
_上清液_
檢測樣品本發(fā)明方法本發(fā)明方法沉淀復(fù)溶液
_1] _處理+前_處理后_
LPS測定值
1523658 92316 1436579(EU/ml)_ 表2本發(fā)明方法處理后上清液凍干后各成分檢測結(jié)果
檢測樣品 _各成分含量(％)_
_3] _核酸_蛋白質(zhì)_K 分
上清液凍千品_78.92_12.77_2.51上述數(shù)據(jù)表明，經(jīng)本發(fā)明方法處理后，所得沉淀為LPS，所得上清液中，LPS大部分除去，除去率為94%，剩余部分主要成分為核酸和蛋白質(zhì)，說明本發(fā)明方法可以充分沉淀LPS。實驗例2LPS純化銅綠假單胞菌購自ATCC (美國模式菌種保藏中心，American Type CultureCollection)，其保藏號為銅綠假單胞菌IATS 4型ATCC33351。I、實驗方法(I)菌體收集銅綠假單胞菌IATS 4型ATCC33351菌株按常規(guī)方法培養(yǎng)。菌體制備可采用液體發(fā)酵或固體克氏瓶培養(yǎng)收集，在菌種啟封、菌種檢定后，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、殺菌脫毒，最后離心收集菌體。(2 )酚水法提取LPSLPS的提取采用酚水法提取，首先用注射用水將菌體配制成20%的菌液，再加入等體積的事先配制好的90%苯酹液,置65 68 °C水浴振蕩提取60min,冷卻后400(T8000rmp離心50min，抽取水相層LPS提取液，用預(yù)熱至68°C注射用水補充提取液到原體積，重復(fù)提取3次。匯總水相層LPS提取液，再次離心后用進(jìn)行透析，透析采用級別為純化水以上的水液透析，每天換水2 3次,至少透析3天。( 3 )本發(fā)明方法處理透析結(jié)束后抽取5ml做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，其余收集起來并放置于_40°C低溫冰柜，5d后將其轉(zhuǎn)移至37°C進(jìn)行解凍，解凍完成后裝于容量為IOOOml離心杯，每次離心6個離心杯，在5000g離心力的情況下離心60min。離心完成后，抽取5ml上清液做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，另取IOOml凍干瓶5個，每瓶裝30ml上清液并進(jìn)行凍干，凍干后分析核酸和蛋白質(zhì)含量。取一個離心杯所得沉淀，用注射用水進(jìn)行復(fù)溶至原體積1000ml,抽取5ml復(fù)溶液做定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測按中國藥典2010版附錄XII E細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法中的動態(tài)濁度法進(jìn)行；蛋白質(zhì)含量檢測按中國藥典2010版附錄XI B蛋白質(zhì)測定法第二法Lowry法進(jìn)行，牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)；核酸含量檢測按中國藥典2010版附錄II A紫外-可見分光光度法進(jìn)行；凍干制品水分檢測按中國藥典2010版附錄XII D水分測定法第二法甲苯法進(jìn)行。2、實驗結(jié)果經(jīng)檢測，上清液的檢測結(jié)果見表3和表4 ;沉淀的檢測結(jié)果為所得的沉淀為LPS。表3細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌脂多糖的沉降方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)取含有細(xì)菌脂多糖的溶液，冷凍至完全凝固，解凍； (2)將步驟(I)處理后的溶液離心，得到的沉淀，即為細(xì)菌脂多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征 在于步驟(I)所述冷凍的溫度為-IO0C -80。。。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述冷凍的溫度為-2(T-40°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)所述解凍的溫度大于0°C且小于等于80°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述解凍的溫度大于0°C且小于等于70。。。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述離心條件是，離心力為100(T30000g，離心時間大于lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述離心力為6000g，離心時間為30 60mino
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述含有細(xì)菌脂多糖的溶液是細(xì)菌脂多糖提取液，或者污染細(xì)菌脂多糖的生物制品或藥品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌脂多糖提取液是采用三氯醋酸法、酚水法、高壓超聲處理法或者DMSO法制備的細(xì)菌脂多糖提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述污染細(xì)菌脂多糖的生物制品是疫苗、抗毒素、血清、免疫球蛋白、凝血因子、生長因子、干擾素或者白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步驟(1)取含有細(xì)菌脂多糖的溶液，冷凍至完全凝固，解凍；(2)將步驟(1)處理后的溶液進(jìn)行低速離心，得到的沉淀，即為細(xì)菌脂多糖。本發(fā)明提供的細(xì)菌脂多糖的沉降方法簡單，克服現(xiàn)有超速離心處理條件苛刻、成本高的缺陷，克服化學(xué)純化需用大量化學(xué)試劑導(dǎo)致高成本且污染環(huán)境的弊端，具有廣泛的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C07K16/00GK102746414SQ201210253340
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者吳鴻舟, 姜曉, 張雪梅, 楊碩, 王學(xué)林, 葛永紅, 謝茂超, 陳明拓 申請人:成都生物制品研究所有限責(zé)任公司, 成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司