表達ibv s1和n雙抗原蛋白重組質(zhì)粒及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達IBV的S1和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒及其構建方法和應用，發(fā)明人根據(jù)GenBank中注冊的雞傳染性支氣管炎病毒S1、N和Ub基因序列設計引物，通過PCR擴增雞傳染性支氣管炎病毒中國分離株GX-YL5株的S1、N和雞的Ub基因，并用分子生物學方法將雞傳染性支氣管炎病毒中國分離株GX-YL5株N和S1基因與雞Ub基因插入真核表達載體pVAX1中，構建了表達N和S1基因與雞Ub基因共表達質(zhì)粒，研制了DNA疫苗pVAX1-Ub-linker-N-S1。實驗證明，該疫苗預防IBV療效顯著。應用本發(fā)明可同時將IBV的S1、N和雞Ub基因串聯(lián)插入pVAX1載體，用于預防雞傳染性支氣管炎。
【專利說明】表達IBV SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于動物醫(yī)藥生物工程研究領域，尤其涉及一種表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒及其構建方法和應用。
【背景技術】[0002]雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis, IB)為國際獸醫(yī)局及我國規(guī)定的家禽二類傳染病之一，是目前分布最廣泛、發(fā)病最普遍的疫病之一。該病是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性的呼吸道疾病，不同日齡、性別、品種雞均可易感。IBV主要侵害雞的呼吸道、腸道、輸卵管及腎臟，可引起相應器官的病變和損傷，更重要的是容易引起細菌及其它病原的繼發(fā)感染，引起更大的損失，是造成目前生產(chǎn)上最普遍而且危害最大的雞呼吸道綜合癥的重要病因之一。由于IBV在雞群中感染的廣泛性和普遍性，加之病毒基因組RNA復制過程的不連續(xù)性以及RNA聚合酶的不完全校對機制，造成其基因組十分容易發(fā)生點突變、缺失、插入和不同毒株基因組間的同源重組，使得病毒的血清型、基因型、致病性、免疫原性等極易發(fā)生變異，因而病毒臨床表現(xiàn)復雜、血清型眾多，而各血清型之間僅有部分或完全沒有交叉保護作用，從而給本病的免疫防控帶來很大的困難。
[0003]IBV有三個主要結構蛋白，即纖突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣殼(N)蛋白。S蛋白由SI和S2兩個糖蛋白亞基組成，其中SI糖蛋白是IBV蛋白中變異程度最大的結構蛋白，系IBV的主要保護性抗原和致病相關基因，IBV的抗原性和致病性的改變主要與SI基因的變異有關。SI基因5’端起始密碼后第159~444nt處存在一個高變區(qū)(HVR)，在HVR內(nèi)第330~357nt處又存在一個所謂的相對保守處，因而將HVR分隔為上游的HVR I和下游的HVR II。大多IBV血清型抗原決定簇位于S蛋白的SI亞單位的N端，即SI的前300個氨基酸殘基內(nèi)。那些遺傳起源接近血清型不同的毒株大多可從HVR區(qū)編碼的抗原簇表位的差異得到反映。N蛋白位于病毒的內(nèi)部，相對于SI基因而言則比較保守，它在病毒復制及組裝過程中具有重要作用，而且具有很好的免疫原性，在體內(nèi)可誘導產(chǎn)生高水平的抗體并介導細胞毒性T細胞效應(CTL)。防控IB的關鍵在于避免早期的感染，這樣能大大減少IBV對雞體的侵害。
[0004]疫苗預防仍是控制IB的最有效措施之一，針對IB病毒的基因變異與血清型變化，怎樣使用疫苗來有效預防該病是我們當前迫切要解決的難題?，F(xiàn)有的研究針對載體和佐劑的單基因疫苗居多，研制能產(chǎn)生高的特異性細胞免疫和體液免疫且廣譜的新型疫苗仍是當前研究的難點和熱點。DNA疫苗具有一般重組病毒活載體疫苗抗原合成和提呈及類似自然感染的優(yōu)點，其在安全性和有效性上具有突出的優(yōu)點而且可以將多個抗原基因構建在同一表達載體上形成多價疫苗。但是，常規(guī)DNA疫苗的免疫原性較傳統(tǒng)疫苗弱，主要原因是大部分質(zhì)粒在未發(fā)揮作用之前就降解了，而且表達的蛋白只有小部分能達到靶器官發(fā)揮免疫誘導作用。針對此問題，提高DNA疫苗效果的一個令人振奮的途徑是DNA疫苗的靶向策略，即將DNA疫苗或其表達的蛋白產(chǎn)物定向于抗原遞呈細胞(APC)，特別是樹突狀細胞(DC)。APC內(nèi)部靶向策略之一就是增強MHC-1類途徑，使用微小基因疫苗將抗原表位直接轉(zhuǎn)運進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0005]泛素(Ubiquitin, Ub)是由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細胞內(nèi)的小分子多肽。泛素及其對蛋白質(zhì)的標志修飾(泛素化，ubiquitination orubiquityrmtion)參與細胞內(nèi)ATP依賴的選擇性蛋白質(zhì)降解過程,泛素-蛋白酶體途徑的發(fā)現(xiàn)，引起了研究者的廣泛關注。研究表明，26S蛋白酶體與主要組織相容性復合物(MHC)限制性類抗原的處理有密切關系，泛素-蛋白酶體途徑是MHC-1限制性類抗原提呈所必需的環(huán)節(jié)。Ub可通過共價鍵結合將外源性抗原轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性抗原并促進內(nèi)源性抗原在胞漿內(nèi)的降解，有利于使抗原導向到蛋白酶體中，并且加速它的循環(huán)及通過MHC-1類途徑的遞呈。近年來，國內(nèi)外已有學者利用泛素來提高DNA疫苗的免疫效果，研究結果表明Ub融合質(zhì)粒DNA能夠誘生較強的細胞免疫反應。目前關于泛素增強禽類病原免疫應答研究報道甚少，尤其是針對病毒抗原的研究還未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒及其構建方法和應用。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒，主要由雞傳染性支氣管炎 病毒的S1、N基因、雞的Ub基因和真核表達載體pVAXl組成。
[0008]Ub基因通過一段編碼(G3S) 4多肽的linker與將雞的Ub基因與SI和N基因連接。
[0009]上述表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列。
[0010]雞傳染性支氣管炎病毒來自中國分離株GX-YL5株。
[0011]上述表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒的構建方法，用PCR方法擴增雞傳染性支氣管炎病毒的S1、N和雞的Ub基因，將雞的Ub基因與雞傳染性支氣管炎病毒的SI和N基因通過引入一段編碼(G3S)4多肽的linker采用酶切位點相連的方法連接并將PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切定向插入以HindIII和XhoI雙酶切處理的真核表達載體PVAXl中，即得Ub介導的雞傳染性支氣管炎病毒的SI和N基因真核表達質(zhì)粒PVAX1-Ub-1inker-N-SI。
[0012]上述表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒在制備預防雞傳染性支氣管炎DNA疫苗方面的應用。
[0013]針對目前雞傳染性支氣管炎缺乏有效預防疫苗的問題，發(fā)明人根據(jù)GenBank中注冊的雞傳染性支氣管炎病毒S1、N和Ub基因序列設計引物，通過PCR擴增雞傳染性支氣管炎病毒中國分離株GX-YL5株的S1、N和雞的Ub基因，并用分子生物學方法將雞傳染性支氣管炎病毒中國分離株GX-YL5株N和SI基因與雞Ub基因插入真核表達載體pVAXl中，構建了表達N和SI基因與雞Ub基因共表達質(zhì)粒，研制了 DNA疫苗pVAXl-Ub-linker-N-Sl。實驗證明，該疫苗預防IBV療效顯著。應用本發(fā)明可將不同IBV S1、N和雞Ub基因串聯(lián)插入PVAXI載體，用于預防雞傳染性支氣管炎?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0014]圖1 是 pVAXl-Ub-linker-N-Sl 雙酶切鑒定結果圖，圖中:M 為 DL5000DNA Marker ；I 為 pVAXl-Ub-linker-N-Sl 質(zhì)粒 Xho I+Hind III 雙酶切結果。
[0015]圖2是免疫熒光方法檢測結果圖，圖中:左圖為pVAXl-Ub-linker-N-Sl在Vero細胞中瞬時表達結果；右圖為PVAXl空載體轉(zhuǎn)染對照結果。
【具體實施方式】
[0016]1.1病毒株
[0017]IBV 毒株 GX-YL5 (GenBank N0.HQ848267.1)。
[0018]1.2 方法
[0019]1.2.1構建質(zhì)粒引物的設計
[0020]參照GenBank中已知的GX-YL5全基因和雞泛素基因的序列設計引物，不同的引物上分別有EocR 1、Apa 1、Hind II1、BamH I和Xho I的酶切位點，所有內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。Ub、N和SI基因擴增引物序列見表1。
[0021]表1引物序列
[0022]
【權利要求】
1.一種表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒，其特征在于主要由雞傳染性支氣管炎病毒的S1、N基因、雞的Ub基因和真核表達載體PVAXl組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達IBVSI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒，其特征在于:所述Ub基因通過一段編碼(G3S)4多肽的linker與將雞的Ub基因與SI和N基因連接。
3.根據(jù)權利要求2所述的表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的喊基序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒，其特征在于:所述雞傳染性支氣管炎病毒來自中國分離株GX-YL5株。
5.根據(jù)權利要求1所述表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒的構建方法，其特征在于用PCR方法擴增雞傳染性支氣管炎病毒的S1、N和雞的Ub基因，將雞的Ub基因與雞傳染性支氣管炎病毒的SI和N基因通過引入一段編碼(G3S)4多肽的linker采用酶切位點相連的方法連接并將PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切定向插入以HindIII和XhoI雙酶切處理的真核表達載體PVAXl中，即得Ub介導的雞傳染性支氣管炎病毒的SI和N基因真核表達質(zhì)粒 pVAXl-Ub-linker-N-Sl。
6.權利要求1所述表達IBV的SI和N雙抗原蛋白重組質(zhì)粒在制備預防雞傳染性支氣管炎DNA疫苗方面的應用。
【文檔編號】A61P31/14GK103627718SQ201310470341
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權日:2013年10月10日
【發(fā)明者】韋平, 李孟, 何坤 申請人:廣西大學