硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素可以調(diào)控特異miRNA的表達(dá)、增加細(xì)胞因子伽馬干擾素和白細(xì)胞介素-2的合成和提高淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作為免疫增強(qiáng)劑用于癌癥的治療。
【專利說明】硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途，屬于硫酸軟骨素的醫(yī)藥新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]硫酸軟骨素是由D-葡萄糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成雙糖基本單位構(gòu)成的粘多糖類物質(zhì)，是生物體內(nèi)結(jié)締組織基質(zhì)的成分之一，可從動物的鼻骨、喉骨及其它軟骨中提取。臨床上，硫酸軟骨素片用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎、類軟骨炎以及高脂血癥；硫酸軟骨素注射液用于神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛、動脈硬化等疾病的輔助治療；硫酸軟骨素滴眼液用于眼疲勞、眼干燥癥及角膜炎、角膜潰瘍和角膜損傷的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素可以調(diào)控特異miRNA的表達(dá)、增加細(xì)胞因子伽馬干擾素和白細(xì)胞介素-2的合成和提高淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作為免疫增強(qiáng)劑用于癌癥的治療。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途。
[0005]本發(fā)明的有益效果是:
[0006]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素可以調(diào)控特異miRNA的表達(dá)、增加細(xì)胞因子伽馬干擾素和白細(xì)胞介素-2的合成和提高淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作`為免疫增強(qiáng)劑用于癌癥的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為硫酸軟骨素對小鼠體內(nèi)B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長的抑制作用圖；
[0008]圖2為硫酸軟骨素對轉(zhuǎn)移于小鼠肺部的B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長的抑制作用圖；
[0009]圖3為硫酸軟骨素對小鼠肺部B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長抑制作用的統(tǒng)計結(jié)果圖；
[0010]圖4為硫酸軟骨素對miR-223表達(dá)的抑制作用圖；
[0011]圖5為硫酸軟骨素對伽馬干擾素產(chǎn)生的促進(jìn)作用圖；
[0012]圖6為硫酸軟骨素對白細(xì)胞介素-2產(chǎn)生的促進(jìn)作用圖；
[0013]圖7硫酸軟骨素對淋巴細(xì)胞生長的促進(jìn)作用圖；
[0014]圖8為硫酸軟骨素對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的促進(jìn)作用圖。【具體實(shí)施方式】
[0015]以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0016]本發(fā)明所用硫酸軟骨素的制備方法參考Fialkova，M.A.et al.，1989.The effectof chondroitin sulfate preparations on wound healing and the strength of thesurgical scar,Biull Eksp Biol Med， 108(9):350-351。
[0017]實(shí)驗(yàn)例:采用小鼠動物模型評價硫酸軟骨素對抗腫瘤免疫的增強(qiáng)作用和對B16F10黑色素瘤的治療效果
[0018]1、材料:
[0019]1.1處于生長對數(shù)期的B16F10黑色素瘤細(xì)胞購買自美國ATCC公司。
[0020]1.2小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。
[0021]2、方法:
[0022]第一組小鼠共20只，每只小鼠皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞；第一組小鼠又分為第一藥物對照組和第一藥物處理組。
[0023]第二組小鼠共20只，每只小鼠靜脈注射五十萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞；第二組小鼠又分為第二藥物對照組和第二藥物處理組。
[0024]空白對照組小鼠共10只，每只小鼠未注射B16F10黑色素瘤細(xì)胞。
[0025]第一藥物對照組和第二藥物對照組的小鼠腹腔注射生理鹽水，每只注射100微升生理鹽水，第一藥物處理組和第二藥物處理組的小鼠隔一天靜脈注射I毫克硫酸軟骨素；然后，每天觀察小鼠的體形變化和記錄小鼠的體重。在第三天、第七天、第九天和第十一天，每組分別殺死三只小鼠，分析小鼠體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的生長和免疫系統(tǒng)的變化。
[0026]數(shù)據(jù)統(tǒng)計
[0027]數(shù)據(jù)均采用了數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，圖中的p < 0.0001、p < 0.01、p < 0.005和p< 0.05，表明對照組與處理組有顯著的差別。
[0028]3、結(jié)果:
[0029]第一藥物對照組的小鼠皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后，黑色素瘤細(xì)胞在體內(nèi)不斷長大，而第一藥物處理組的小鼠在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后，靜脈注射了硫酸軟骨素，硫酸軟骨素明顯抑制了 B16F10黑色素瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長，結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看到，第一藥物對照組的小鼠，在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的第16天，側(cè)背可見腫瘤小塊，隨后迅速增大，到第30天腫瘤塊已達(dá)350立方毫米以上。而注射硫酸軟骨素的第一藥物處理組小鼠，在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的第20天以后，才見腫瘤小塊的出現(xiàn)，并且腫瘤塊沒有繼續(xù)明顯增大，到第30天腫瘤塊也僅有25立方毫米。
[0030]第二組小鼠每只小鼠靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞，正常小鼠的肺顏色均一，第二藥物對照組的小鼠由于B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺部生長，因此，在肺部表面形成密密麻麻的B16F10黑色素瘤，而第二藥物處理組的小鼠由于注射了硫酸軟骨素，顯著減少了轉(zhuǎn)移的B16F10黑色素瘤細(xì)胞在肺部的生長，因此，第二藥物處理組小鼠的肺部B16F10黑色素瘤明顯少于第二藥物對照組，如圖2所示。硫酸軟骨素對小鼠肺部B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長抑制作用的統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，第二藥物對照組的小鼠在靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的第11天，在小鼠的肺部平均可發(fā)現(xiàn)170個腫瘤小塊。而注射硫酸軟骨素的第二藥物處理組小鼠，在靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的第11天，在小鼠的肺部平均只發(fā)現(xiàn)40個腫瘤小塊，顯著少于第二藥物對照組的小鼠。當(dāng)然，未靜脈注射B16F10黑色素瘤細(xì)胞的空白對照組小鼠，在其肺部沒有發(fā)現(xiàn)任何腫瘤塊。
[0031]經(jīng)測定和分析表明，硫酸軟骨素能降低miRNA-223分子的表達(dá)，如圖4所示，從而增加細(xì)胞因子伽馬干擾素的合成增加，如圖5所示，因此，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫系統(tǒng)，如圖6~8所示。從小鼠脾臟中分離淋巴細(xì)胞，在24孔培養(yǎng)板每孔加入2毫升RPM1-1640培養(yǎng)基，然后每孔加入一百萬小鼠淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分三組，每組8孔淋巴細(xì)胞。第一組為對照組，無額外添加物；第二組為腫瘤抗原gplOO處理組，每孔添加10_5摩爾gplOO腫瘤抗原；第三組為硫酸軟骨素處理組，每孔添加1(T5摩爾gplOO腫瘤抗原和50微克/毫升硫酸軟骨素。在37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)三天后，收集淋巴細(xì)胞。然后從淋巴細(xì)胞中分離RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR測定miR-223的表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果如圖4顯示，與第一對照組相比，在第二組中g(shù)plOO腫瘤抗原處理明顯降低miR-223的表達(dá)水平；在第三組中，硫酸軟骨素處理進(jìn)一步降低miR-223的生成。結(jié)果表明，硫酸軟骨素能降低miRNA-223分子的表達(dá)。研究已經(jīng)證實(shí)，miR-223能夠抑制伽馬干擾素的產(chǎn)生。通過不同濃度硫酸軟骨素培養(yǎng)淋巴細(xì)胞顯示，硫酸軟骨素能夠增加細(xì)胞因子伽馬干擾素的合成增加，如圖5所示。因此，硫酸軟骨素可能降低miRNA-223合成從而增加伽馬干擾素的產(chǎn)生。同樣地，通過不同濃度硫酸軟骨素培養(yǎng)淋巴細(xì)胞顯示硫酸軟骨素能促進(jìn)白細(xì)胞介素-2的產(chǎn)生，如圖6所示；氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷同位素示蹤試驗(yàn)表明，硫酸軟骨素也促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分裂，如圖7所示。脾臟淋巴細(xì)胞計數(shù)顯示，硫酸軟骨素處理明顯增加淋巴細(xì)胞的數(shù)目，如圖8所示。因此，硫酸軟骨素能增強(qiáng)抗腫瘤的免疫系統(tǒng)。
[0032]上述實(shí)驗(yàn)中，每次試驗(yàn)至少重復(fù)3次。每次試驗(yàn)結(jié)果一致。圖中的數(shù)據(jù)是每次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，并表明了實(shí)驗(yàn)誤差。
[0033]由上述實(shí)施例表明，硫酸軟骨素對B16F10黑色素瘤具有良好的抑制作用，主要是通過增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)從而抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞的生長。由此證明，硫酸軟骨素具有間接的抗黑色素瘤活性，能用于制`備增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的藥物，治療癌癥病人。
[0034]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強(qiáng)劑中的用途，所述硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)式如下所示:
【文檔編號】A61K31/737GK103610689SQ201310539374
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】周菊華 申請人:魯東大學(xué)