高親和力ny-eso t細(xì)胞受體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種T細(xì)胞受體(TCR)，其具有結(jié)合SLLMWITQC?HLA A2復(fù)合物的特性；并且所述TCR對所述SLLMWITQC?HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對SLLMWITQC?HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少兩倍。本發(fā)明還提供了此類TCR與治療劑的融合分子。此類TCR可以單獨(dú)使用，也可與治療劑聯(lián)用，以靶向呈遞SLLMWITQC?HLA A2復(fù)合物腫瘤細(xì)胞。
【專利說明】
高親和力NY-ESO T細(xì)胞受體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及能夠特異性識(shí)別衍生自NY-ESO-ι蛋白 多肽的Τ細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR)。本發(fā)明還涉及所述受體的制備和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 僅僅有兩種類型的分子能夠以特異性的方式識(shí)別抗原。其中一種是免疫球蛋白或 抗體；另一種是T細(xì)胞受體（TCR)，它是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異二聚體形式存 在的細(xì)胞膜表面的糖蛋白。免疫系統(tǒng)的TCR總譜的組成是在胸腺中通過V(D)J重組，然后進(jìn) 行陽性和陰性選擇而產(chǎn)生的。在外周環(huán)境中，TCR介導(dǎo)了 T細(xì)胞對主組織相容性復(fù)合體-肽 復(fù)合物（PMHC)的特異性識(shí)別，因此其對免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫功能是至關(guān)重要的。
[0003] TCR是呈遞在主組織相容性復(fù)合體（MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體，這種外 源肽或內(nèi)源肽可能會(huì)是細(xì)胞出現(xiàn)異常的唯一跡象。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原特異性的TCR 與PMHC復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC)直接的物理接觸，然后T細(xì)胞及APC 兩者的其他細(xì)胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，這就引起了一系列后續(xù)的細(xì)胞信號(hào)傳遞和其 他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細(xì)胞對其靶細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。
[0004] 與TCR相對應(yīng)的MHC I類和II類分子配體也是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)但對 于抗原的呈遞具有特異性，不同的個(gè)體有不同的MHC，從而能呈遞一種蛋白抗原中不同的短 肽到各自的APC細(xì)胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復(fù)合體。
[0005] 短肽SLLMWITQC源自于被多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)的NY-ES0-1蛋白（Chen et al.，（1997)PNAS USA 941914-1918)。腫瘤細(xì)胞的 I 型 HLA 分子呈遞包括 SLLMWITQC 在內(nèi) 的源自于NY-ES0-1的短肽。因此，SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物提供了一種TCR可靶向腫瘤 細(xì)胞的標(biāo)記。能夠特異性結(jié)合SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的TCR對腫瘤的治療具有很高的 應(yīng)用價(jià)值。例如，能夠靶向該腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的TCR可用于將細(xì)胞毒性劑或免疫刺激劑遞送 到靶細(xì)胞，或被轉(zhuǎn)化入T細(xì)胞，使表達(dá)該TCR的T細(xì)胞能夠破壞腫瘤細(xì)胞，以便在被稱為過 繼免疫治療的治療過程中給予患者。對于前一目的，理想的TCR是具有較高的親和力的，從 而使該TCR能夠長期駐留在所靶向的細(xì)胞上面。對于后一目的，則優(yōu)選使用中等親和力的 TCR。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)可用于滿足不同目的的靶向腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的TCR。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物具有較高親和力的TCR。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種上述類型TCR的制備方法及上述類型TCR的用途。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種T細(xì)胞受體（TCR)，其具有結(jié)合SLLMWITQC-HLA A2 復(fù)合物的特性，并包含TCR α鏈可變域和/或TCR β鏈可變域，相對于具有α鏈可變域氨 基酸序列SEQ ID Ν0:75和β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID Ν0:76的TCR :
[0009] (i)所述TCR在SEQIDN0:75所示其α鏈可變域氨基酸和/或在SEQIDN0 :76 所示其β鏈可變域氨基酸中發(fā)生突變；和
[0010] ( ii )所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對 SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少兩倍。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述突變發(fā)生在α鏈和/或β鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)中。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述突變發(fā)生在α鏈的CDR1和/或CDR3中，和/或所述突變 發(fā)生在β鏈的⑶R2和/或⑶R3中。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生 型TCR對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少10倍；優(yōu)選地至少20倍；更優(yōu)選 地，至少100倍。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù) KD< 3. 2 μΜ〇
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的解離平衡常數(shù) 0· 5 μ Μ彡KD彡3. 2 μ Μ ;優(yōu)選地，ΙμΜ彡KD彡3·2μΜ ;更優(yōu)選地，1 μ Μ彡K D彡2 μ M〇
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù) KD彡500nM ;優(yōu)選地，10pM彡K D彡500nM。更優(yōu)選地，10pM彡K D彡10nM。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述突變發(fā)生在SEQ ID NO:75所示其α鏈可變域的選自下組 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)：27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、 97S和98T，其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID NO: 75所示的編號(hào)；和/或
[0018] 所述突變發(fā)生在SEQ ID N0:76所示其β鏈可變域的選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸殘基位點(diǎn)：5(^、5謂、52153￥、54?、951\976、98厶、990、100?、1010和102!1，其中，氨基酸殘 基編號(hào)采用SEQ ID Ν0:76所示的編號(hào)。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，突變后的所述TCRa鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基 酸殘基 ：27￥、27￥、27!1、27卩或271281\28￥、280、28?、28~或2洲；29?、291^、291\29￥或29八 ； 30Q ;51N ;53S ;54Q ;55T ;91N ;94T、94N、94H、94I 或 94S ;95A 或 95S ;96R 或 96W ;97W ;98N、 98D或98A ;其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID NO:75所示的編號(hào)；和/或
[0020] 突變后的所述TCRi3鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基：50C或 50Y ;51H 或 51L ;52G ;53L ;54V 或 541 ;95S ;97N ;98G 或 98S ;99N 或 99L ;100A ;101I ;102V 或1021 ;其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID N0:76所示的編號(hào)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90 ;和 / 或
[0022] 所述TCR 的 β 鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包括下表所示的α和β鏈可變域組合：
[0024]

[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR是α β異質(zhì)二聚TCR，其具有α和β鏈恒定域序列， 所述α和β鏈恒定域序列中具有半胱氨酸殘基（所述半胱氨酸殘基可以為天然的半胱氨 酸殘基或人工引入的半胱氨酸殘基），所述半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域之 間形成二硫鍵。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述二硫鍵為人工二硫鍵。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在所述TCR中，形成人工二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下 列的一組或多組位點(diǎn)：
[0029] TRAO01 外顯子 1 的 Thr48 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser57 ;
[0030] TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser77 ;
[0031] TRAO01 外顯子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Serl7 ;
[0032] TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Asp59 ;
[0033] TRAO01 外顯子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Glul5 ;
[0034] TRAO01 外顯子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser54 ;
[0035] TRAO01 外顯子 1 的 Pro89 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Alal9 ;和
[0036] TRAO01 外顯子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Glu20。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR α鏈可變域和/或β鏈可變域的疏水芯發(fā)生突變。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR是由α鏈可變域和β鏈可變域組成的單鏈TCR，所述 α鏈可變域和β鏈可變域由一柔性短肽序列（linker)連接。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的疏水芯突變發(fā)生在SEQ ID N0:75所示α鏈可變域 的選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)：13Ι、19Α、21Μ和79S ;其中，氨基酸殘基編號(hào)采 用SEQ ID Ν0:75所示的編號(hào)；和/或
[0040] 所述疏水芯突變發(fā)生在SEQ ID N0:76所示β鏈可變域的選自下組的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸殘基位點(diǎn)：11Ε、13Τ和82S，其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID Ν0:76所示的編號(hào)。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，疏水芯突變后的所述TCR的α鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或 多個(gè)氨基酸殘基：13V、19V、21I和79V，其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID Ν0:75所示的編 號(hào)；和/或
[0042] 疏水芯突變后的所述TCR的β鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基： 11L、13V和82V;其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID Ν0:76所示的編號(hào)。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:l、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89 ;和 / 或
[0044] 所述TCR 的 β 鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、30、31、33。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包括下表所示的α和β鏈可變域組合：
[0046]

[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，與所述T細(xì)胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測標(biāo)記物、治療劑、PK修 飾部分或任何這些物質(zhì)的組合。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，與所述T細(xì)胞受體結(jié)合的治療劑為連接于所述TCR的α或β 鏈的C-或Ν-末端的抗-CD3抗體。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述與抗-CD3抗體結(jié)合的TCR的α鏈可變域氨基酸序列選自： SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、29、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、89、90 ;和 / 或
[0052] 所述與抗-⑶3抗體結(jié)合的TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述TCRβ鏈與抗-⑶3抗體結(jié)合后的氨基酸序列選自下組SEQ ID Ν0:100 和 101。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR與抗-⑶3抗體結(jié)合后的氨基酸序列選自下組：SEQ ID N0:92、93、94、95、96、97、98 和 99。
[0055] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種多價(jià)TCR復(fù)合物，包含至少兩個(gè)TCR分子，并且其 中的至少一個(gè)TCR分子為本發(fā)明第一方面所述的TCR。
[0056] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方 面所述的TCR分子或者本發(fā)明第二方面所述的多價(jià)TCR復(fù)合物的核酸序列或其互補(bǔ)序列；
[0057] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的所 述的核酸分子。
[0058] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明第四方 面所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第三方面所述的核酸分子。
[0059] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種分離的細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第一方面所述 的 TCR。
[0060] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載 體以及本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方 面所述的細(xì)胞。
[0061] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適 量的本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方面 所述的細(xì)胞、或本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物。
[0062] 本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的TCR、或本發(fā)明第二方面所述的 TCR復(fù)合物、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤的藥物。
[0063] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的T細(xì)胞受體的方法， 包括步驟：
[0064] (i)培養(yǎng)本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)本發(fā)明第一方面所述的T細(xì) 胞受體；
[0065] (ii)分離或純化出所述的T細(xì)胞受體。
[0066] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0067] 圖la-圖lu分別顯示了對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物具有高親和力的單鏈TCR的 α鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以黑體加下劃線表示。
[0068] 圖2a_圖2q分別顯示了對SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物具有高親和力的單鏈TCR的 β鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以黑體加下劃線表示。
[0069] 圖3a-圖3u分別顯示了對SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物具有高親和力的α β異質(zhì) 二聚TCR的α鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以黑體加下劃線表示。
[0070] 圖4a-圖4q分別顯示了對SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物具有高親和力的α β異質(zhì) 二聚TCR的β鏈可變域氨基酸序列，突變的殘基以黑體加下劃線表示。
[0071] 圖5a和圖5b分別顯示了對SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物能夠特異性結(jié)合的野生型 TCRa與β鏈可變域氨基酸序列。
[0072] 圖6a和圖6b分別顯示了對SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物能夠特異性結(jié)合的野生型 TCRa與β鏈的胞外氨基酸序列。
[0073] 圖7a和圖7b分別顯示了參比TCRa與β鏈的胞外氨基酸序列。
[0074] 圖8a和圖8b分別顯示了單鏈模板TCR α鏈與β鏈可變域氨基酸序列。
[0075] 圖9a和圖9b分別顯示了單鏈模板TCR α鏈與β鏈可變域DNA序列。
[0076] 圖10a和圖10b分別顯示了分別顯示了柔性連接短肽（linker)的氨基酸序列和 DNA序列。
[0077] 圖11a和圖lib分別顯示了作為模板鏈的穩(wěn)定性單鏈TCR分子的氨基酸序列和 DNA序列。
[0078] 圖12顯示了參比TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的Biacore相互作用曲線。
[0079] 圖13a和13b分別顯示了在單鏈TCR分子（α鏈可變域SEQ ID N0:2和β鏈可 變域SEQ ID NO :27)Ν和C端與抗-⑶3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
[0080] 圖14a和14b分別顯示了在單鏈TCR分子（α鏈可變域SEQ ID NO: 1和β鏈可 變域SEQ ID NO :30)Ν和C端與抗-⑶3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
[0081] 圖15a和15b分別顯示了在單鏈TCR分子（α鏈可變域SEQ ID N0:89和β鏈可 變域SEQ ID NO :26)Ν和C端與抗-⑶3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
[0082] 圖16a和16b分別顯示了在單鏈TCR分子（α鏈可變域SEQ ID N0:89和β鏈可 變域SEQ ID NO :27)Ν和C端與抗-⑶3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
[0083] 圖17顯示了抗-⑶3的scFv與α β異質(zhì)二聚TCR的β鏈（其可變域氨基酸序 列為SEQ ID Ν0:69)融合的融合分子的氨基酸序列。
[0084] 圖18顯示了抗-⑶3的scFv與α β異質(zhì)二聚TCR的β鏈（其可變域氨基酸序 列為SEQ ID Ν0:70)融合的融合分子的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0085] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種識(shí)別SLLMffITQC短肽（衍生自 NY-ES0-1蛋白）的高親和性Τ細(xì)胞受體（TCR)，所述SLLMWITQC短肽以肽-HLA Α2復(fù)合物 的形式被呈遞。相對于能夠識(shí)別SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的野生型TCR，本發(fā)明TCR在其 α鏈可變域和/或β鏈可變域發(fā)生突變，并且本發(fā)明TCR對上述SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合 物的親和力和/或結(jié)合半衰期是野生型TCR的至少兩倍。
[0086] 術(shù)語
[0087] T 細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR)
[0088] 可以采用國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)aMGT)來描述TCR。天然α β異源二聚TCR 具有α鏈和β鏈。廣義上講，各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和 連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。通過獨(dú)特的IMGT的TRAJ 和TRBJ確定TCR的連接區(qū)，通過頂GT的TRAC和TRBC確定TCR的恒定區(qū)。
[0089] 各可變區(qū)包含嵌合在框架序列中的3個(gè)⑶R(互補(bǔ)決定區(qū)），其中一個(gè)是⑶R3,由 可變區(qū)和連接區(qū)重組而成，被稱為超變區(qū)。根據(jù)框架、CDR1和CDR2序列以及部分確定的 ⑶R3序列，α鏈可變區(qū)（Va)可分成幾類，β鏈可變區(qū)（νβ)也分成幾類。在頂GT命名 法中，TRAV和TRBV的不同編號(hào)分別指代不同Va類型和νβ的類型。在頂GT系統(tǒng)中，α 鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號(hào)：TRAC*01，其中"TR"表示Τ細(xì)胞受體基因；"Α"表示α鏈基 因；C表示恒定區(qū)；"*01"表示等位基因1。β鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號(hào)：TRBC1*01或 TRBC2*01，其中"TR"表示T細(xì)胞受體基因；"B"表示β鏈基因；C表示恒定區(qū)；"*01"表示 等位基因1。在β鏈的形式中，存在兩個(gè)可能的恒定區(qū)基因"C1"和"C2"。
[0090] TCR的α和β鏈一般看作各有兩個(gè)"結(jié)構(gòu)域"即可變域和恒定域?？勺冇蛴蛇B接 的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。因此，在本申請的說明書和權(quán)利要求書中，"TCRa鏈可變域"指連 接的TRAV和TRAJ區(qū)，"TCR α鏈恒定域"指胞外TCR α鏈恒定區(qū)或C-末端截短的TCR α鏈 恒定區(qū)。同樣地，" TCR β鏈可變域"指連接的TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)，" TCR β鏈恒定域"指 胞外TCRi3鏈恒定區(qū)或C-末端截短的TCRi3鏈恒定區(qū)。
[0091] 對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物能夠特異性結(jié)合的野生型TCR(本發(fā)明中簡稱為"野 生型TCR"）的α與β鏈可變區(qū)在頂GT中具有下列編號(hào)：
[0092] α 鏈：TRAV17
[0093] β 鏈：TRBV12-4
[0094] 野生型TCR的α與β鏈可變域氨基酸序列（SEQIDN0:75和SEQIDN0 :76)如 圖5所示，其α與β鏈胞外氨基酸序列（SEQ ID Ν0:77和SEQ ID Ν0:78)如圖6所示。
[0095] 發(fā)明詳述
[0096] 本發(fā)明提供具有結(jié)合SLLMWITQC (SEQ ID NO :91) HLA-A2復(fù)合物特性的包含TCR a 可變域和/或TCR β可變域的T細(xì)胞受體（TCR)，相對于具有α鏈和β鏈可變域氨基酸序 列SEQIDN0:75和SEQIDN0:76的TCR，其特征在于，（i)所述TCR在SEQIDN0:75所 示其α鏈可變域氨基酸和/或在SEQ ID Ν0:76所示其β鏈可變域氨基酸中發(fā)生突變；和 (? )所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的親和力是野生型TCR對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的親和力的至少兩倍。其中，在上述（i )中α鏈可變域和/或β鏈可變域氨 基酸殘基中的突變發(fā)生在α和/或β可變域的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)中，所述突 變能夠使本發(fā)明TCR與SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物之間的相互作用力更高和/或解離速率 更慢。
[0097] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的T細(xì)胞受體（TCR)，相對于具有 α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID N0:75和β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID N0:76的TCR:
[0098] ( i )所述TCR在SEQ ID NO :75所示其α鏈可變域氨基酸和/或在SEQ ID NO :76 所示其β鏈可變域氨基酸中發(fā)生突變；和
[0099] ( ii )所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對 SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少兩倍。
[0100] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的定點(diǎn)突變的方法，將野生型TCR的胞外α鏈恒定區(qū) 的157T(即，頂GT中TRAC的48T)突變?yōu)?57C，β鏈恒定區(qū)的169S(即，頂GT中TRBC1 的57S)突變?yōu)?69C，即得到參比TCR，其氨基酸序列分別如圖7a和7b所示，突變后的半 胱氨酸殘基以加粗字母表示。上述半胱氨酸取代能使參比TCR的α與β鏈的恒定區(qū)之 間形成人工鏈間二硫鍵，以形成更加穩(wěn)定的可溶性TCR，從而能夠更加方便地評估TCR與 SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期。應(yīng)理解，TCR可變區(qū)的 CDR區(qū)決定了其與pMHC復(fù)合物之間的親和力，因此，上述TCR恒定區(qū)的半胱氨酸取代并不 會(huì)對TCR的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期產(chǎn)生影響。所以，本發(fā)明中測得的參比TCR與 SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力即為野生型TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物 之間的結(jié)合親和力。同樣地，如果測得本發(fā)明TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合 親和力是參比TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力的至少兩倍，即等同于本 發(fā)明TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力是野生型TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力的至少兩倍。
[0101] 可通過任何合適的方法測定結(jié)合親和力（與解離平衡常數(shù)KD成反比）和結(jié)合半衰 期（表示為T 1/2)。應(yīng)了解，TCR的親和力翻倍將導(dǎo)致KD減半。T1/2計(jì)算為In2除以解離速 率0U)。因此，T 1/2翻倍會(huì)導(dǎo)致K#減半。優(yōu)選采用相同的試驗(yàn)方案檢測給定TCR的結(jié)合 親和力或結(jié)合半衰期數(shù)次，例如3次或更多，取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用 本文實(shí)施例中的表面等離振子共振（BIAcore)方法進(jìn)行這些檢測。該方法檢測到參比TCR 對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD為6. 4 μ M，即野生型TCR對SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD也為6. 4 μ Μ。
[0102] 可采用任何合適的方法進(jìn)行突變，包括但不限于依據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的 那些、依據(jù)限制性酶的克隆或不依賴連接的克?。↙IC)方法。許多標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教材 詳述了這些方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)誘變和依據(jù)限制性酶的克隆的更多細(xì)節(jié)可參見 Sambrook 和 Russel 1，（2001)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版）CSHL出版社。LIC方法的更多信息可見（Rashtchian, (1995)Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6)。
[0103] 產(chǎn)生本發(fā)明的TCR的方法可以是但不限于從展示此類TCR的噬菌體顆粒的多樣性 文庫中篩選出對SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物具有高親和性的TCR，如文獻(xiàn)（Li，et al (2005) Nature Biotech 23(3):349-354)中所述。
[0104] 應(yīng)理解，表達(dá)野生型TCRa和β鏈可變域氨基酸的基因或者表達(dá)略作修飾的野生 型TCR的a和β鏈可變域氨基酸的基因都可用來制備模板TCR。然后在編碼該模板TCR 的可變域的DNA中引入產(chǎn)生本發(fā)明的高親和力TCR所需的改變。
[0105] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明TCR在SEQ ID Ν0:75所示的a鏈可變 域氨基酸殘基 27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S 和 98T 中有一 個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變（采用SEQ ID N0:75所示的編號(hào)）和/或在SEQ ID N0:76所示的β 鏈可變域氨基酸殘基 5(^、5謂、52153￥、54?、951\976、984、990、100?、1010和102!1中有一 個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變（采用SEQ ID Ν0:76所示的編號(hào)）。例如，突變后的TCRa鏈可變域包 括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基：27Y、27W、27H、27F或27N ;28T、28Y、28D、28P、28N或 28W ;29P、29L、29T、29V 或 29A ;30Q ;51N ;53S ;54Q ;55T ;91N ;94T、94N、94H、94I 或 94S ;95A 或95S ;96R或96W ;97W ;98N、98D或98A ;和/或突變后的TCR0鏈可變域包括選自下組的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基：50C 或 50Y ;51H或 51L ;52G ;53L ;54V 或 541 ;95S ;97N ;98G 或 98S ; 99N或99L;100A;101I;102V或1021。更具體地，a鏈可變域中所述突變的具體形式包括 T27Y/W/H/F/N、S28T/Y/D/P/N/W、I29P/L/T/V/A、N30Q、S51N、E53S、R54Q、E55T、T91N、A94T/ N/H/I/S、G95A/S、K96R/W、S97W或T98N/D/A中的一組或幾組；β鏈可變域中所述突變的具 體形式包括 N50C/Y、N51H/L、N52G、V53L、P54V/I、T95S、G97N、A98G/S、Q99N/L、Ρ100Α、Q1011 和H102V/I中的一組或幾組。
[0106] 本發(fā)明的高親和性TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID Ν0:38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、5〇、51、52、53、54、55、56、57、9〇之一和/或0鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID 吣:58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74之一。因此，含有野 生型TCR的α鏈可變域氨基酸序列（SEQ ID N0:75)的TCRa鏈可與包含SEQ ID N0:58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74之一的1'〇^鏈結(jié)合?；蛘?，含有野 生型TCR的β可變域氨基酸序列（SEQ ID NO:76)的TCRβ鏈可與包含SEQ ID NO: 38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90之一的1'〇?〇鏈結(jié)合。又 或者，包含 TCRa 鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID N0:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、90之一的TCR α鏈可與包含TCR β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID N0:58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74 之一的 TCR0 鏈結(jié)合。
[0107] 基于本發(fā)明的目的，本發(fā)明TCR是具有至少一個(gè)TCRa和/或TCRf3鏈可變域的 部分。它們通常同時(shí)包含TCRa鏈可變域和TCRi3鏈可變域。它們可以是α β異源二聚 體或是單鏈形式或是其他任何能夠穩(wěn)定存在的形式。在過繼性免疫治療中，可將α β異源 二聚TCR的全長鏈（包含胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明TCR可用作將治療劑遞送 至抗原呈遞細(xì)胞的靶向劑或與其他分子結(jié)合制備雙功能多肽來定向效應(yīng)細(xì)胞，此時(shí)TCR優(yōu) 選為可溶形式。
[0108] 對于穩(wěn)定性而言，一方面，本發(fā)明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間引 入人工二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫 鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點(diǎn)的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫 鍵。例如，取代TRAO01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57 的半胱氨酸殘基來形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點(diǎn)還可以是： TRAO01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77 ;TRAO01外顯子1的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Serl7 ;TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Asp59 ;TRAO01 外顯子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外 顯子 1 的 Glul5 ;TRAO01 外顯子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser54 ; TRAO01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Alal9 ;或TRAO01外顯子 1的TyrlO和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與 β鏈恒定域中任一組位點(diǎn)?？稍诒景l(fā)明TCR恒定域的一個(gè)或多個(gè)C末端截短最多15個(gè)、或 最多10個(gè)、或最多8個(gè)或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸殘基來達(dá)到缺失天然二硫 鍵的目的，也可通過將適宜的半胱氨酸殘基突變?yōu)榱硪话被醽磉_(dá)到上述目的。
[0109] 如上所述，本發(fā)明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工二 硫鍵。應(yīng)注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發(fā)明的TCR均可含有 TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2 恒定域序列可通過存在于TCR中的天然二硫鍵連接。
[0110] 對于穩(wěn)定性而言，另一方面，本發(fā)明TCR還包括在其疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR， 這些疏水芯區(qū)域的突變優(yōu)選為能夠使本發(fā)明TCR的穩(wěn)定性提高的突變，如在公開號(hào)為 TO2014/206304的專利文獻(xiàn)中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發(fā)生突變： (α和/或β鏈）可變區(qū)氨基酸第11，13，19,21，53,76,89,91，94位，和/或<1鏈1基因 (TRAJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第3, 5, 7位，和/或β鏈J基因（TRBJ)短肽氨基酸位置倒 數(shù)第2, 4,6位，其中氨基酸序列的位置編號(hào)按國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)aMGT)中列出的位 置編號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉上述國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)，并可根據(jù)該數(shù)據(jù)庫得到不同 TCR的氨基酸殘基在頂GT中的位置編號(hào)。
[0111] 本發(fā)明中疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的a與β 鏈的可變域而構(gòu)成的高穩(wěn)定性單鏈TCR。應(yīng)注意，本發(fā)明中柔性肽鏈可以是任何適合連接 TCRa與β鏈可變域的肽鏈。本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建的用于篩選高親和性TCR的模板鏈 即為上述含有疏水芯突變的單鏈TCR。該單鏈模板TCR的a鏈可變域氨基酸序列（SEQ ID N0:81)與β鏈可變域氨基酸序列（SEQ ID N0:82)如圖8所示，相應(yīng)的DNA序列（SEQ ID NO:83和84)如圖9所示。其柔性連接肽鏈（linker)的氨基酸序列（SEQ ID NO:85)和DNA 序列（SEQ ID N0:86)如圖10所示。以此篩選出對SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物具有高親和 性的由a鏈可變域和β鏈可變域構(gòu)成的單鏈TCR。
[0112] 本發(fā)明的對SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物具有高親和性的α β異質(zhì)二聚體的獲得是 通過將篩選出的高親和性單鏈TCR的⑶R區(qū)的突變引入到野生型TCRa與β鏈的相應(yīng)位 置而得到。
[0113] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，采用SEQ ID Ν0:75所示的編號(hào)，本發(fā)明TCR的a鏈可 變域疏水芯氨基酸殘基131 (即頂GT中列出的a鏈可變區(qū)第13位）、19A(即頂GT中列出 的a鏈可變區(qū)第19位）、21M(即IMGT中列出的a鏈可變區(qū)第21位）和79S(即IMGT中 列出的a鏈可變區(qū)第94位）中有一個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變和/或采用SEQ ID N0:76所示的編 號(hào)，所述TCRi3鏈可變域疏水芯氨基酸殘基11E(即頂GT中列出的β鏈可變區(qū)第11位）、 13T(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第13位）和82S(即IMGT中列出的β鏈可變區(qū)第94 位）中有一個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變。
[0114] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，采用SEQ ID Ν0:75所示的編號(hào)，本發(fā)明a鏈可變 域疏水芯包含氨基酸殘基13V、19V、21I或79V中的一個(gè)或多個(gè)和/或采用SEQ ID N0:76所 示的編號(hào)，所述TCRi3可變域疏水芯包含氨基酸殘基11L、13V或82V中的一個(gè)或多個(gè)。更 具體地，所述TCRa可變域疏水芯的突變形式包括I13V、A19V、M21I或S79V中的一組或幾 組；所述TCRP可變域疏水芯的突變形式包括E11L、T13V和S82V中的一組或幾組。
[0115] 本發(fā)明的高親和性TCR還包含a鏈可變域氨基酸序列SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89 之一和 / 或 β 鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33 之一。因此，上述高穩(wěn)定 性單鏈TCRa鏈可變域（SEQ ID N0:81)可與氨基酸序列為SEQ ID N0:15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31或33的TCR0鏈可變域結(jié)合。或者，上述高穩(wěn)定性 單鏈TCR0鏈可變域（SEQ ID N0:82)可與氨基酸序列為SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37 或 89 的 TCRa 可變域結(jié)合。又或者，TCRa 鏈可變域 SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、29、32、34、35、36、37 或 89 之一與 TCR0 鏈可變域 SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31 或 33 之一結(jié) 合。
[0116] 本發(fā)明的TCR也可以多價(jià)復(fù)合體的形式提供。本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體包含兩 個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明TCR相結(jié)合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結(jié)構(gòu)域來 產(chǎn)生四聚體，或多個(gè)本發(fā)明TCR與另一分子結(jié)合而形成的復(fù)合物。本發(fā)明的TCR復(fù)合物可 用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞，也可用于產(chǎn)生具有此類應(yīng)用的其他多價(jià) TCR復(fù)合物的中間體。
[0117] 本發(fā)明的TCR可以單獨(dú)使用，也可與偶聯(lián)物以共價(jià)或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共 價(jià)方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測標(biāo)記物（為診斷目的，其中所述TCR用于檢測呈遞 SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的細(xì)胞的存在）、治療劑、PK(蛋白激酶）修飾部分或任何以上這 些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。
[0118] 用于診斷目的的可檢測標(biāo)記物包括但不限于：焚光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、 MRI (磁共振成像）或CT (電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù)）造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn) 物的酶。
[0119] 可與本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素（Koppe等， 2005，癌轉(zhuǎn)移評論（Cancer metastasis reviews) 24, 539) ;2·生物毒（Chaudhary 等， 1989,自然（Nature) 339, 394 ;Epel 等，2002,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy) 51，565) ;3·細(xì)胞因子如 IL-2 等（Gillies 等，1992,美國國家科學(xué) 院院刊（PNAS)89,1428 ;Card 等，2004,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy)53,345;Halin 等，2003,癌癥研究（Cancer Research)63,3202) ;4·抗體 Fc 片段（Mosquera 等，2005,免疫學(xué)雜志（The Journal Of Immunology) 174,4381) ;5·抗 體 scFv 片段（Zhu 等，1995,癌癥國際期刊（International Journal of Cancer)62, 319); 6.金納米顆粒 / 納米棒（Lapotko 等，2005,癌癥通信（Cancer letters) 239, 36 ;Huang 等， 2006,美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志（Journal of the American Chemical Society) 128,2115) ;7·病 毒顆粒（Peng 等，2004,基因治療（Gene therapy) 11，1234) ;8·脂質(zhì)體（Mamot 等，2005,癌 癥研究（Cancer research)65，11631) ;9.納米磁粒；10.前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶 (DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)（BPHL)) ;11.化療劑（例如，順鉑）或任何形式的納米 顆粒等。
[0120] 與本發(fā)明TCR結(jié)合的抗體或其片段包括抗-T細(xì)胞或NK-細(xì)胞決定抗體，如抗-CD3 或抗-CD28或抗-CD16抗體，上述抗體或其片段與TCR的結(jié)合能夠?qū)π?yīng)細(xì)胞進(jìn)行定向來 更好地革向革細(xì)胞。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是本發(fā)明TCR與抗-CD3抗體或所述抗-CD3抗體 的功能片段或變體結(jié)合。具體地，本發(fā)明的TCR-抗CD3單鏈抗體融合體包括選自下組的 TCRa 鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、29、32、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、89、90 和 選自下組的 TCR0 鏈可變域氨基酸序列 SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、30、31、33、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。更具體 地，本發(fā)明TCR與抗-CD3單鏈抗體融合體的氨基酸序列可以選自下列氨基酸序列之一 SEQ ID勵(lì):92、93、94、95、96、97、98和99。更具體地，本發(fā)明1'0^鏈與抗-〇)3單鏈抗體融合 體的氨基酸序列可選自下列氨基酸序列之一 ：100和101。
[0121] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明TCR的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是DNA形式或 RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。例如，編碼本發(fā)明TCR的核酸序列可以與本發(fā)明 附圖中所示的核酸序列相同或是簡并的變異體。舉例說明"簡并的變異體"的含義，如本文 所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:81的蛋白序列，但與SEQ ID N0:83的序列有差別的核酸序列。
[0122] 本發(fā)明的核酸分子全長序列或其片段通?？梢杂玫幌抻赑CR擴(kuò)增法、重組法或 人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明TCR(或其片 段，或其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA 分子（或如載體）和細(xì)胞中。
[0123] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體，以及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng) 基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
[0124] 本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明TCR的分離細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。有許多方法適合于 用編碼本發(fā)明的高親和力TCR的DNA或RNA進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)染（如，Robbins等·，（2008) J. Immunol. 180:6116-6131)。表達(dá)本發(fā)明高親和性TCR的T細(xì)胞可以用于過繼免疫治療。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉進(jìn)行過繼性治療的許多合適方法（如，Rosenberg等.，（2008)Nat Rev Cancer8 (4) :299-308)。
[0125] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本 發(fā)明TCR、或本發(fā)明TCR復(fù)合物、或呈遞本發(fā)明TCR的細(xì)胞。
[0126] 本發(fā)明還提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明 TCR、或本發(fā)明TCR復(fù)合物、或呈遞本發(fā)明TCR的細(xì)胞、或本發(fā)明的藥物組合物。
[0127] 應(yīng)理解，本文中氨基酸名稱采用國際通用的單英文字母標(biāo)識(shí)，與其相對應(yīng)的氨基 酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gin (Q)、Glu (E)、 Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、 Tyr⑴、Val (V);另外，本發(fā)明中所述突變的具體形式的表述方式如"N30Q"代表第30位的 N被Q取代，同理，"T27Y/W/H/F/N"代表第27位的T被Y取代或被W取代或被Η取代或被 F取代或被Ν取代。其他以此類推。
[0128] 在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功 能。在C末端和/或Ν末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。 因此，本發(fā)明TCR還包括本發(fā)明TCR的至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)，最佳地 1個(gè)氨基酸（尤其是位于CDR區(qū)之外的氨基酸），被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換，并仍 能夠保持其功能性的TCR。
[0129] 本發(fā)明還包括對本發(fā)明TCR略作修飾后的TCR。修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形 式包括：本發(fā)明TCR的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在本發(fā) 明TCR的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的TCR。這種修飾可以 通過將TCR暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾 形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還 包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的TCR。
[0130] 本發(fā)明的TCR、TCR復(fù)合物或本發(fā)明TCR轉(zhuǎn)染的Τ細(xì)胞可與藥學(xué)上可接受的載體一 起在藥物組合物中提供。本發(fā)明的TCR、多價(jià)TCR復(fù)合物或細(xì)胞通常作為無菌藥物組合物的 一部分提供，所述組合物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的 形式（取決于給予患者的所需方法）。其可采用單位劑型提供，通常在密封的容器中提供， 可作為試劑盒的一部分提供。此類試劑盒（但非必需）包括使用說明書。其可包括多個(gè)所 述單位劑型。
[0131] 此外，本發(fā)明的TCR可以單用，也可與其他治療劑結(jié)合或偶聯(lián)在一起使用（如配制 在同一藥物組合物中）。
[0132] 藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治 療劑給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè) 體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在 雷明頓藥物科學(xué)（Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991))中 可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖 液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。
[0133] 治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外， 這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。
[0134] 通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前 適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。
[0135] 一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：眼內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥，優(yōu)選為胃腸外包括皮下、肌肉內(nèi)或靜脈 內(nèi)。待預(yù)防或治療的對象可以是動(dòng)物；尤其是人。
[0136] 當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型 的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有針劑、口服劑等。
[0137] 這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過混合、稀釋或溶解而進(jìn)行配制，并且偶 爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑 (isotonicities)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過程可根 據(jù)劑型用慣常方式進(jìn)行。
[0138] 本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，本發(fā)明TCR可被摻入以緩 釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過手術(shù)植入待治療的組織。作 為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯 (polyhydrometaacrylate)、聚丙稀酰胺、聚乙稀吡略燒酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳 酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇 酸共聚物。
[0139] 當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，作為活性成分的本發(fā)明TCR或TCR復(fù) 合物或呈遞本發(fā)明TCR的細(xì)胞，可根據(jù)待治療的每個(gè)病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而 合理地加以確定，最終由醫(yī)師決定合理的用量。
[0140] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0141] (1)本發(fā)明以疏水芯突變的單鏈TCR分子為模板篩選出了對所述 SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物具有高親和力的TCR，同時(shí)具有抗原特異性和細(xì)胞殺傷效力。
[0142] (2)本發(fā)明的TCR對所述SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的親和力和/或結(jié)合半衰期是 野生型TCR的至少兩倍。
[0143] (3)本發(fā)明的高親和力的TCR對所述SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的親和力和/或結(jié) 合半衰期可以達(dá)到野生型TCR的102-105倍以上。
[0144] 下面的具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常 規(guī)條件，例如（Sambrook和Russell等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版）（2001) CSHL出版社）中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0145] 材料和方法
[0146] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明均可從市售渠道獲得，其中， E. coli DH5a 購自 Tiangen、E. coli BL21(DE3)購自 Tiangen、E. coli Tuner(DE3)購自 Novagen、質(zhì)粒 pET28a 購自 Novagen。
[0147] 實(shí)施例1疏水芯突變的穩(wěn)定性單鏈TCR模板鏈的產(chǎn)生
[0148] 本發(fā)明人利用定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建了以一個(gè)柔性短肽（linker)連接TCRa與β 鏈可變域而構(gòu)成的穩(wěn)定性單鏈TCR分子（參見專利文獻(xiàn)W02014/206304)，其氨基酸及DNA 序列分別為SEQ ID N0:87和SEQ ID N0:88,如圖11所示。并以該單鏈TCR分子為模板進(jìn) 行高親和性TCR分子的篩選。該模板鏈的a可變域（SEQ ID N0:81)及β可變域（SEQ ID N0:82)的氨基酸序列如圖8所示；其對應(yīng)的DNA序列分別為SEQ ID N0:83和84,如圖9所 示；柔性短肽（linker)的氨基酸序列及DNA序列分別為SEQ ID N0:85和86,如圖10所示。
[0149] 將攜帶模板鏈的目的基因經(jīng)Nco I和Not I雙酶切，與經(jīng)過Nco I和Not I雙酶 切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a，涂布含卡那霉素的LB平板，37°C倒 置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR篩選，對陽性重組子進(jìn)行測序，確定序列正確后抽提重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)，用于表達(dá)。
[0150] 實(shí)施例2實(shí)施例1中構(gòu)建的穩(wěn)定性單鏈TCR的表達(dá)、復(fù)性和純化
[0151] 將實(shí)施例1中制備的含有重組質(zhì)粒pET28a-模板鏈的BL21 (DE 3)菌落全部接種 于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8，加入IPTG至終濃度為0. 5mM， 37°C繼續(xù)培養(yǎng) 4h。5000rpm 離心 15min 收獲細(xì)胞沉淀物，用 Bugbuster Master Mix(Merck) 裂解細(xì)胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進(jìn)行洗滌以除 去細(xì)胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min，收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖液（20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素）中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進(jìn)行分裝， 于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0152] 向5mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2. 5mL緩沖液（6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，lOOmM NaCl，10mM EDTA)，再加入 DTT 至終濃度為 10mM，37°C處理 30min。 用注射器向125mL復(fù)性緩沖液（lOOmM Tris-HCl pH 8. 1，0. 4M L-精氨酸，5M尿素，2mM ED ΤΑ, 6· 5πιΜβ -mercapthoethylamine, 1. 87mM Cystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4°C 攪拌l〇min，然后將復(fù)性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋，透析袋置于1L預(yù)冷的 水中，4°C緩慢攪拌過夜。17小時(shí)后，將透析液換成1L預(yù)冷的緩沖液（20mM Tris-HCl pH 8. 0)，4°C繼續(xù)透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續(xù)透析過夜。17小時(shí)后，樣 品經(jīng)0. 45μηι濾膜過濾，真空脫氣后通過陰離子交換柱（HiTrap QHP，GE Healthcare)，用 20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進(jìn)行 SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進(jìn)一步用凝膠過濾柱（Superdex 7510/300, GE Healthcare)進(jìn)行純化，目標(biāo)組分也進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0153] 用于BIAcore分析的洗脫組分進(jìn)一步采用凝膠過濾法測試其純度。條件為：色譜 柱 Agi lent Bio SEC-3(300A，(i)7. 8X300mm)，流動(dòng)相為 150mM 磷酸鹽緩沖液，流速 0. 5mL/ min，柱溫25°C，紫外檢測波長214nm〇
[0154] 實(shí)施例3結(jié)合表征
[0155] BIAcore 分析
[0156] 使用BIAcore T200實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測TCR分子與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的 結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體（GenScript)加入偶聯(lián)緩沖液（10mM醋酸鈉緩沖液，pH 4. 77)，然后將抗體流過預(yù)先用EDC和NHS活化過的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后 用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應(yīng)的活化表面，完成偶聯(lián)過程，偶聯(lián)水平約為15,000RU。
[0157] 使低濃度的鏈霉親和素流過已包被抗體的芯片表面，然后將SLLMWITQC-HLA-A2 復(fù)合物流過檢測通道，另一通道作為參比通道，再將0. 05mM的生物素以10 μ L/min的流速 流過芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點(diǎn)。采用單循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析方法測定其親和 力，將 TCR 用 HEPES-EP 緩沖液（10mM HEPES, 150mM NaCl，3mM EDTA, 0· 005% P20, pH 7. 4) 稀釋成幾個(gè)不同的濃度，以30 μ L/min的流速，依次流過芯片表面，每次進(jìn)樣的結(jié)合時(shí)間為 120s，最后一次進(jìn)樣結(jié)束后讓其解離600s。每一輪測定結(jié)束后用pH 1.75的10mM Gly-HCl 再生芯片。利用BIAcore Evaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0158] 上述SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的制備過程如下：
[0159] a.純化
[0160] 收集100ml誘導(dǎo)表達(dá)重鏈或輕鏈的E. coli菌液，于4°C8000g離心10min后用10ml PBS 洗滌菌體一次，之后用 5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents (Merck)劇烈 震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4°C，6000g離心15min，棄去上清，收集包 涵體。
[0161] 將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min ;加 30ml稀釋10倍的BugBuster，混勾，4°C 6000g離心15min ;棄去上清，加30ml稀釋10倍的 BugBuster 重懸包涵體，混勾，4°C 6000g 離心 15min，重復(fù)兩次，加 30ml 20mM Tris-HCl pH 8. 0重懸包涵體，混勻，4°C 6000g離心15min，最后用20mM Tri s-HCl 8M尿素溶解包涵體， SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA試劑盒測濃度。
[0162] b.復(fù)性
[0163] 將合成的短肽SLLMWITQC (北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）溶解于DMS0至20mg/ ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8. 0、10mM DTT來溶解，復(fù)性前 加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進(jìn)一步變性。將SLLMWITQC肽以25mg/L (終濃度） 加入復(fù)性緩沖液（〇. 4ML-精氨酸、100mM Tris pH 8. 3、2mM EDTA、0. 5mM氧化性谷胱甘肽、 5mM還原型谷胱甘肽、0. 2mM PMSF，冷卻至4°C )，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的 重鏈（終濃度，重鏈分三次加入，8h/次），復(fù)性在4°C進(jìn)行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測 能否復(fù)性成功。
[0164] c.復(fù)性后純化
[0165] 用10體積的20mM Tris pH 8. 0作透析來更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次 來充分降低溶液的離子強(qiáng)度。透析后用〇. 45 μ m醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，然后加 載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司）陰離子交換柱上（5ml床體積）。利用Akta純化儀 (GE通用電氣公司），20mM Tris pH 8. 0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC 約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。
[0166] d.生物素化
[0167] 用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時(shí)將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0,然后加入生物素化試劑 0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM Mg0Ac、50yM D-Biotin、100 μ g/ml BirA酶（GST-BirA)，室溫孵育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化 是否完全。
[0168] e.純化生物素化后的復(fù)合物
[0169] 用Millipore超濾管將生物素化標(biāo)記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過濾 層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀（GE通用電氣公司），用過濾過的PBS預(yù)平衡 HiPr^)? 16/60S200HR柱（GE通用電氣公司），加載lml濃縮過的生物素化pMHC分子，然后 用PBS以lml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時(shí)作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并 含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法（Thermo)測定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白 酶抑制劑cocktail (Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80°C。
[0170] 實(shí)施例4高親和性單鏈TCR的產(chǎn)生
[0171] 噬菌體展示技術(shù)是產(chǎn)生TCR高親和力變體文庫以篩選高親和力變體的一種手段。 將Li等（(2005) Nature Biotech 23(3):349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法應(yīng)用 于實(shí)施例1中的單鏈TCR模板。通過突變該模板鏈的CDR區(qū)來建立高親和性TCR的文庫并 進(jìn)行淘選。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀上述文獻(xiàn)可以獲得所述建庫及篩選方法。即通過使用 具有所需的一個(gè)或多個(gè)密碼子變化的引物和作為模板的含相關(guān)DNA的質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過幾 輪淘選后的噬菌體文庫均和相應(yīng)抗原有特異性結(jié)合，從中挑取單克隆，并進(jìn)行序列分析。
[0172] 采用實(shí)施例3中BIAcore方法分析TCR分子與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的相互作 用，篩選出了親和力和/或結(jié)合半衰期是野生型TCR的至少兩倍的高親和性TCR，即篩選出 的高親和性TCR結(jié)合SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù)K D小于等于野生型TCR結(jié) 合SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的解離平衡常數(shù)KD的二分之一，結(jié)果如下表1所示。利用上述 方法檢測到參比TCR與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物相互作用的K D值為6. 4 μ M，其相互作用曲 線如圖12所示，即野生型TCR與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物相互作用的KD值也為6. 4 μ Μ。
[0173] 具體地，采用SEQ ID NO:75中所示的編號(hào)，這些高親和力TCR突變體的α鏈可 變域在下列一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、 94A、95G、96K、97S、98T和/或采用SEQIDN0 :76中所示的編號(hào)，這些高親和力TCR突變體 的β鏈可變域在下列一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變50N、51N、52N、53V、54P、95T、97G、 98A、99Q、100P、101Q、102H。
[0174] 更具體地，采用SEQ ID NO: 75中所示的編號(hào)，這些高親和力TCR的α鏈可變域包 含選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基27Y、27W、27H、27FS27N;28T、28Y、28D、28P、28NS 28W ;29P、29L、29T、29V 或 29A ;30Q ;51N ;53S ;54Q ;55T ;91N ;94T、94N、94H、94I 或 94S ;95A 或95S ;96R或96W;97W;98N、98D或98A;和/或采用SEQ ID N0:76中所示的編號(hào)，這些高 親和力TCR的β鏈可變域包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基50C或50Y;51H或51L; 52G ;53L ;54V 或 541 ;95S ;97N ;98G 或 98S ;99N 或 99L ;100A ;101I ;102V 或 1021。
[0175] 高親和性單鏈TCR的 α 鏈可變域（SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、 14、29、32、34、35、36、37、89)和 β 鏈可變域（SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、30、31、33)的氨基酸序列的具體例子分別如圖la-u和圖2a_q所示。
[0176] 表 1

[0179] 實(shí)施例5高親和性α β異質(zhì)二聚TCR的產(chǎn)生
[0180] 將實(shí)施例4中篩選到的高親和力的單鏈TCR的⑶R區(qū)突變引入到野生型TCR的可 變域的相應(yīng)位點(diǎn)中，并通過BIAcore來檢測其與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的親和力。上 述CDR區(qū)高親和力突變點(diǎn)的引入采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的定點(diǎn)突變的方法。上述野生型 TCR的α鏈與β鏈胞外氨基酸序列分別如圖6a(SEQ ID N0:77)和6b(SEQ ID N0:78)所 示，不含為在細(xì)菌中有效啟動(dòng)表達(dá)而引入的前導(dǎo)甲硫氨酸。應(yīng)注意，為獲得更加穩(wěn)定的可溶 性TCR，以便更方便地評估TCR與SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物之間的結(jié)合親和力和/或結(jié)合 半衰期，本發(fā)明在上述野生型TCR的α和β鏈的恒定區(qū)中分別引入了一個(gè)半胱氨酸殘基 以形成人工鏈間二硫鍵。引入半胱氨酸殘基后的胞外TCRa與β鏈的氨基酸序列分別如 圖7a(SEQ ID Ν0:79)和7b所示（SEQ ID Ν0:80)，引入的半胱氨酸殘基以加粗字母表示。
[0181] 通過《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》（Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三 版，Sambrook和Russell)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將待表達(dá)的TCRa和β鏈的胞外序列基因經(jīng) 合成后分別插入到表達(dá)載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點(diǎn)分別是Ncol和Notl。 ⑶R區(qū)的突變通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重疊 PCR(overlap PCR)引入。插入片段經(jīng)過測序 確認(rèn)無誤。
[0182] 實(shí)施例6 α β異質(zhì)二聚TCR的表達(dá)、復(fù)性和純化
[0183] 將TCR α和β鏈的表達(dá)載體分別通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)細(xì)菌BL21 (DE3)， 細(xì)菌用LB培養(yǎng)液生長，于0D6QQ= 0. 6時(shí)用終濃度0. 5mM IPTG誘導(dǎo)，TCR的α和β鏈表 達(dá)后形成的包涵體通過BugBuster Mix(Novagene)進(jìn)行提取，并且經(jīng)BugBuster溶液反 復(fù)多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍，10mM二硫蘇糖醇（DTT)，10mM乙二胺四乙酸 (EDTA)，20mM Tris(pH 8. 1)中。
[0184] 溶解后的TCR α和β鏈以1 :1的質(zhì)量比快速混合于5M尿素，0. 4M精氨酸，20mM Tris(pH 8. 1)，3. 7mM cystamine，6· 6πιΜβ-mercapoethylamineGO )中，終濃度為 60mg/ mL。混合后將溶液置于10倍體積的去離子水中透析（4°C )，12小時(shí)后將去離子水換成緩沖 液（20mM Tris，pH 8. 0)繼續(xù)于4°C透析12小時(shí)。透析完成后的溶液經(jīng)0. 45 μ Μ的濾膜過 濾后，通過陰離子交換柱（HiTrap Q HP，5ml，GE Healthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性成功的 α和β二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認(rèn)。TCR隨后通過凝膠過濾層析（HiPrep 16/60， Sephacryl S_100HR，GE Healthcare)進(jìn)一步純化。純化后的 TCR 純度經(jīng)過 SDS-PAGE 測定 大于90 %，濃度由BCA法確定。
[0185] 實(shí)施例7 BIAcore分析結(jié)果
[0186] 采用實(shí)施例3中所述方法檢測引入高親和力突變點(diǎn)的α β異質(zhì)二聚TCR與 SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的親和力。
[0187] 將高親和性單鏈TCRa與β鏈中⑶R區(qū)的突變分別引入到SEQ ID Ν0:75和/或 SEQ ID Ν0:76的相應(yīng)位置，得到新的TCRa和β鏈可變域氨基酸序列，分別如圖3和圖4 所示。由于TCR分子的CDR區(qū)決定了其與相應(yīng)的pMHC復(fù)合物的親和力，所以本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠預(yù)料引入高親和力突變點(diǎn)的α β異質(zhì)二聚TCR也具有對SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物 的高親和力。選擇其中3組TCR，進(jìn)行驗(yàn)證。利用實(shí)施例5中所述方法構(gòu)建表達(dá)載體，利用 實(shí)施例6中所述方法對上述引入高親和力突變的α β異質(zhì)二聚TCR進(jìn)行表達(dá)、復(fù)性和純 化，然后利用BIAcore Τ200測定其與SLLMWITQC-HLA-A2復(fù)合物的親和力，如下表2所示。
[0188] 表 2
[0189]
[0190] 由上表2可知，引入⑶R區(qū)突變的α β異質(zhì)二聚TCR保持了對SLLMWITQC-HLA-A2 復(fù)合物的高親和力。
[0191] 實(shí)施例8抗-CD3抗體與高親和性單鏈TCR的融合體的表達(dá)、復(fù)性和純化
[0192] 我們選擇了幾種高親和性單鏈TCR分子與抗CD3抗體的單鏈抗體（scFv)進(jìn)行融 合，構(gòu)建了融合分子。選擇的高親和性單鏈TCR分子包括：（1)由α鏈可變域SEQ ID N0:2 和β鏈可變域SEQ ID NO :27而構(gòu)成的單鏈TCR分子，其與抗-⑶3的scFv在單鏈TCR分 子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分別如圖13a和13b所示。（2)由α鏈可變域 SEQ ID Ν0:1和β鏈可變域SEQ ID Ν0:30而構(gòu)成的單鏈TCR分子，其與抗-CD3的scFv在 TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分別如圖14a和14b所不。（3)由α鏈 可變域SEQ ID Ν0:89和β鏈可變域SEQ ID Ν0 :26而構(gòu)成的單鏈TCR分子，其與抗-⑶3 的scFv在單鏈TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分別如圖16a和16b所 示。（4)由α鏈可變域SEQIDN0 :89和β鏈可變域SEQIDN0:27而構(gòu)成的單鏈TCR分 子，其與抗-CD3的scFv在單鏈TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分別如 圖16a和16b所示。上述融合分子的氨基酸序列中含有為在細(xì)菌中有效表達(dá)而引入的前導(dǎo) 甲硫氨酸。融合分子的制備過程如下：
[0193] 融合蛋白的表達(dá)
[0194] 將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，涂布LB平板（卡那霉素50 μ g/ ml)置于37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑克隆接種至10ml LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素50μg/ml) 培養(yǎng)2-3h，按體積比1:100接種至1L LB培養(yǎng)基（卡那霉素50 μ g/ml)中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D6。。 為0. 5-0. 8,然后使用終濃度為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)4小時(shí)以后，以 6000rpm離心10min收獲細(xì)胞。PBS緩沖液洗滌菌體一次，并且分裝菌體，取相當(dāng)于200ml的 細(xì)菌培養(yǎng)物的菌體用5ml BugBuster Master Mix(Novagen)裂解細(xì)菌，以6000g離心15min 收集包涵體。然后進(jìn)行4次洗滌劑洗滌以去除細(xì)胞碎片和膜組分。然后，用緩沖液如PBS 洗滌包涵體以除去洗滌劑和鹽。最終，將包涵體用含8M尿素的Tris緩沖溶液溶解，并測定 包涵體濃度，將其分裝后置于_80°C冷凍保存。
[0195] 融合蛋白的重折疊
[0196] 從-80°C超低溫冰箱中取出約10mg包涵體解凍，加二硫蘇糖醇（DTT)至終濃度為 10mM，在37°C中溫育30min到1小時(shí)以確保二硫鍵完全打開。然后將包涵體樣品溶液分別 滴入200ml 4°C預(yù)冷重折疊緩沖液（100mM Tris pH8. l，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿 素，6· 5πιΜβ -mercapthoethylamine, 1. 87mM Cystamine)，4°C緩慢攬摔約 30 分鐘。復(fù)性溶 液用8倍體積預(yù)冷的H20透析16-20小時(shí)。再用8倍體積的10mM Tris pH 8. 0透析兩次， 4°C繼續(xù)透析約8小時(shí)，透析后樣品過濾后進(jìn)行以下純化。
[0197] 融合蛋白的第一步純化
[0198] 經(jīng)過透析的重折疊物（10mM Tris pH 8. 0中）使用P0R0S HQ/20陰離子交換層析 預(yù)裝柱（Applied Biosystems)，在 AKTA 純化儀（GE Healthcare)用 0-600mM NaCl 進(jìn)行梯 度洗脫。通過考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE分析各個(gè)組分，然后合并。
[0199] 融合蛋白的第二步純化
[0200] 將第一步純化合并的樣品溶液濃縮以供此步純化，利用在PBS緩沖液中預(yù)平衡的 Superdex 7510/300GL凝膠過濾層析預(yù)裝柱（GE Healthcare)純化融合蛋白，考馬斯亮藍(lán) 染色的SDS-PAGE分析出峰的組分，然后合并。
[0201] 實(shí)施例9抗-⑶3抗體與高親和性α β異質(zhì)二聚TCR的融合體的表達(dá)、復(fù)性和純 化
[0202] 將抗-⑶3的單鏈抗體（scFv)與α β異質(zhì)二聚TCR融合，制備融合分子?？?⑶3 的scFv與TCR的β鏈融合，該TCRi3鏈可以包含任一上述高親和性α β異質(zhì)二聚TCR的 β鏈可變域，本實(shí)施例選用SEQ ID Ν0:69和SEQ ID Ν0:70的高親和性TCR0鏈可變域。 融合分子的TCRa鏈可以包含任一上述高親和性α β異質(zhì)二聚TCR的α鏈可變域，本實(shí) 施例選用SEQ ID Ν0:39和SEQ ID Ν0:90所示的α鏈可變域。抗-CD3的scFv與TCR的 β鏈融合分子的氨基酸序列分別如17和18所示，氨基酸序列中含有為在細(xì)菌中有效表達(dá) 而引入的前導(dǎo)甲硫氨酸。
[0203] 融合分子表達(dá)載體的構(gòu)建
[0204] 1. α鏈表達(dá)載體的構(gòu)建
[0205] 將攜帶α β異質(zhì)二聚TCR的α鏈的目的基因經(jīng)Nco I和Not I雙酶切，與經(jīng)過 Nco I和Not I雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a，涂布于含卡那 霉素的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR篩選，對陽性重組子進(jìn)行測序， 確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Tuner (DE3),用于表達(dá)。
[0206] 2.抗-CD3(scFv)-f3鏈表達(dá)載體的構(gòu)建
[0207] 通過重疊（overlap)PCR的方法，設(shè)計(jì)引物將抗-CD3scFv和高親和性異質(zhì)二聚 TCRi3鏈基因連接起來，中間的連接短肽（linker)為GGGGS，并且使抗-⑶3的scFv與高親 和性異質(zhì)二聚TCRi3鏈的融合蛋白的基因片段帶上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Nco I (CCATGG)和 Not I (GCGGCCGC)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nco I和Not I雙酶切，與經(jīng)過Nco I和Not I雙 酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含卡那霉素的 LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR篩選，對陽性重組子進(jìn)行測序，確定序 列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli Tuner (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用于表達(dá)。
[0208] 融合蛋白的表達(dá)、復(fù)性及純化
[0209] 將表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli Tuner (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（卡那 霉素50 μ g/mL)置于37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑克隆接種至10mL LB液體培養(yǎng)基（卡那霉 素50 μ g/mL)培養(yǎng)2-3h，按體積比1:100接種至1L LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600為 0. 5-0. 8,加入終濃度為ImM IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)4小時(shí)以后，以6000rpm離心 10min收獲細(xì)胞。PBS緩沖液洗滌菌體一次，并且分裝菌體，取相當(dāng)于200mL的細(xì)菌培養(yǎng)物 的菌體用5mL BugBuster Master Mix (Merck)裂解細(xì)菌，以6000g離心15min收集包涵體。 然后進(jìn)行4次洗滌劑洗滌以去除細(xì)胞碎片和膜組分。然后，用緩沖液如PBS洗滌包涵體以 除去洗滌劑和鹽。最終，將包涵體用含6M鹽酸胍，10mM二硫蘇糖醇（DTT)，10mM乙二胺四 乙酸（EDTA)，20mM Tris，pH 8. 1緩沖溶液溶解，并測定包涵體濃度，將其分裝后置于-80°C 冷凍保存。
[0210] 溶解后的TCRa鏈和抗-⑶3(scFv)-f3鏈以2 :5的質(zhì)量比快速混合于5M尿素 (urea), 0· 4M L-精氨酸（L-arginine)，20mM Tris pH 8. 1，3. 7mM cystamine，6· 6πιΜβ -mer capoethylamine(4°C)，終濃度 α 鏈和抗-〇)3(scFv)-0 鏈分別為 0.1mg/mL，0.25mg/mL。
[0211] 混合后將溶液置于10倍體積的去離子水中透析（4°C )，12小時(shí)后將去離子水換成 緩沖液（10mM Tris，pH 8. 0)繼續(xù)于4°C透析12小時(shí)。透析完成后的溶液經(jīng)0. 45 μ Μ的濾 膜過濾后，通過陰離子交換柱（HiTrap Q HP 5ml, GE healthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性 成功的TCR α鏈與抗-⑶3 (scFv) - β鏈二聚體的TCR通過SDS-PAGE膠確認(rèn)。TCR融合分 子隨后通過尺寸排阻色譜法（S-10016/60，GE healthcare)進(jìn)一步純化，以及陰離子交換柱 (HiTrap Q HP 5ml, GE healthcare)再次純化。純化后的TCR融合分子純度經(jīng)過SDS-PAGE 測定大于90 %，濃度由BCA法測定。
[0212] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種T細(xì)胞受體（TCR)，其特征在于，其具有結(jié)合SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的特性， 并包含TCR α鏈可變域和/或TCR β鏈可變域，相對于具有α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID Ν0:75和β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID Ν0:76的TCR : (i)所述TCR在SEQIDN0:75所示其α鏈可變域氨基酸和/或在SEQIDN0:76所 示其β鏈可變域氨基酸中發(fā)生突變；和 (? )所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA Α2復(fù)合物的結(jié)合親和力是野生型TCR對 SLLMWITQC-HLA A2復(fù)合物的結(jié)合親和力的至少兩倍； 優(yōu)選地，所述突變發(fā)生在a鏈和/或β鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)中； 更優(yōu)選地，所述突變發(fā)生在a鏈的CDR1和/或CDR3中，和/或所述突變發(fā)生在β鏈 的CDR2和/或CDR3中。2. 如權(quán)利要求1所述的Τ細(xì)胞受體，其特征在于，所述突變發(fā)生在SEQ ID Ν0:75所 示其a鏈可變域的選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)：27T、28S、29I、30N、51S、53E、 54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S和98T，其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQIDN0 :75所示的編 號(hào)；和/或 所述突變發(fā)生在SEQ ID NO: 76所示其β鏈可變域的選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘 基位點(diǎn)：5(^、5謂、52153￥、54?、951\976、98厶、990、100?、1010和102!1，其中，氨基酸殘基編 號(hào)采用SEQ ID NO:76所示的編號(hào)； 優(yōu)選地， 突變后的所述TCR a鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基：27Y、27W、 27H、27F 或 27N ;28T、28Y、28D、28P、28N 或 28W ;29P、29L、29T、29V 或 29A ;30Q ;51N ;53S ; 54Q ;55T ;91N ;941\9419紐、941或945;95八或955;961?或961 ;97￥;981980或98八；其中， 氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID NO:75所示的編號(hào)；和/或 突變后的所述TCR β鏈可變域包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基：50C或50Y ; 51H 或 51L;52G ;53L ;54V 或 541;95S ;97N ;98G 或 98S ;99N 或 99L ;100A ;101I ;102V 或 1021 ;其中，氨基酸殘基編號(hào)采用SEQ ID N0:76所示的編號(hào)； 更優(yōu)選地， 所述TCR的a鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90 ;和 / 或 所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74。3. 如權(quán)利要求1所述的T細(xì)胞受體，其特征在于，所述TCR的a鏈可變域氨基酸序列 選自：SEQ ID 吣：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89;和/或 所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列選自：SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、30、31、33。4. 如以上任一權(quán)利要求所述的T細(xì)胞受體，其特征在于，所述TCR的a鏈和/或β鏈 的C-或Ν-末端結(jié)合有偶聯(lián)物； 優(yōu)選地與所述Τ細(xì)胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測標(biāo)記物、治療劑、ΡΚ修飾部分或任何 這些物質(zhì)的組合； 更優(yōu)選地，與所述Τ細(xì)胞受體結(jié)合的治療劑為連接于所述TCR的a或β鏈的C-或 N-末端的抗-CD3抗體。5. -種多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，包含至少兩個(gè)TCR分子，并且其中的至少一個(gè) TCR分子為上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TCR。6. -種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含編碼上述任一權(quán)利要求所述的TCR 分子的核酸序列或其互補(bǔ)序列。7. -種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求6中所述的核酸分子。8. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求7中所述的載體或染 色體中整合有外源的權(quán)利要求6中所述的核酸分子。9. 一種分離的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的TCR。10. -種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求 1-3中任一項(xiàng)所述的TCR、或權(quán)利要求5中所述的TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求9中所述的細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C07K14/725GK105985427SQ201510067001
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月6日
【發(fā)明人】李懿, 李峰
【申請人】廣州市香雪制藥股份有限公司