重組人角質細胞因子kgf-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組人角質細胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應用。具體涉及一種KGF-2硅質體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應用。所述傳遞系統(tǒng)包含1.2～3.5重量％的KGF-2、1～10重量％的有機-無機復合脂質、6～20重量％的保護劑和1～5重量％的凝膠基質。該KGF-2硅質體采用薄膜水化超聲法制備，并進一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明產品可明顯提高KGF-2穩(wěn)定性，延長KGF-2在眼內滯留的時間，有利于KGF-2的吸收和利用，對各類角膜潰瘍具有良好的修復作用，也能滋潤眼球緩解干眼癥癥狀，同時對眼部疲勞具備良好的舒緩作用，另外亦適用于其他口腔黏膜、粘膜創(chuàng)傷及皮膚美容治療后的修復。
【專利說明】重組人角質細胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程藥物制劑領域，公開了一種重組人角質細胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應用。具體涉及一種以KGF-2硅質體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應用。該KGF-2硅質體采用薄膜水化超聲法制備，并進一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002]角質細胞生長因子-2 (KGF-2)是成纖維細胞生長因子家族中第10個成員，是機體內自身存在的多肽生長因子，KGF-2為單拷貝基因，由3個外顯子和2個內含子組成，定位于15號染色體，是一條單鏈多肽，含有5個半胱氨酸殘基，其中4個半胱氨酸形成2對二硫鍵，另一個半胱氨酸在折疊的肽中，為β 2三葉草型。[0003]臨床上KGF-2可以用于治療多種表皮損傷相關疾病。美國Human Genome Sciences公司開發(fā)的KGF-2用于治療癌癥患者骨髓移植前高劑量化療引起的黏膜炎、潰瘍性結腸炎、慢性靜脈潰瘍，已進入II期臨床試驗研究。國內上海新生源公司開發(fā)的KGF-2用于燒燙傷的治療，進入III期臨床。然而，KGF-2蛋白的生物制備主要存在兩大缺陷:(l)KGF-2普遍表達量低(以大腸桿菌為宿主菌，表達量不足菌體總蛋白的5重量％ )，這嚴重制約了該藥的規(guī)?；a并造成了產品的價格非常昂貴，影響了其廣泛使用；(2)KGF-2與其他蛋白藥物一樣對熱和酸均不穩(wěn)定，在體內的半衰期僅為數(shù)分鐘，全身應用則會被快速滅活而難以發(fā)揮其有效作用，局部穿刺給藥對深部神經有損傷且難以保證每次釋藥部位的準確性，且不適宜長期用藥。
[0004]角膜位于眼球前面，質地透明表面光滑無血管，直接與外界接觸，易受損傷和感染，因而角膜疾病較為多見，也是致盲的重要原因。常見的外傷性角膜上皮缺損由化學燒傷、機械擦傷、手術等多原因引起，如果不能得到及時有效的治療，重者可導致角膜潰瘍或融解，甚至發(fā)生穿孔，嚴重影響視功能。傳統(tǒng)的治療方法雖有一定效果，但仍不夠理想。感染性角膜炎臨床上主要是采用抗生素療法，控制感染后靠內源性生長因子促進角膜愈合，但愈合質量差，而且病程長。臨床研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面越遲愈合越容易形成瘢痕。因角膜沒有血管，基質的修復過程比其他組織緩慢，所以使傷口盡快愈合就顯得十分重要，而KGF-2可加快上皮及基質細胞的增殖，對瘢痕的減少有積極的意義。
[0005]目前臨床上可供選用的促角膜上皮損傷修復的有效藥物并不多見，國內市場上基因工程藥物主要是貝復舒(重組牛bFGF滴眼劑)和金因舒(重組人EGF滴眼劑)。貝復舒開創(chuàng)了國內治療角膜上皮損傷藥物的新紀元，主藥是重組牛bFGF，該藥在臨床上用于因角膜上皮損傷引起的重癥干眼癥的治療取得很好的療效。但重組牛bFGF，因是牛源基因，對人的適應性差，不適合長期用藥。金因舒開創(chuàng)了“主動修復”的新紀元，主要藥效成分是重組人表皮生長因子衍生物(rhEGF)，適用于各種原因引起的角結膜上皮損傷的修復、各種內眼術后眼表的重建及限表護理。但bFGF和EGF在促進角膜上皮損傷愈合的同時，也會促進新生血管的生長，愈合后留有薄翳、斑翳或白斑，對視力有不同程度影響。雖然角膜細胞可分泌一定的KGF-2，但及時修復仍需補充外源性的KGF-2，以促進基質細胞的增殖和移行。鑒于KGF-2對上皮組織具有高度特異性，同時對對損傷引起的角膜新生血管的生長沒有促進作用，這與目前上市的生長因子類滴眼液相比，KGF-2優(yōu)勢明顯。
[0006]硅質體是一種新的制劑技術和藥物載體，它結合了脂質體和二氧化硅載體的優(yōu)點，同時克服了它們各自的缺陷，是目前比較理想的一種藥物載體。硅質體與傳統(tǒng)的脂質體囊泡相比，是一種非常穩(wěn)定的囊泡結構，是有機-無機的雜化材料。它是由含有硅醚基團的類脂質化合物(即，有機-無機復合脂質)在水溶液中，經過溶膠-凝膠(sol-gel)自組裝過程，聚集形成穩(wěn)定形態(tài)的雙層囊泡。同時囊泡表面包裹一層三維網狀硅酸鹽的結構，用穩(wěn)定的S1-C鍵將無機層和有機二分子體連接在一起。結構上的這一特點，使囊泡具有很高的穩(wěn)定性。本發(fā)明用有機-無機復合脂質來包裹KGF-2，對制備方法和制備工藝進行了優(yōu)化，開發(fā)出了具有高穩(wěn)定性、緩釋特性的KGF-2硅質體眼部智能傳遞系統(tǒng)，對KGF-2的臨床應用具有重大意義。
[0007]本項目課題組前期利用SUMO融合蛋白表達系統(tǒng)實現(xiàn)了 KGF-2的高效表達，在此技術上采用制劑學新技術制備了 KGF-2硅質體，并進一步制備成環(huán)境敏感型智能眼部給藥系統(tǒng)，活性保存率超過50 %，半衰期延長6倍以上。(美國人類基因組公司噴霧劑進入11期臨床試驗 E.coli 系統(tǒng)表達量 4.8%，Nham SU et al.Biotechnol Lett, 1990,16 (7):661-7.；美國Amgen公司靜脈注射液Kepivance? E.coli系統(tǒng)表達量4.2%, Zazo M.et al.Gene,1992，113 (2):231-7 ;上海新生源、溫州醫(yī)學院，凍干粉進入III臨床E.coli系統(tǒng)表達量4.5%酵母系統(tǒng)表達量3.7% )。實驗證實KGF-2硅質體眼部智能傳遞系統(tǒng)對各種原因引起的角膜上皮缺損和點狀角膜病變，復發(fā)性淺層點狀角膜病變、輕中度干眼癥、大泡性角膜炎、角膜擦傷、輕中度化學燒傷、角膜手術及術后愈合不良、地圖狀(或營養(yǎng)性)單庖性角膜潰瘍等有修復治療作用。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明公開了一種重組人角質細胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應用。具體涉及一種KGF-2硅質體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應用。該KGF-2硅質體采用薄膜水化超聲法或乙醇溶膠注入法制備，并進一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明產品可明顯提高KGF-2穩(wěn)定性，延長KGF-2在眼內滯留的時間，有利于KGF-2的吸收和利用。對各類角膜潰瘍具有良好的修復作用，也能滋潤眼球緩解干眼癥癥狀，同時對眼部疲勞具備良好的舒緩作用，另外亦適用于其他口腔黏膜、粘膜創(chuàng)傷及皮膚美容治療后的修復。
[0009]在第一方面中，本發(fā)明提供了一種重組人角質細胞因子KGF-2硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含1.2~3.5重量％的1---2、1~10重量％的有機-無機復合脂質、6~20重量％的保護劑和I~5重量％的凝膠基質。
[0010]其中所述的重組人KGF-2選自基因工程發(fā)酵純化提取的KGF-2，其宿主菌選自大腸桿菌 BL21(DE3)、BL21(DE3)rosatta、BL21 (DE3) plyss，優(yōu)選 BL21 (DE3)菌株。用于本發(fā)明的重組人KGF-2的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0011]其中所述的有機-無機復合脂質選自下式1-4中的任一種:[0012]
【權利要求】
1.一種重組人角質細胞因子KGF-2硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，包含1.2~3.5重量％的重組人KGF-2蛋白、I~10重量％的有機-無機復合脂質、6~20重量％的保護劑和I~5重量％的凝膠基質。
2.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述的重組人KGF-2的氨基酸序列為SEQ ID NO =10
3.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述有機-無機復合脂質選自下式1-4中的任一種:
4.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述的硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)為溫度敏感型、PH敏感型或離子敏感型，優(yōu)選離子敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。
5.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述硅質體平均粒徑為100-300nm，優(yōu)選 150nm。
6.一種制備權利要求1所述的重組人角質細胞因子KGF-2硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)的方法，所述方法包含以下步驟: (1)表達并純化重組人KGF-2蛋白； (2)利用選自下式1-4中的任一種的有機-無機復合脂質制備空白硅質體:
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中步驟(2)的空白硅質體通過薄膜水化超聲法或乙醇溶膠注入法制備。
8.權利要求1的重組人角質細胞因子KGF-2硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)在制備用于治療受試者中的角膜損傷或病變的藥物中的應用，其中所述角膜損傷或病變?yōu)楦鞣N原因引起的角膜損傷或病變，包括，角膜上皮缺損和點狀角膜病變、復發(fā)性淺層點狀角膜病變、輕中度干眼癥、大泡性角膜炎、角膜擦傷、輕中度化學燒傷、角膜手術及術后愈合不良或地圖狀(或營養(yǎng)性)單庖性角膜潰瘍。
9.權利要求1的重組人角質細胞因子KGF-2硅質體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)在制備美容劑中的應用。`
【文檔編號】A61P27/02GK103656622SQ201310648460
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權日:2013年12月4日
【發(fā)明者】黃亞東, 曲紅艷, 項琪, 蘇志堅, 李校堃, 王曉杰 申請人:廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司, 暨南大學