用于治療胰功能異常的方法
【專利摘要】用于在有需要的對(duì)象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-I+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防和/或延緩由胰功能異常引起的或與其相關(guān)的疾病的發(fā)作，例如，由胰不正常的內(nèi)分泌或外分泌功能引起的疾病。
【專利說(shuō)明】用于治療胰功能異常的方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年11月19日的申請(qǐng)?zhí)枮?00980155054.2標(biāo)題為“用于治療胰功能異常的方法”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及在有需要的對(duì)象中改善胰功能的方法。是方法可用于治療和/或預(yù)防和/或延緩病癥的發(fā)病或進(jìn)展，其中所述病癥由胰功能異常導(dǎo)致或與胰功能異常相關(guān)聯(lián)，例如，由不正常的胰內(nèi)分泌或外分泌功能所導(dǎo)致。
發(fā)明背景
[0003]胰是脊椎動(dòng)物的消化和內(nèi)分泌系統(tǒng)中的多功能的腺體器官。其既是內(nèi)分泌腺體(產(chǎn)生若干激素胰島素、胰高血糖素、和促生長(zhǎng)素抑制素)，也是外分泌腺體(分泌胰液，其含有傳遞至小腸的消化酶)。胰液中的酶幫助進(jìn)一步分解食糜(chyme)中的碳水化合物、蛋白、和脂肪。
[0004]胰具有內(nèi)分泌功能的部分由眾多的細(xì)胞簇構(gòu)成稱作朗格漢斯胰島。根據(jù)其分泌在胰島中主要由四類細(xì)胞類型:α細(xì)胞分泌胰高血糖素、β細(xì)胞分泌胰島素、δ細(xì)胞分泌促生長(zhǎng)素抑制素、以及PP細(xì)胞分泌胰多肽。胰島是內(nèi)分泌細(xì)胞的緊湊集合，其排列成簇和線狀(cord)并且還含有毛細(xì)血管網(wǎng)。胰島的毛細(xì)血管以直接與血管接觸的內(nèi)分泌細(xì)胞的層進(jìn)行排列，并且大部分內(nèi)分泌細(xì)胞直接與血管接觸，這是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程或者或者通過(guò)直接的并置(apposition)。
[0005]與分泌激素至血液的內(nèi)分泌胰相反，外分泌胰產(chǎn)生消化酶(例如，胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶、和淀粉酶)以及堿性液體，并響應(yīng)小腸激素而通過(guò)外分泌管道系統(tǒng)分泌蘇`和膽囊收縮素將這些分泌至小腸。消化酶是由外分泌胰的腺泡細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的。沿胰排列的特定細(xì)胞，稱作泡心細(xì)胞，將碳酸氫鹽-和鹽-富集的溶液分泌至小腸內(nèi)。
[0006]胰功能異?？蓪?dǎo)致胰所產(chǎn)生的激素和/或酶過(guò)量生產(chǎn)或生產(chǎn)不足。與胰功能異常相關(guān)或由其引起的病癥包括糖尿病、極性或慢性胰炎、胰酶缺乏或胰腫瘤。
[0007]糖尿病(DM)是一種最常見(jiàn)的慢性內(nèi)分泌疾病，遍及所有的年齡組和人群，并且由胰功能異常所引起。DM在全世界影響超過(guò)一億人。單單在美國(guó)，就有超過(guò)一千二百萬(wàn)對(duì)象被診斷為患有DM，每年新增診斷600，000例。
[0008]DM是一組疾病的診斷術(shù)語(yǔ)，該組疾病特征在于不正常的碳水化合物(例如，葡萄糖)內(nèi)穩(wěn)態(tài)或代謝，導(dǎo)致血糖升高。這些疾病包括互相關(guān)聯(lián)的代謝、血管、和神經(jīng)病性組分。DM的各種組分由胰的內(nèi)分泌和/或外分泌功能所引起。例如，代謝組分，通常特征是高血糖，包括由激素(特別是胰島素)分泌的缺失或顯著降低引起的碳水化合物、脂肪和蛋白代謝的改造(即，內(nèi)分泌功能)和/或胰島素作用無(wú)效。在外分泌水平，胰產(chǎn)生各種涉及食物消化的酶。例如，胰產(chǎn)生淀粉酶，而在DM中可能分泌不足量的此種酶來(lái)消化碳水化合物，導(dǎo)致外分泌胰機(jī)能不全、營(yíng)養(yǎng)不良和體重減輕。因此，胰的內(nèi)分泌和外分泌功能都對(duì)DM的代謝組分有貢獻(xiàn)。DM的血管組分包括血管畸形，導(dǎo)致心血管、視網(wǎng)膜、和腎臟的并發(fā)癥。外周和自主神經(jīng)系統(tǒng)的畸形也是DM的組分。
[0009]DM在遺傳上由循環(huán)胰島素的量的減少和/或?qū)ο笾袑?duì)胰島素相應(yīng)的細(xì)胞的減少而引起。胰島素在碳水化合物、脂肪、和蛋白質(zhì)的代謝中是必須的。胰島素通過(guò)使葡萄糖進(jìn)入肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以及通過(guò)刺激葡萄糖轉(zhuǎn)化成糖原(糖原生成)作為碳水化合物的儲(chǔ)存，從而降低血液葡萄糖水平。胰島素還抑制所儲(chǔ)存的葡萄糖從肝糖原釋放(糖原分解)，并減緩了脂肪降解成甘油三酸酯、游離脂肪酸、和酮。此外，胰島素減緩了蛋白分解產(chǎn)生葡萄糖(糖原異生)。胰島素是由胰的胰島中的β細(xì)胞生成和分泌的。
[0010]有若干種類型的糖尿病，包括I型(也稱作胰島素-依賴型糖尿病或IDDM)和II型(也稱作非胰島素-依賴型糖尿病或NIDDM)、妊娠糖尿病和糖尿病前期(或者受損的葡萄糖代謝)。當(dāng)然，糖尿病最常見(jiàn)的兩種形式是I型和II型糖尿病。I型糖尿病(或胰島素-依賴型糖尿?。籌DDM)是由胰β細(xì)胞的缺失、破壞或損失所引起的，導(dǎo)致胰島素的絕對(duì)缺乏。II型糖尿病(非胰島素-依賴型糖尿病；NIDDM)是特征在于胰島素抗性的異型的疾病。
[0011]I型糖尿病
[0012]I型糖尿病的總發(fā)病率單單在美國(guó)大約是每100，000人15例。在美國(guó)大約所有糖尿病病例中5-15%是I型糖尿病病例，醫(yī)師診斷每年新增病例約10，OOOnew例。國(guó)際上來(lái)說(shuō)，I型糖尿病的分辨率從中國(guó)的每100，000人約0.61例至撒丁島的每100，000人約34.5例，而在芬蘭每100，000人 超過(guò)40例。許多國(guó)家也報(bào)道在過(guò)去20年I型糖尿病的分辨率
已經(jīng)翻番。
[0013]I型糖尿病的急性臨床發(fā)作的特征在于一些癥狀如高血糖、多尿癥、煩渴、體重降低、或視力模糊，單獨(dú)的或組合的癥狀，隨后幾天或幾周有酮酸中毒。通常，該疾病的急性發(fā)作被認(rèn)為之前是長(zhǎng)期的無(wú)癥狀潛伏期，期間分泌胰島素的β-cells日益被對(duì)象的免疫系統(tǒng)所破壞。
[0014]在健康個(gè)體中，胰通常含有1-1.5百萬(wàn)個(gè)胰島；并且大約80%的胰島細(xì)胞islet是產(chǎn)胰島素的β-細(xì)胞。當(dāng)少于10%的這些β-細(xì)胞殘存時(shí)，糖尿病的臨床癥狀開(kāi)始顯現(xiàn)。
[0015]由胰細(xì)胞的損失所導(dǎo)致的胰島素供應(yīng)和需求之間的失諧會(huì)引起不正常的葡萄糖、脂質(zhì)、和蛋白質(zhì)的代謝。胰島素缺乏可以引起高血糖和血糖過(guò)多性脫水(hyperglycemic dehydration)、游離脂肪酸的水平升高、血清酮的水平升高、甘油三酸酯的水平升高、極低密度脂蛋白(VLDL)的水平升高、支鏈氨基酸水平的升高、蛋白合成的降低、以及酮酸中毒。具有I型糖尿病的對(duì)象可能會(huì)患有任何的一或多種不同的血管和神經(jīng)性的并發(fā)癥。例如，I型糖尿病患者心臟病發(fā)作的幾率是非糖尿病患者的兩倍；他們患?jí)木业膸茁适?倍；患有完全腎衰竭的幾率是17倍，失去視力的幾率是25倍。
[0016]I型糖尿病的治療/預(yù)防
[0017]目前，通過(guò)施用外源胰島素、鍛煉和飲食控制來(lái)治療I型糖尿病。這些形式的治療并不糾正對(duì)胰的損害(即，替換被破壞的胰島細(xì)胞)，而是替換胰島細(xì)胞所產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子或者嘗試避免對(duì)這些因子的需求。
[0018]大部分患有I型糖尿病的患者需要某種形式的胰島素治療。那時(shí)，此種治療通常需要監(jiān)測(cè)對(duì)象的血液葡萄糖和/或胰島素水平，并在需要的時(shí)候注射重組的或純化的胰島素。新形式的胰島素也在開(kāi)發(fā)中以使得能夠鼻部或口服施用。然而，此種形式的治療需要對(duì)象連續(xù)不斷地監(jiān)測(cè)以及需要在對(duì)象的一生中每天至少施用一次胰島素。如果對(duì)象忘記施用胰島素或者施用了過(guò)多的胰島素，就會(huì)有發(fā)展出例如，高血糖、低血糖或酮酸癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0019]目前用于治療I型糖尿病的另外的化合物包括例如，磺酰脲、雙縮胍，α-葡糖苷酶抑制劑或噻唑烷二酮。然而，每個(gè)這些化合物也具有明顯的缺陷。例如，磺酰脲引起低血糖和超高胰島素血癥；雙縮胍引起乳酸性酸中毒；α -葡糖苷酶抑制劑引起腸胃副作用；而噻唑烷二酮具有長(zhǎng)期存在的作用，與體重之間相關(guān)聯(lián)并且需要頻繁的測(cè)試肝功能。
[0020]胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)也被鑒定為糖尿病可能的治療劑。此種肽誘導(dǎo)胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達(dá)，PDX-1是在胰發(fā)育、β-細(xì)胞分化、和β -細(xì)胞功能保持中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子(Babu et al.，MolEndocrinol.20:3133-3145, 2006)。PDX-1涉及誘導(dǎo)葡萄糖感受和代謝的表達(dá)，如GLUT2，葡糖激酶和胰島素。GLP-1被建議為潛在的治療劑是因?yàn)槠淇梢哉T導(dǎo)胰β細(xì)胞在對(duì)象中擴(kuò)展，以及刺激膜島素表達(dá)(Buteau, Diabetes and Metabolism, 34: S73-S77, 2008)。然而，使用臨床可用的能夠提高GLP-1細(xì)胞內(nèi)可用性的物質(zhì)，如口服的活性二肽基肽酶-4(DPPIV)抑制劑或可注射的GLP-1類似物，已被局限于治療輕度的II型糖尿病。這些物質(zhì)相對(duì)較短的半衰期、需要頻繁的施用、以及在嚴(yán)重的β細(xì)胞損失的病例中相對(duì)缺乏效力，已經(jīng)排除了他們被用作胰島素節(jié)約劑用于I型糖尿病或其它胰島素依賴性患者的可能。即使是可口服的GLP-1類似物也具有短的半衰期并需要每日高劑量施用。
[0021]其它治療選擇包括胰島移植，其已顯示可降低胰島素依賴性(Shapiro etal., New Eng.J.Med.，343:230-238，2000)。然而，此種治療的應(yīng)用受到了來(lái)自捐獻(xiàn)者的原代人胰島非常有限的可用性的局限，在移植過(guò)程中必須具有心跳以確保細(xì)胞存活(Burnset al., J.Endocrinology, 103:437-443, 2004)。
[0022]干細(xì)胞，例如，胚胎干細(xì)胞(ES)已被建議作為適宜的來(lái)源用于產(chǎn)生治療相應(yīng)量的產(chǎn)胰島素細(xì)胞。然而，分泌`胰島素的細(xì)胞還未從干細(xì)胞中產(chǎn)生，更不要說(shuō)所需的水平了，估計(jì)每次移植需要2-4χ109個(gè)β-細(xì)胞。此種基于細(xì)胞的療法必須克服這樣的困難，即替代細(xì)胞的增殖能力必須受到嚴(yán)格控制以確保它們不會(huì)擴(kuò)展至某種水平會(huì)引起超高胰島素血癥或低血糖，而移植的細(xì)胞也必須避免受體免疫系統(tǒng)的破壞。此外，在基于ES細(xì)胞的療法中，必須去除任何殘留的ES細(xì)胞以避免形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
[0023]II型糖尿病
[0024]II型糖尿病占糖尿病病例的約90-95%，并且僅在美國(guó)每年就導(dǎo)致約193，000人死亡。II型糖尿病在所有死亡原因中排名第7位。在西方社會(huì)，II型糖尿病目前影響成年人群的6%并且全世界的分辨率預(yù)計(jì)每年增加6%。盡管存在某些遺傳性特點(diǎn)可能使得某些特定個(gè)體會(huì)偏向于發(fā)展出II型糖尿病，但是該疾病發(fā)病率目前增長(zhǎng)的主要原因是日益增加的久坐的生活方式、飲食以及目前在發(fā)達(dá)國(guó)際中普遍存在的肥胖癥等。II型糖尿病目前在國(guó)際上被認(rèn)為是人類健康的主要威脅之一。
[0025]II型糖尿病，在肌肉、脂肪、肝細(xì)胞不能正常響應(yīng)胰島素的時(shí)候發(fā)展出來(lái)。此種不能響應(yīng)(稱作胰島素抗性)可能是由于這些細(xì)胞上胰島素受體的減少，或者這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的功能異常，或者二者兼而有之。β_細(xì)胞起初通過(guò)提高其胰島素輸出來(lái)彌補(bǔ)此種胰島素抗性。隨著時(shí)間的推移，這些細(xì)胞變得不能夠產(chǎn)生足夠的胰島素以維持正常的葡萄糖水平，表明進(jìn)展至 II 型糖尿病(Kahn et al，Am.J.Med.108: 2S-8S)，2000)。
[0026]II型糖尿病的治療
[0027]對(duì)于II型糖尿病的常規(guī)治療是非常有限的，并集中于嘗試控制血液葡萄糖水平以使并發(fā)癥最小化或者延遲。目前的治療目標(biāo)是胰島素抗性(二甲雙胍，噻唑烷二酮("TZD"))，或者細(xì)胞釋放胰島素(磺脲，依澤那太(exanatide))。磺脲，以及其它通過(guò)使β_細(xì)胞去極化的化合物，具有低血糖的副作用，因?yàn)樗鼈円鸩灰蕾囉谘h(huán)葡萄糖水平的胰島素分泌。目前療法的其它副作用包括體重增加、隨時(shí)間推移對(duì)治療無(wú)反應(yīng)、胃腸問(wèn)題、以及水腫。
[0028]—種目前經(jīng)許可的藥物，Januvia(sitagliptin)提高了腸降血糖素激素的血液水平，其可以增加胰島素分泌，降低胰高血糖素分泌并且具有其它未經(jīng)有效表征的作。然而，Januvia和其它二肽基肽酶-1V抑制劑也可以影響其它激素和肽的組織水平，并且此類廣泛的效果的長(zhǎng)期結(jié)果還未經(jīng)完整的研究。此外，此化合物不解決與胰島素抗性相關(guān)的問(wèn)題。
[0029]與I型糖尿病類似，GLP-1已被建議作為潛在的治療劑用于II型糖尿病，這是由于其誘導(dǎo)胰島素分泌、誘導(dǎo)β_細(xì)胞擴(kuò)展和恢復(fù)葡萄糖抗性細(xì)胞中的葡萄糖耐受的能力。然而，如上所述，GLP-1及其類似物由于其非常短的半衰期而具有有限的治療潛力。
[0030]由前文可知，現(xiàn)有技術(shù)中需要用于對(duì)與胰功能相關(guān)的疾病的發(fā)作或進(jìn)展進(jìn)行治療或預(yù)防或延緩的方法和/或用于改善胰功能的方法。
[0031]發(fā)明概述
[0032]在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，發(fā)明人想要確定間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的特定亞集對(duì)胰功能異常的發(fā)展和/或進(jìn)展的作用。本發(fā)明人使用了已知的模型，其中通過(guò)對(duì)小鼠施用鏈脲菌素(STZ)來(lái)誘導(dǎo)胰功能異常。此化合物誘導(dǎo)胰島的炎癥和免疫細(xì)胞滲入，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和胰功能異常。STZ在胰的內(nèi)分泌功能(例如，降低胰島素產(chǎn)生)和胰的外分泌功能(例如，降低淀粉酶產(chǎn)生)均引起功能異常。此模型也是葡萄糖代謝病的被接受的模型，例如，I型糖尿病和II型糖尿病。
[0033]如本文所示例的，本發(fā)明人證明了向經(jīng)過(guò)STZ處理的小鼠施用STRO-1+細(xì)胞提高了血清胰島素水平以及減低了血液葡萄糖水平(與經(jīng)過(guò)STZ處理的但未接受STRO-1+細(xì)胞的小鼠相比)。本發(fā)明人也證明了 STRO-1+細(xì)胞在胰中誘導(dǎo)或增加表達(dá)rox-1的細(xì)胞的數(shù)目，和/或增加對(duì)象中胰β細(xì)胞和/或胰島的數(shù)目(例如，促進(jìn)胰β細(xì)胞再生)。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)STRO-1+細(xì)胞通過(guò)提高β細(xì)胞數(shù)目和/或降低α細(xì)胞從而恢復(fù)了胰β細(xì)胞對(duì)胰α細(xì)胞的比率。本發(fā)明人此外還發(fā)現(xiàn)用STRO-1+細(xì)胞治療可在對(duì)象的胰中誘導(dǎo)血管形成。這些數(shù)據(jù)一起，表明了 STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或由其所分泌的因子誘導(dǎo)或促進(jìn)胰再生和/或改善胰功能。因此，所述STRO-1+細(xì)胞或其后代細(xì)胞或源自其的因子能夠治療和/或預(yù)防和/或降低胰的STZ毒性作用。因此這些數(shù)據(jù)表明所述STRO-1+細(xì)胞或其后代細(xì)胞或源自其的一或多種因子能夠治療或預(yù)防或延緩胰功能異常的發(fā)作或者降低胰功能異常的嚴(yán)重性和/或改善胰功能和/或誘導(dǎo)胰或其細(xì)胞的再生和/或醋精葡萄糖代謝(例如，通過(guò)提高循環(huán)胰島素水平)。
[0034]本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)為用于治療和/或預(yù)防和/或延緩胰功能異常的發(fā)作和/或延緩胰功能異常的進(jìn)展的方法提供了基礎(chǔ)，所述胰功能異常如糖尿病。[0035]因此，本發(fā)明提供了用于在有需要的對(duì)象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0036]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于促進(jìn)或者誘導(dǎo)對(duì)象中胰再生的方法(例如，在患有胰功能異常的對(duì)象中)，所述方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。例如，該方法誘導(dǎo)或促進(jìn)新的β細(xì)胞和/或胰中微血管的產(chǎn)生。
[0037]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0038]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于在對(duì)象中降低的血液葡萄糖水平和/或增加血液/血清胰島素水平的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0039]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于在對(duì)象中增加胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于增加胰β細(xì)胞相對(duì)于胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于降低胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于增加胰島的數(shù)目的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0040]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于在對(duì)象的胰中增加胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達(dá)和/或用于增加表達(dá)的PDX-1的細(xì)胞的數(shù)目的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0041]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于在對(duì)象的胰中誘導(dǎo)或促進(jìn)動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0042]本發(fā)明另外或者作為選擇還提供用于在對(duì)象中增加胰β細(xì)胞前體的數(shù)目或者誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞前體的增殖的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0043]在一個(gè)實(shí)例中，對(duì)象患有胰功能異常。
[0044]在一個(gè)實(shí)例中，所述胰功能異常與胰的內(nèi)分泌功能和/或胰的外分泌功能的功能異常相關(guān)或由其所引起。優(yōu)選地，所述胰功能異常導(dǎo)致胰功能降低或與胰功能降低相關(guān)，例如，胰的內(nèi)分泌功能減低或胰的外分泌功能降低。
[0045]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起碳水化合物代謝病。此種碳水化合物代謝病可由胰的內(nèi)分泌和/或外分泌功能異常所引起。在一個(gè)實(shí)例中，所述碳水化合物代謝病由胰的胰島素生產(chǎn)降低所引起。在另一個(gè)實(shí)例中，所述碳水化合物代謝病是由胰高血糖素水平升高所引起(例如，α細(xì)胞的數(shù)目增加和/或胰高血糖素的表達(dá)和/或產(chǎn)生和/或分泌增加)。在另一個(gè)實(shí)例中，所述碳水化合物代謝病是由胰的淀粉酶生產(chǎn)降低所引起。技術(shù)人員根據(jù)本文的說(shuō)明會(huì)意識(shí)到，碳水化合物代謝病(或胰功能異常)未必僅由胰的功能來(lái)表征。例如，碳水化合物代謝病也可以由胰島`素抗性和/或由血管組分和/或由神經(jīng)病變的組分來(lái)進(jìn)行表征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述胰功能異常是糖尿病，例如，I型糖尿病或II型糖尿病。
[0046]優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括施用有效量的或者治療有效量的或者預(yù)防有效量的STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的量足以誘導(dǎo)對(duì)象中胰島素生產(chǎn)，優(yōu)選誘導(dǎo)胰島素的生產(chǎn)至少約I周或2周或3周或4周。
[0047]在一個(gè)實(shí)例中，將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子直接施用至對(duì)象的血流中，然而并不排除其它的施用部位。優(yōu)選地，將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子全身性地施用。例如，將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、施用至大動(dòng)脈內(nèi)、至心臟的心房或心室內(nèi)或者至與胰相連的血管內(nèi)，例如，腹部大動(dòng)脈、上腸系膜動(dòng)脈、胰十二指腸動(dòng)脈或脾動(dòng)脈。在優(yōu)選的實(shí)例中，將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)施用，例如，施用至股動(dòng)脈內(nèi)或腹腔動(dòng)脈內(nèi)，例如，施用導(dǎo)管。
[0048]作為選擇，或者此外，將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子施用至對(duì)象的胰或其部分。
[0049]在一個(gè)實(shí)例中，施用于對(duì)象的STRO-1+細(xì)胞是STRO-1bn、和/或表達(dá)組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)。本文描述了另外的STRO-1+細(xì)胞群體，其特征在于特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物或其組合。根據(jù)此實(shí)例，后代細(xì)胞和/或可溶因子也可以源自表達(dá)STRO-1的細(xì)胞或STRO-1b"細(xì)胞和/或表達(dá)TNAP的細(xì)胞。此類后代細(xì)胞也可以表達(dá)STRO-1或者是STRO-1b"細(xì)胞和/或表達(dá)TNAP。
[0050]根據(jù)本發(fā)明用于治療或延緩胰功能異常的進(jìn)展的的實(shí)例，優(yōu)選在對(duì)病癥進(jìn)行診斷之后再施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子，例如，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。對(duì)于那些用于預(yù)防或延緩胰功能異常的發(fā)作的實(shí)例，優(yōu)選在病癥的臨床診斷前施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子，例如，當(dāng)對(duì)象患有受損葡萄糖耐受和/或受損的禁食糖血時(shí)，和/或在自身免應(yīng)答之前的或伴有自身免應(yīng)答的I型糖尿病的情況，如由T細(xì)胞群體和/或B細(xì)胞群體的擴(kuò)展所指示出的和/或由自身抗體的產(chǎn)生所指示出的`(例如，在I型糖尿病的發(fā)作或進(jìn)展中針對(duì)胰β_胰島細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì)胞的擴(kuò)展和/或針對(duì)一或多種胰β-胰島細(xì)胞標(biāo)記物的自身抗體的擴(kuò)展)。
[0051]優(yōu)選地，本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的方法另外包括監(jiān)監(jiān)測(cè)或探測(cè)胰功能異常的發(fā)病和/或進(jìn)展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰島素水平、和/或β細(xì)胞的數(shù)目、和/或α細(xì)胞的數(shù)目、和/或胰島的數(shù)目、和/或rox-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目、和/或PDX-1表達(dá)的量和/或血管的數(shù)目。例如，該方法另外包括葡萄糖耐受測(cè)試和/或禁食糖血測(cè)試和/或測(cè)量由胰所產(chǎn)生的激素或酶的水平和/或獲得胰的樣品以確定β-細(xì)胞的數(shù)目和/或α細(xì)胞的數(shù)目和/或胰島的數(shù)目和/或表達(dá)rox-1的細(xì)胞的數(shù)目和/或rox-1表達(dá)的量和/或血管的數(shù)目。此類監(jiān)測(cè)可以指示出隨后施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子是必須的或期望的。
[0052]技術(shù)人員從前面的段落會(huì)了解到，本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的方法不應(yīng)被認(rèn)為是將STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子限制為單次施用。本發(fā)明清楚地涵蓋了多次施用，施用于相同的或不同的部位或通過(guò)相同的或不同的途徑施用。本發(fā)明也涉及了 STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子的單次施用。
[0053]在一個(gè)實(shí)例中，將STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子以組合物的形式施用，例如，包含所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子以及載體和/或賦形劑的組合物。適宜的載體和/或賦形劑對(duì)技術(shù)人員而言將是顯見(jiàn)的和/或在本文中有描述。
[0054]此種組合物可以包含另外的可用于治療或預(yù)防碳水化合物代謝病的因子，例如，胰島素或淀粉酶和/或與正常胰功能相關(guān)的肽或多肽，例如，膽囊收縮素辛肽(cholycystokinin octapeptide)或促生長(zhǎng)素抑制素或胰高血糖素或胰蛋白酶原或胰凝乳蛋白酶原或彈性蛋白酶或羧肽酶或胰脂肪酶。作為選擇，或者此外，STRO-1+細(xì)胞或其后代細(xì)胞可以經(jīng)遺傳改造以表達(dá)(以及優(yōu)選分泌)，此種另外的因子，例如，胰島素或淀粉酶和/或與正常胰功能相關(guān)的肽或多肽例如，膽囊收縮素辛肽或促生長(zhǎng)素抑制素或胰高血糖素或胰蛋白酶原或胰凝乳蛋白酶原或彈性蛋白酶或羧肽酶或胰脂肪酶。
[0055]本發(fā)明還提供了對(duì)STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的使用，或者含有上述的組合物的使用:
[0056](i)治療胰功能異常；和/或
[0057](ii)改善胰功能；和/或
[0058](iii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或
[0059](iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或
[0060](V)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或
[0061](vi)提高胰和十 二指腸同源異型框因子-1(rox-1)表達(dá)和/或用于提高胰中的PDX-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或
[0062](vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生。
[0063]本發(fā)明還提供了 STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子在制備藥物中的用途，所述藥物用于:
[0064]⑴治療胰功能異常；和/或
[0065](ii)改善胰功能；和/或
[0066](iii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或
[0067](iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或
[0068](V)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或
[0069](vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1 (rox-1)表達(dá)和/或用于提高胰中的PDX-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或
[0070](vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生。
[0071]本發(fā)明適用于廣闊范圍的動(dòng)物。例如，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物如人、狗、貓、馬、牛、或綿羊，優(yōu)選所述對(duì)象是人。在一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)象是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)象是非人哺乳動(dòng)物。
[0072]附圖簡(jiǎn)述
[0073]圖1描述了天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細(xì)胞對(duì)血液葡萄糖水平(BGL)的影響。血液葡萄糖水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細(xì)胞(CM)的糖尿病小鼠中確定，所述小鼠在STZ-療法后第10天被注射。血液葡萄糖值為平均葡萄糖(mM) +/-SEο 斯氏 t 檢驗(yàn)(Student，s t-test)以顯著性 ρ〈0.05 來(lái)進(jìn)行。[0074]圖2顯示了處理后的第7天、14天和21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細(xì)胞對(duì)血液葡萄糖水平(BGL)的影響，與STZ-處理后第10天的基準(zhǔn)相比較。血液葡萄糖水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細(xì)胞(CM)的糖尿病小鼠中確定。結(jié)果表示為BGL相對(duì)于第10天細(xì)胞治療起始的％變化。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0075]圖3顯示了細(xì)胞治療劑量21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島素水平的影響。血清小鼠胰島素水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細(xì)胞(CM)的糖尿病小鼠中確定。小鼠胰島素值為yg/L+/-SE。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0076]圖4A顯示了細(xì)胞治療劑量21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰微血管密度的影響。由抗-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)抗體染色的微血管的總數(shù)目是基于胰切片的大小分布/橫切面面積來(lái)確定的。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0077]圖4B是顯微照片(200x)的復(fù)印，顯示了經(jīng)STRO-1細(xì)胞處理的小鼠的胰組織中由小鼠抗-平滑肌肌動(dòng)蛋白IgG2a-FITC染色的不同直徑的微血管。
[0078]圖5A顯示了細(xì)胞治療劑量21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰mRNA譜的影響。從媒介物組(CV)和STRO-1治療組(CM)的胰組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄并PCR擴(kuò)增與β細(xì)胞再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子:1&^&、呢113、？(11-1。將總RNA含量針對(duì)持家基因β_肌動(dòng)蛋白來(lái)進(jìn)行歸一化。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0079]圖5B顯示了細(xì)胞治療劑量21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)PDX-1陽(yáng)性細(xì)胞的作用。對(duì)由抗-PDX-1抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的PDX-1陽(yáng)性細(xì)胞。數(shù)`據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對(duì)照組(無(wú)STZ)N=3只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0080]圖5C是一系列顯微照片(400x)的復(fù)印件，顯示了經(jīng)抗原恢復(fù)、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由小鼠抗-PDX-1 (IgG2b)染色并由山羊抗-小鼠IgG2b-Alexa555綴合物檢測(cè)。
[0081]圖6A顯示了細(xì)胞治療21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島特性的作用。對(duì)由H&E染色的胰組織分析胰島密度，其被針對(duì)所檢驗(yàn)的切片面積而進(jìn)行歸一化。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0082]圖6B顯示了細(xì)胞治療21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島特性的作用。對(duì)由H&E染色的胰組織分析平均胰島直徑，其被針對(duì)所檢驗(yàn)的切片面積而進(jìn)行歸一化。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動(dòng)物。
[0083]圖6C顯示了細(xì)胞治療21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島特性的作用。對(duì)由H&E染色的胰組織分析平均胰島面積，其被針對(duì)所檢驗(yàn)的切片面積而進(jìn)行歸一化。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動(dòng)物。[0084]圖7A顯示了細(xì)胞治療21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島特性的作用。對(duì)由抗胰島素抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對(duì)照組(無(wú)STZ)N=3只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0085]圖7B是一系列顯微照片(200x)的復(fù)印件，顯示了經(jīng)抗原恢復(fù)、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由豚鼠抗-胰島素抗體染色并由抗豚鼠IgG-羅丹明綴合物檢測(cè)。處理組在每張顯微照片的底部標(biāo)出。
[0086]圖7C顯示了細(xì)胞治療21天后在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD/scid小鼠中動(dòng)脈內(nèi)STRO-1+細(xì)胞對(duì)胰島特性的作用。對(duì)由抗胰高血糖素抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對(duì)照組(無(wú)STZ)N=3只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0087]圖7D是一系列顯微照片(200x)的復(fù)印件，顯示了經(jīng)抗原恢復(fù)、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由小鼠抗-胰高血糖素抗體染色并由山羊抗-小鼠IgG-FITC綴合物檢測(cè)。處理組在每張顯微照片的底部標(biāo)出。
[0088]圖7E顯示了胰島內(nèi)β細(xì)胞的數(shù)目作為總α+β細(xì)胞的比例。所示出的數(shù)據(jù)是從胰島素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/mm2胰島面積以及胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/mm2胰島面積而計(jì)算的。該數(shù)據(jù)表示平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理的對(duì)照組(無(wú)STZ)N=3只動(dòng)物。斯氏T檢驗(yàn)以顯著性p〈0.05來(lái)進(jìn)行。
[0089]優(yōu)選實(shí)施方案詳述
[0090]一般技術(shù)和經(jīng)選擇的定義
[0091]在整個(gè)本發(fā)明書(shū)中，除非另有具體說(shuō)明或者背景另有要求，涉及的單一步驟、物質(zhì)的組合物，成組的步驟或成組的物質(zhì)組合物，應(yīng)當(dāng)被理解為涵蓋了一個(gè)以及多個(gè)(即一或多個(gè))的那些步驟、物質(zhì)的組合物、成`組的步驟或成組的物質(zhì)組合物。
[0092]本文所描述的每個(gè)實(shí)施方案或者實(shí)施例經(jīng)必要的修改后會(huì)適用于每個(gè)其它的實(shí)施方案，除非另有具體說(shuō)明。例如，本文所述的專注于治療和/或預(yù)防和/或延緩對(duì)象中胰功能異常的發(fā)作和/或延緩對(duì)象中胰功能異常的進(jìn)展的每個(gè)實(shí)施方案或?qū)嵤├?jīng)必要的修改后會(huì)適用于改善胰功能的方法和/或誘導(dǎo)或促進(jìn)胰再生的方法，就好像那些實(shí)施方案已明確地記載于本文中。
[0093]本文所述的關(guān)于治療胰功能異常的每個(gè)實(shí)施例應(yīng)被理解為經(jīng)必要的修改后會(huì)適用于碳水化合物代謝病的治療，就好像那些實(shí)施方案已明確地記載于本文中。
[0094]本文所述的關(guān)于治療胰功能異常的每個(gè)實(shí)施例應(yīng)被理解為經(jīng)必要的修改后會(huì)適用于糖尿病的治療，例如I型糖尿病或II型糖尿病，就好像那些實(shí)施方案已明確地記載于本文中。
[0095]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本文所述的發(fā)明可接受本文所具體描述的之外的變化和修改。應(yīng)理解為本發(fā)明包括所有此類的變化和修改。本發(fā)明也單獨(dú)地或共同地包括本說(shuō)明書(shū)中所提及和指出的所有的步驟、特征、組合物和化合物，以及任意的和所有的組合，或者任意的二或更多個(gè)所述的步驟或特征。
[0096]本發(fā)明在范圍上不受本文所述的具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案僅僅是用于例證的目的。功能上等價(jià)的產(chǎn)品、組合物和方法如本文所述也清楚地在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0097]本發(fā)明的施行中無(wú)過(guò)度的實(shí)驗(yàn)，除非另有明示，其中使用常規(guī)技術(shù)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA技術(shù)、溶液中的肽合成、固相肽合成、以及免疫學(xué)。此類過(guò)程例如在如下中有描述Sambrook, Fritsch & Maniatis, MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, SecondEdition (1989)，整個(gè) Vols 1、II^[IDI;DNA Cloning: A Practical Approach，Vols.1 和II (D.N.Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford,全文；Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach (M.J.Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford,全文，以及特別是其中的文章 Gait，ppl-22;Atkinson et al, ρρ35~81;Sproat et al，pp83_115;和Wu et al,pp135-151;4.Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.，1985)IRL Press,Oxford,全文;Immobilized Cellsand Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press, Oxford,全文;Perbalj B., APractical Guide to Molecular Cloning(1984);Methods In Enzymology(S.Colowickand N.Kaplan, eds.，Academic Press, Inc.)，全系 列；J.F.Ramalho Ortigaoj 〃TheChemistry of Peptide Synthesis〃In:Knowledge database of Access to VirtualLaboratory website(Interactiva, Germany);SakakibarajD.，TeichmanjJ.，Lien,E.Land Fenichelj R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342 ;Merrifield, R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85, 2149-2154 ; Baranyj G.and Merrifieldj R.B.(1979)in The Peptides (Gross, E.and MeienhoferjJ.eds.)，vol.2，pp.1-284，AcademicPress, New York.12.Wiinschj E., ed.(1974) Synthese von Peptiden in Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie (Miller, E., ed.), vol.15, 4th edn.,第 I 和第 2 部7Jf , Thiemej Stuttgart; Bodanszkyj Μ.(1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg;Bodanszkyj M.& Bodanszkyj A.(1984)The Practice of PeptideSynthesis, Springer-Verlagj Heidelberg;Bodanszkyj M.(1985)Int.J.Peptide ProteinRes.25, 449-474;Hand book of Experimental Immunology, Vols.1-1V(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications);以及 Animal CellCulture!Practical Approach, Third Edition(John R.W.Masters, ed., 2000), ISBN0199637970，全文。
[0098]在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非前背景中另有要求，措辭〃包含〃或其變體如〃包括〃或〃含有〃等，將被認(rèn)為是表示包括了所述的步驟或元件或整體或者步驟或元件或整體的組，但卻并不排除包括任何其它的步驟或元件或整體或者步驟或元件或整體的組。
[0099]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"源自"應(yīng)被認(rèn)為是表示具體的整體可以得自特定的來(lái)源但卻未必是直接來(lái)自該來(lái)源。對(duì)于源自STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞的可溶因子的情況，此術(shù)語(yǔ)應(yīng)被認(rèn)為是指一或多種因子例如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物等，是在STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞的體外培養(yǎng)期間所產(chǎn)生的。
[0100]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“改善胰功能”應(yīng)被認(rèn)為是指對(duì)象中胰的一或多種功能與未經(jīng)本發(fā)明所述那樣處理的對(duì)象中的同一功能相比得到了增強(qiáng)(優(yōu)選是與處理前的對(duì)象相比)。此術(shù)語(yǔ)涵蓋了，例如在患有或者未患有葡萄糖代謝病的對(duì)象中提高胰島素分泌的水平或改善胰島素分泌的調(diào)節(jié)。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了在具有升高的水平的胰高血糖素(例如，由于分泌胰高血糖素的腫瘤)的對(duì)象中和/或在患有低血糖的對(duì)象中降低例如胰高血糖素的分泌.[0101]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胰功能異?！睉?yīng)被認(rèn)為是指任何這樣的狀況，其中對(duì)象中胰的一或多種功能與正常和/健康個(gè)體中同一功能不同。例如，術(shù)語(yǔ)“胰功能異常”涵蓋了其中對(duì)象中胰的內(nèi)分泌功能和/或外分泌功能與正常和/或健康個(gè)體相比增強(qiáng)了或降低了。例如，“胰功能異常”的特征可以在于，與異常(即，增加了或減少了)水平的胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶相關(guān)或由其所引起。根據(jù)前文對(duì)于技術(shù)人員而言顯見(jiàn)的是，術(shù)語(yǔ)“治療胰功能異?！焙w了使胰的功能正?；?例如，治療對(duì)象以使胰的一或多種不正常的功能減弱或增強(qiáng)，從而使它們更類似于正常和/或健康個(gè)體的同一功能)。例如，此種治療可以在具有異常降低水平的胰島素和/或胰β細(xì)胞和/或胰島的對(duì)象中導(dǎo)致胰島素水平升高和/或胰β細(xì)胞和/或胰島的數(shù)目增加。此種治療可以同樣地降低異常升高的胰高血糖素水平，例如，分泌胰高血糖素的胰腫瘤的情況，例如通過(guò)降低分泌胰高血糖素的α細(xì)胞的數(shù)目和/或通過(guò)降低胰高血糖素的表達(dá)、產(chǎn)生和/或分泌。在前文的基礎(chǔ)上，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防或延緩胰功能異?！钡暮x對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯見(jiàn)的。
[0102]胰功能異常可以與導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)(例如，碳水化合物、脂質(zhì)或蛋白質(zhì))吸收障礙的病癥相關(guān)或引起該病癥，例如是因?yàn)橛梢人a(chǎn)生的消化酶的水平降低，如脂肪酶或淀粉酶，和/或通過(guò)降低胰液的產(chǎn)生。此類病癥包括胰炎、胰機(jī)能不全、獲得性自身免疫缺陷綜合癥、癌癥、囊性纖維化或Zollinger-Ellison綜合癥。在優(yōu)選的實(shí)例中，所述病癥是由胰所產(chǎn)生的淀粉酶或脂肪酶的降低而引起的或者與其相關(guān)。
[0103]胰功能異常還可以關(guān)聯(lián)或引起與對(duì)象對(duì)營(yíng)養(yǎng)的異常使用或代謝相關(guān)的病癥，例如，導(dǎo)致高血糖或低血糖、降低的血清氨基酸水平、蛋白尿、壞死松解性游走性紅斑(necrolytic migratory erythema)。此類病癥包括碳水化合物代謝病如糖尿病。其它病癥包括，例如腫瘤(如分泌胰高血糖素的腫瘤，其可引起高血糖)。示例性的腫瘤包括胰高血糖素瘤。
[0104]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“碳水化合物代謝病”應(yīng)被理解為是指對(duì)象不能夠(或者能力降低)降解或代謝或者吸收或使用一或多種形式的碳水化合物的病征，通常導(dǎo)致該對(duì)象的血流中所述碳水化合物的水平升高。`優(yōu)選所述碳水化合物代謝病與涉及碳水化合物降解的激素在胰中生產(chǎn)的降低相關(guān)或者由其所引起，例如淀粉酶的生產(chǎn)。更優(yōu)選地，所述碳水化合物代謝病與涉及碳水化合物攝取的激素在胰中生產(chǎn)的降低相關(guān)或者由其所引起，例如胰島素的生產(chǎn)。示例性的碳水化合物代謝病包括I型糖尿病、II型糖尿病、先天性I型糖尿病(Ib型)、早發(fā)性II型糖尿病(EOD)、青年發(fā)作性非典型糖尿病(YOAD)、青年的成年發(fā)作性糖尿病(MODY)、營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)性糖尿病、妊娠糖尿病、葡萄糖耐受受損(IGT)的病癥、禁食血漿葡萄糖受損的病癥、代謝性酸中毒、酮病、X綜合癥、高血糖、低胰島素血癥、胰島素抗性、α甘露糖苷病、β甘露糖苷病、果糖不耐受、巖藻糖苷累積病、半乳糖血癥、Leigh病、粘脂質(zhì)累積、粘多糖累積病、或者任何一或多種前述病癥的并發(fā)癥。優(yōu)選所述碳水化合物代謝病是糖尿病，例如I型糖尿病或II型糖尿病。
[0105]優(yōu)選患有糖尿病的對(duì)象具有臨床可接受的糖尿病標(biāo)記，如:
[0106].禁食血漿葡萄糖高于或等于7nmol/L或126mg/dl;[0107].臨時(shí)血衆(zhòng)葡萄糖(在一天的任何時(shí)間獲取)高于或等于11.lnmol/L或200mg/dl并具有糖尿病的癥狀。
[0108].以；2小時(shí)的時(shí)間間隔測(cè)量的口服糖尿病耐受測(cè)試(OGTT)值高于或等于
11.lnmol/L或200mg/dl。OGTT以2或3小時(shí)的時(shí)間跨度給出。
[0109]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”應(yīng)被理解為是指STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子的量足以改善其所施用的對(duì)象的胰功能(與施用前相比和/或與未施用其的對(duì)象相比)。例如，有效量的STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子可以降低基礎(chǔ)或休眠葡萄糖水平(糖血)和/或改善葡萄糖耐受和/或提高血液胰島素水平和/或提高血清中或胰中或消化系統(tǒng)中胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶的水平。有效量的STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子還可以增加胰或其區(qū)域的血液供應(yīng)，例如通過(guò)增加胰或其區(qū)域內(nèi)或周?chē)拿}管系統(tǒng)。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到此種量會(huì)根據(jù)一些因素而變化，例如STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子、和/或特定的對(duì)象、和/或胰功能異常的類型或嚴(yán)重性。因此，此術(shù)語(yǔ)不應(yīng)理解為是將本發(fā)明限制為具體的量，例如細(xì)胞或可溶因子的重量或數(shù)目，而本發(fā)明涵蓋了足以改善對(duì)象中胰功能的任何量的所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因。用于確定胰功能的方法和/或用于確定STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子足以改善胰功能的量的方法的技術(shù)人員是顯見(jiàn)的和/或在本文中有描述。有效量未必治療或防止胰功能異常。
[0110]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”應(yīng)被理解為是指STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子的量足以減少或抑制與胰功能異常相關(guān)或由其引起的臨床病癥的一或多種癥狀，達(dá)到低于所觀測(cè)的水平或者接受為該病癥的臨床診斷的水平。例如，治療有效量的STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子可以將對(duì)象的葡萄糖耐受從糖尿病對(duì)象中所觀測(cè)的水平降低到癥狀發(fā)生前的對(duì)象(例如患受損的葡萄糖耐受或受損的休眠糖血)中或者正`?；蚪】祵?duì)象中所觀測(cè)到的水平。
[0111]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防有效量”應(yīng)被理解為是指STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子的量足以防止或抑制與胰功能異常相關(guān)或由其引起的臨床病癥的一或多種可探測(cè)癥狀的發(fā)作。例如，預(yù)防有效量STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子可以防止對(duì)象的葡萄糖耐受變?yōu)槭軗p至該對(duì)象被臨床診斷為糖尿病的程度。
[0112]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”應(yīng)被理解為是指施用治療有效量的可溶因子和/或細(xì)胞，并且減少或抑制與胰功能異常相關(guān)或由其引起的臨床病癥的至少一種癥狀。
[0113]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”或“防止”應(yīng)被理解為是指施用預(yù)防有效量的可溶因子和/或細(xì)胞，并且停止或阻礙與胰功能異常相關(guān)或由其引起的臨床病癥的至少一種癥狀的發(fā)展。
[0114]〃延緩胰功能異常的進(jìn)展〃是指治療降低了對(duì)象中胰功能異常的嚴(yán)重性。此種嚴(yán)重性的降低可以是，例如防止胰功能異常的一或多種并發(fā)癥，如營(yíng)養(yǎng)吸收障礙、低血糖、高血糖、酮酸癥、視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、高血壓、腎衰竭、冠狀動(dòng)脈病、外周血管病、神經(jīng)病(如外周神經(jīng)病或自主神經(jīng)病)或者感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。作為選擇，或者此外，胰功能異常嚴(yán)重性降低的特征在于，對(duì)象對(duì)治療性處理(如胰島素施用)的需求降低，或者對(duì)治療性處理規(guī)律性的需求降低(與未使用本發(fā)明的方法接受治療的對(duì)象相比)。作為選擇，或者此外，"降低胰功能異常進(jìn)展"是指，與未使用降低胰功能異常的進(jìn)展的化合物進(jìn)行治療的糖尿病對(duì)象相比，延遲了胰功能異常的一或多種可檢測(cè)癥狀的發(fā)作。
[0115]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可溶因子”應(yīng)被理解為是指由STRO-1+細(xì)胞和/或其后代所產(chǎn)生的任何可溶于水的分子，例如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。此類可溶因子可以是細(xì)胞內(nèi)的和/或由細(xì)胞所分泌的。此類可溶因子可以是復(fù)雜的混合物(如上清液)和/或其部分、和/或可以是純化的因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，可溶因子是上清液或包含在上清液內(nèi)。因此，本文中要施用一或多種可溶因子的任何實(shí)例應(yīng)被理解為，經(jīng)必要修改后將會(huì)適用于施用上清液。
[0116]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“上清液”是指在適宜的培養(yǎng)基(優(yōu)選液體培養(yǎng)基)中體外培養(yǎng)間充質(zhì)前體細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞后，所產(chǎn)生的非細(xì)胞材料。通常，所述上清液的產(chǎn)生是通過(guò)在適宜的條件和時(shí)間于培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，隨后由離心等方法去除細(xì)胞材料。所述上清液在施用前可以經(jīng)過(guò)或者未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化步驟。在游戲的實(shí)例中，所述上清液含有少于IO5個(gè)活細(xì)胞、更優(yōu)選少于104、更優(yōu)選少于IO3以及更優(yōu)選沒(méi)有活細(xì)胞。
[0117]如本文所用，術(shù)語(yǔ)〃正?；蚪】祩€(gè)體〃應(yīng)被理解為是指，經(jīng)任何本領(lǐng)域已知的方法和/或本文所述的方法評(píng)估，未患有胰功能異常的個(gè)體。
[0118]STRO-1iM胞或后代細(xì)胞，以及源自其的上清液或一或多種可溶因子
[0119]STRO-1+細(xì)胞是在骨髓、血液、齒髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨骼、韌帶、腱、骨骼肌、真皮、和骨膜中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞；并且能夠分化成種系如中胚層和/或內(nèi)胚層和/或外胚層。
[0120]在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-1+細(xì)胞是多能細(xì)胞，其能夠分化成很多細(xì)胞類型，包括但不限于，脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織、和纖維結(jié)締組織。這些細(xì)胞所進(jìn)入的具體的譜系定型以及分化途徑取決于來(lái)自以下的各種影響，機(jī)械影響和/或內(nèi)源生物活性因子如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和/或宿主組織所確立的局部微環(huán)境條件。STRO-1+多能細(xì)胞是非造血先祖細(xì)胞，其分化以產(chǎn)生子細(xì)胞，所述子細(xì)胞是會(huì)不可逆地分化以產(chǎn)生表型細(xì)胞的干細(xì)胞或者前體細(xì)胞。
[0121]在優(yōu)選的實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞在得自對(duì)象的樣品中富集，例如要治療的對(duì)象或相關(guān)的對(duì)象或不相關(guān)的對(duì)象(相同或不同的物種)。術(shù)語(yǔ)“富集”或其變體在本文用于描述細(xì)胞群體中一種特定的細(xì)胞類型的比例或者多種特定細(xì)胞類型的比例與未經(jīng)處理的群體相比是增加了的。
[0122]在優(yōu)選的實(shí)例中，用于本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)一或多種標(biāo)記物，其單獨(dú)地或共同地選自由以下組成的組:TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-1、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+、或其任意組合。
[0123]〃單獨(dú)地〃是指本發(fā)明個(gè)別地涵蓋所述的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組，而且，盡管單獨(dú)的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組在本文中可能不是個(gè)別列出的，所附的權(quán)利要求可以分別限定此類標(biāo)記物或標(biāo)記物組并使其彼此可以分開(kāi)。
[0124]〃共同地〃是指本發(fā)明涵蓋了任何數(shù)目或組合的所述標(biāo)記物或標(biāo)記物組，而且，盡管此類數(shù)目或組合的標(biāo)記物或標(biāo)記物組可能未在本文中具體列出，所附的權(quán)利要求可以分別限定此類組合或亞-組合并且使其與其它組合的標(biāo)記物或標(biāo)記物組可以分開(kāi)。
[0125]優(yōu)選所述STRO-1+ 細(xì)胞是 STRO-1bnght (syn.STRO-1b")。優(yōu)選所述 STRO-1bnght 細(xì)胞又是 TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-I~、STR0-2+ 和 / 或 CD146+ 的一或多種。
[0126]在一個(gè)實(shí)例中，所述間充質(zhì)前體細(xì)胞是如W02004/85630中所定義的血管周間充質(zhì)前體細(xì)胞(perivascular mesenchymal precursor cell)。
[0127]細(xì)胞對(duì)于給定的標(biāo)記物被稱作是〃陽(yáng)性"，其可以表達(dá)低水平(1或dim)或高(bright, bri)的該標(biāo)記物，這取決于該標(biāo)記物出現(xiàn)在細(xì)胞表明的程度，其中所述術(shù)語(yǔ)涉及熒光的強(qiáng)度或者用于細(xì)胞分選過(guò)程的其它標(biāo)記物。lo(或dim或dull)與bri的區(qū)別可以根據(jù)正在分選的細(xì)胞上所使用的標(biāo)記物來(lái)理解。細(xì)胞對(duì)于給定的標(biāo)記物被稱作是〃陰性〃，其未必在該細(xì)胞中缺失。此術(shù)語(yǔ)是指該標(biāo)記物由該細(xì)胞以相對(duì)非常低的水平表達(dá)，并且當(dāng)其經(jīng)可探測(cè)地標(biāo)記時(shí)產(chǎn)生非常低的信號(hào)或者在背景水平上不可探測(cè)。
[0128]術(shù)語(yǔ)〃bright〃在用于本文時(shí)是指，細(xì)胞表面上的標(biāo)記物，當(dāng)其經(jīng)可探測(cè)地標(biāo)記時(shí)產(chǎn)生相對(duì)高的信號(hào)。雖然并非要用理論來(lái)進(jìn)行限制，但是據(jù)提議來(lái)說(shuō)〃bright〃細(xì)胞比樣品中的其它細(xì)胞表達(dá)更多的靶標(biāo)記物蛋白(例如由STRO-1識(shí)別的抗原)。例如，當(dāng)用FITC-綴合的STRO-1抗體標(biāo)記由熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析時(shí)，STRO-1b"細(xì)胞比非-bright細(xì)胞(STR0-ldull/dim)產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)。優(yōu)選"bright〃細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中所含有的最明亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0.1%。在其它的實(shí)例中，"bright"細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中所含有的最明亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%、或至少約2%。在優(yōu)選的實(shí)例中，STRO-1fcight細(xì)胞相對(duì)于〃背景〃(即STRO-F細(xì)胞)具有STRO-1表面表達(dá)的21og幅度的更高的表達(dá)。經(jīng)比較，STRO-1dim和/或STR0-產(chǎn)—te細(xì)胞與〃背景〃相比具有stro-〗表面表達(dá)的少于21og幅度的更高的表達(dá)，通常約Ilog或更低。
[0129]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"TNAP"是要涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有同種型。例如，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了肝同種型(LAP)、骨骼同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在優(yōu)選的實(shí)例中，所述TNAP是BAP。在特別優(yōu)選的實(shí)例中，本文所用的TNAP是指可以結(jié)合STR0-3抗體的分子，其中所述抗體是由如下雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的，即2005年12月19日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏于ATCC的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號(hào)為PTA-7282。
[0130]此外，在優(yōu)選的實(shí)例中，所述STRO-1+細(xì)胞能夠引起產(chǎn)克隆CFU-F。
[0131]優(yōu)選所述STRO-1+多能細(xì)胞的很大一部分能夠分化成至少2種不同的種系。所述多能細(xì)胞可以定型的世系的非限制性的例子包括骨前體細(xì)胞；多能的用于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的肝細(xì)胞先祖；神經(jīng)受限細(xì)胞(neural restricted cell),其可產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體(進(jìn)展為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)；進(jìn)展為神經(jīng)元的神經(jīng)元前體；心肌和心肌細(xì)胞的前體，分泌葡萄糖應(yīng)答胰島素的胰β細(xì)胞系。其它世系包括但不限于，成牙質(zhì)細(xì)胞、產(chǎn)牙本質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞、以及如下細(xì)胞的前體:視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞、平滑肌和骨骼肌細(xì)胞、睪丸先祖、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓基、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細(xì)胞、血管、上皮、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0132]在另一個(gè)實(shí)例中，所述STRO-1+細(xì)胞不能在培養(yǎng)后產(chǎn)生造血細(xì)胞。
[0133]在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞取自要治療的對(duì)象，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外培養(yǎng)并用于獲得上清液或可溶因子或擴(kuò)展的細(xì)胞，用于作為自體同源的或同種異源的組合物施用于所述對(duì)象。在另外的實(shí)例中，施用已建立的一或多種人細(xì)胞系的細(xì)胞。在本發(fā)明另一個(gè)有用的實(shí)例中，使用非人動(dòng)物的細(xì)胞(或者如果患者不是人類，則所用細(xì)胞來(lái)自另外的物種)。
[0134]本發(fā)明還涉及得自或源自從體外培養(yǎng)產(chǎn)生的STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞(后者也被稱為擴(kuò)展的細(xì)胞)的所述上清液或可溶因子的用途。本發(fā)明的擴(kuò)展的細(xì)胞可以具有廣泛的不同表型，這取決于培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)目和/或類型)、傳代次數(shù)等。在某些實(shí)例中，所述后代細(xì)胞從親代群體的約2次、約3次、約4次、約5次、約6次、約7次、約8次、約9次、或約10次傳代后所獲得。然而，所述后代細(xì)胞可以從從親代群體的任何次數(shù)的傳代后所獲得。
[0135]所述后代細(xì)胞可以通過(guò)在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而獲得術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)基"，在用于指細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，包括細(xì)胞周?chē)h(huán)境的組分。培養(yǎng)基可以是固體、液體、氣體、或相和材料的混合。培養(yǎng)基包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及不維持細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還包括膠凝狀培養(yǎng)基如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原基質(zhì)。示例性的氣態(tài)培養(yǎng)基包括細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿上或其它固體或半固體支持物上生長(zhǎng)時(shí)所暴露于其中的氣相。術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)基"也是指要用于細(xì)胞培養(yǎng)的材料，即使其還未與細(xì)胞接觸。換言之，制備用于細(xì)菌培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)富集液是培養(yǎng)基。當(dāng)與水或其它液體混合時(shí)就成為適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的粉末混合物可以被稱作"粉末培養(yǎng)
甘"
[0136]在實(shí)例中，可用于本發(fā)明方法的后代細(xì)胞是通過(guò)如下方法獲得的:使用標(biāo)記有STR0-3抗體的磁珠將TNAP+STRO-細(xì)胞從骨髓中分離，然后培養(yǎng)擴(kuò)展此分離的細(xì)胞(對(duì)于適宜培養(yǎng)條件的實(shí)例，參見(jiàn)Gronthos et al.Blood85:929-940，1995)。
[0137]在一個(gè)實(shí)例中，此類擴(kuò)展的細(xì)胞(后代)(優(yōu)選至少5次傳代后)可以是TNAP_、CC9+、HLA I+ 類、HLA Ι 類、CD14' CD19' CD3' CDlla-C' CD31' CD86' CD3[和 / 或 CD80'然而，可能在本文所述的不同培養(yǎng)條件下不同標(biāo)記物的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。而且，雖然這些表型的細(xì)胞可以在所述擴(kuò)展的細(xì)胞中占支配地位，但這不意味著存在少數(shù)比例的細(xì)胞不具有此表型(例如，少數(shù)百分比的所述擴(kuò)展的細(xì)胞可以是CC9—)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，擴(kuò)展的細(xì)胞仍具有分化成不同細(xì)胞類型的能力。
[0138]在一個(gè)實(shí)例中，用于獲得所述上清液或可溶因子、或者細(xì)胞本身的擴(kuò)展細(xì)胞群體，包含的細(xì)胞其中至少25%、更優(yōu)選至少50%的細(xì)胞是CC9+。
[0139]在另一個(gè)實(shí)例中，用于獲得所述上清液或可溶因子、或者細(xì)胞本身的擴(kuò)展細(xì)胞群體，包含的細(xì)胞其中至少40%、更優(yōu)選至少45%的細(xì)胞是STR0-1+。
[0140]在另外的實(shí)例中，所述擴(kuò)展的細(xì)胞可以表達(dá)一或多種標(biāo)記物，所述標(biāo)記物單獨(dú)地或共同地選自由如下組成的組:LFA-3、THY-U VCAM-U ICAM-U PECAM-U P-選擇素、L-選擇素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯(lián)蛋白 β 6-19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STR0-2=瘦素-R)、RANKL, STRO-1bnght和CD146或這些標(biāo)記物的任意組合。
[0141]在一個(gè)實(shí)例中，所述后代細(xì)胞是如W02006/032092中所定義和/或描述的多潛能擴(kuò)展的STRO-1+多能細(xì)胞后代(MEMP)。用于制STRO-1+多能細(xì)胞的富集群體(從其中可以衍生出后代細(xì)胞)的方法在W001/04268和W02004/085630中有描述。在體外的背景下，STRO-1+多能細(xì)胞將很少作為純的制備物存在并且通常將與其它細(xì)胞(組織特異性定型細(xì)胞(TSCC)) —起存在。W001/04268提及了從骨髓中以大約0.1%至90%的純度水平收獲此類細(xì)胞。包含MPC的群體(從其中可以衍生出后代細(xì)胞)可以直接地從組織來(lái)源收獲，或者其可以是已經(jīng)被離體擴(kuò)展的群體。
[0142]例如，所述后代可以得自收獲的、未擴(kuò)展的基本純化的STRO-1+多能細(xì)胞群體，包含其所存在的群體中的至少約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、95%的總細(xì)胞。此水平可以例如通過(guò)如下方式達(dá)到，即選擇對(duì)至少一種標(biāo)記物為陽(yáng)性的細(xì)胞，所述標(biāo)記物單獨(dú)地或共同地選自由如下組成的組:TNAP、STRO-1b "ght、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146 和 STR0-2。
[0143]MEMPS可以與新鮮收獲的STRO-1+多能細(xì)胞區(qū)分，這是在于它們對(duì)標(biāo)記物STRO-1b"是陽(yáng)性而對(duì)標(biāo)記物堿性磷酸酶(ALP)是陰性。相反，新鮮分離的STRO-1+多能細(xì)胞對(duì)于STRO-1b"和ALP均為陽(yáng)性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用的細(xì)胞具有表型STRO-1bπ、ALP'在另外的優(yōu)選實(shí)例中，MEMPS對(duì)一或多種的標(biāo)記物Ki67、CD44和/或⑶49c/⑶29、VLA-3、α 3 β I是陽(yáng)性的。在另外的優(yōu)選實(shí)例中，MEMP不展示出TERT活性和/或?qū)?biāo)記物CD18是陰性的。
[0144]STRO-1+細(xì)胞起始群體可以源自W001/04268或W02004/085630中所述的任意一或多種組織類型，即骨髓、牙髓細(xì)胞、脂肪組織和皮膚、或者或許是更廣泛地來(lái)自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰、骨骼、韌帶、骨髓、腱、和骨骼肌。
[0145]應(yīng)理解在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，對(duì)攜帶有任何給定的細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞所進(jìn)行的分離，可以通過(guò)多種不同的方法實(shí)現(xiàn)，然而，優(yōu)選的方法依賴于結(jié)合劑(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)對(duì)所關(guān)注的標(biāo)記物的結(jié)合，隨后分離那些展現(xiàn)出結(jié)合的(為高水平結(jié)合的、或低水平結(jié)合的或未結(jié)合的)。最方便的結(jié)合劑是抗體或基于抗體的分子，優(yōu)選是單克隆抗體或者基于單克隆抗體，這是由于后面這些物質(zhì)的特異性。兩個(gè)步驟中都可以使用抗體，然而也可使用其它物質(zhì)，因而也可使用這些標(biāo)記物的配體以使攜帶(或缺乏)它們的細(xì)胞富集。
`[0146]抗體或配體可以附著于固體支持物以允許進(jìn)行粗分離。分離技術(shù)優(yōu)選將最大化的保持所要收集級(jí)分的活力。可以使用具有不同效率的各種技術(shù)以獲得相對(duì)粗糙的分離。所使用的具體即使將取決于分離的效率、相關(guān)的細(xì)胞毒性、操作的簡(jiǎn)便和速度、以及成熟裝置和/或?qū)ｉT(mén)的技能的必要性。用于分離的程序可以包括，但不限于磁分離、使用抗體包被的磁珠、親和層析以及用附著至固體基質(zhì)的抗體〃裝盤(pán)(panning)"。提供精確分離的技術(shù)包括但不限于FACS。用于進(jìn)行FACS的方法對(duì)技術(shù)人員是顯見(jiàn)的。
[0147]針對(duì)每個(gè)本文所述標(biāo)記物的抗體是商業(yè)可購(gòu)的(例如，針對(duì)STRO-1的單克隆抗體可以購(gòu)自R&D Systems, USA)、可得自ATCC或其它保藏機(jī)構(gòu)和/或可以用本領(lǐng)域已知的方
法產(chǎn)生。
[0148]優(yōu)選地，用于分離STRO-1+細(xì)胞的方法包括，例如，第一步即使用如磁激活細(xì)胞分選(MACS)的固相分選步驟識(shí)別STRO-1高水平的表達(dá)。如果需要的話，隨后可以是第二個(gè)分選步驟，以產(chǎn)生高水平的前體細(xì)胞表達(dá)，如專利說(shuō)明書(shū)W001/14268中所述。此第二分選步驟可能涉及使用一或多種標(biāo)記物。
[0149]獲得STRO-1+細(xì)胞的方法還可以在第一個(gè)富集步驟前包括使用已知技術(shù)收集細(xì)胞的來(lái)源。從而可以如外科手術(shù)般地去除組織。含有來(lái)源組織的細(xì)胞將會(huì)被分離至所謂的單一細(xì)胞懸液。可以通過(guò)物理的或者酶的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)此分離。
[0150]一旦獲得了適宜的STRO-1+細(xì)胞群體，可以用適宜的手段將其培養(yǎng)或擴(kuò)展以獲得MEMP。
[0151]在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞取自要治療的對(duì)象，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外培養(yǎng)并用于獲得所述上清液或可溶因子或擴(kuò)展的細(xì)胞，用于作為自體同源的或同種異源的組合物施用于所述對(duì)象。在另外的實(shí)例中，使用已建立的一或多種人細(xì)胞系的細(xì)胞來(lái)獲得所述上清液或可溶因子。在本發(fā)明另一個(gè)有用的實(shí)例中，使用非人動(dòng)物的細(xì)胞(或者如果患者不是人類，則所用細(xì)胞來(lái)自另外的物種)以獲得所述上清液或可溶因子.[0152]本發(fā)明的施行可以使用來(lái)自任何非人動(dòng)物物種的細(xì)胞，包括但不限于非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞、有蹄動(dòng)物、犬類、貓類、兔類、嚙齒類、禽類、和魚(yú)類細(xì)胞。可用來(lái)實(shí)行本發(fā)明的靈長(zhǎng)類細(xì)胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、和任何其它新舊大陸的猴類的細(xì)胞。可用來(lái)實(shí)行本發(fā)明的有蹄類細(xì)胞包括但不限于牛類、豬類、棉羊類、山羊類、馬類、水牛和野牛的細(xì)胞?？捎脕?lái)實(shí)行本發(fā)明的嚙齒類細(xì)胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、和沙鼠細(xì)胞?？捎脕?lái)實(shí)行本發(fā)明的兔類物種的實(shí)例包括但不限于家兔、長(zhǎng)腿野兔(jack rabbit)、野兔、棉尾兔、雪鞋兔(snowshoe rabbit)、和鼠兔(pika)。雞(Gallus gallus)是可用來(lái)實(shí)行本發(fā)明的禽類物種的實(shí)例。
[0153]可用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞可以在使用前進(jìn)行儲(chǔ)存，或者在獲得所述上清液或可溶因子前進(jìn)行儲(chǔ)存。用于保存和儲(chǔ)藏真核細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的方法和方案，是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，Pollard, J.W.and Walker, J.Μ.(1997)Basic Cell CultureProtocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R.1.(2000) Cultureof Animal Cells, Fourth Edition, ffiley-Liss, Hoboken, N.J.) ? 保持分離的干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞/先祖細(xì)胞、或其后代的生物學(xué)活性的任何方法，都可以與本發(fā)明聯(lián)用。在優(yōu)選的實(shí)例中，使用冷凍保存來(lái)維持和儲(chǔ)藏細(xì)胞。
[0154]經(jīng)遺傳改誥的細(xì)朐
[0155]在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞是經(jīng)過(guò)遺傳改造的，例如改造為表達(dá)和/或分泌感興趣的蛋白質(zhì)，例如提供治療和/或預(yù)防益處的蛋白，如胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶，或者關(guān)聯(lián)或引起增強(qiáng)的血管發(fā)生的`多肽，或者與細(xì)胞分化成胰細(xì)胞或血管細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的多肽。
[0156]用于遺傳改造細(xì)胞的方法對(duì)技術(shù)人員是顯見(jiàn)的。例如，把要在細(xì)胞中表達(dá)的核酸可操縱地連接至用于誘導(dǎo)在細(xì)胞中的表達(dá)啟動(dòng)子。例如，將核酸連接至可在對(duì)象的多種細(xì)胞中操作的啟動(dòng)子，如例如，病毒啟動(dòng)子如CMV啟動(dòng)子(例如CMV-1E啟動(dòng)子)或SV-40啟動(dòng)子。另外的適宜啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并且應(yīng)該認(rèn)為其經(jīng)必要的修改可適用于本發(fā)明的實(shí)例。
[0157]優(yōu)選以表達(dá)構(gòu)建體的形式提供核酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)〃表達(dá)構(gòu)建體〃是指核酸，其具有在細(xì)胞中表達(dá)其所可操縱地連接的核酸(例如報(bào)道基因和/或反選擇性報(bào)道基因)的能力。在本發(fā)明的背景中，應(yīng)理解表達(dá)構(gòu)建體可以含有或者本身就是質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組-或基因組-片段、或者其它能夠以可表達(dá)的形式保持和/或復(fù)制異源DNA的核酸。
[0158]構(gòu)建用于實(shí)行本發(fā)明的適宜表達(dá)構(gòu)建體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯見(jiàn)的，并且在例如 Ausubel et al(In:Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN047150338, 1987)或 Sambrook et al (In:MolecularCloning:Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories, New York, Third Edition2001)中有描述。例如，使用如PCR從適宜的模板核酸擴(kuò)增表達(dá)構(gòu)建體的每個(gè)組分，并隨后將其克隆至適宜的表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)，如例如質(zhì)粒或噬菌粒。
[0159]適宜于此種表達(dá)構(gòu)建體的載體是本領(lǐng)域已知的和/或在本文有描述。例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中適用于本發(fā)明方法的表達(dá)載體為，例如，由Invitrogen供應(yīng)的pcDNA載體套件的載體、PCI載體套件的載體(Promega)、pCMV載體套件的載體(Clontech)、pM載體(Clontech)、pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontech)或 pcDNA 載體套件的載體(Invitrogen)。
[0160]技術(shù)人員會(huì)知道另外的載體和此類載體的來(lái)源，如例如InvitrogenCorporation、Clontech 或 Promega0
[0161]用于將分離的核酸或者含有其的基因構(gòu)建體引入到細(xì)胞內(nèi)以表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。用于給定生物體的技術(shù)取決于已知的成功技術(shù)。用于將重組DNA引入細(xì)胞的方法包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染如微粒轟擊脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA)，PEG-介導(dǎo)的 DNA 攝取、電穿孔和微粒轟擊如微粒轟擊DNA-包被的鶴或金顆粒(Agracetus Inc., WI, USA)等。
[0162]或者，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體是病毒載體。適宜的病毒載體是本領(lǐng)域已知的和商業(yè)可購(gòu)的。常規(guī)的用于遞送核酸以及將該核酸整合至宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的基于病毒的系統(tǒng)包括，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體，或者腺伴隨病毒載體?；蛘?，腺病毒載體可用于將保持游離的核酸引入到宿主細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)載體是將基因轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞和組織的有效且通用的方法。此外，已經(jīng)在許多種不同細(xì)胞類型和靶組織中觀測(cè)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0163]例如，反轉(zhuǎn)錄病毒`載體通常包含順式作用長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，具有對(duì)外源序列高達(dá)6-10kb的組裝容量。最小的順式作用LTR就足以復(fù)制和組裝載體，其被用于將表達(dá)構(gòu)建體整合至靶細(xì)胞內(nèi)以提供長(zhǎng)期的表達(dá)。廣泛使用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括那些基于小鼠白血病病毒(MuLV)、長(zhǎng)臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、以及其組合的載體(參見(jiàn)例如，Buchscher et al.，JVirol.56:2731-2739(1992);Johann et al, J.Virol.65:1635-1640(1992);Sommerfelt et al, Virol.76:58-59(1990);Wilson et al, J.Virol.63:274-2318(1989);Milleret al., J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700;Miller and Rosman BioTechniques7:980-990, 1989;Miller, A.D.Human Gene Therapy7:5-14, 1990;Scarpa et alVirology75:849-852, 1991;Burns et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA90:8033-8037，1993)。
[0164]各種腺伴隨病毒(AAV)載體系統(tǒng)也被開(kāi)發(fā)用于核酸遞送。AAV載體可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)輕易地構(gòu)建。參見(jiàn)例如，U.S.Pat.N0.5，173，414和5，139，941;International Publication N0.W092/01070 和 W093/03769;Lebkowski etal.Molec.Cell.Biol.5:3988-3996, 1988;Vincent et al.(1990)Vaccines90(Cold SpringHarbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology5:533-539, 1992;Muzyczka.Current Topics in Microbiol, and Immunol.158:97-129，1992;Kotin, HumanGene Therapy5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy7:165-169, 1994;以及Zhou et al.J Exp.Med.179:1867—1875，1994。
[0165]可用于遞送本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的另外的病毒載體包括，例如，源自痘家族病毒的那些，如牛痘病毒和禽痘病毒或者甲病毒或綴合病毒載體(例如Fisher-Hoch etal., Proc.Natl Acad.Sc1.USA56:317-321，1989 中所述的)。
[0166]測(cè)定細(xì)胞和可溶因子的治療/預(yù)防潛力
[0167]用于確定細(xì)胞或可溶因子治療或防止或延緩胰功能異常的發(fā)作或進(jìn)展的能力的方法對(duì)于技術(shù)人員將是顯見(jiàn)的。
[0168]例如，將細(xì)胞或可溶因子(例如，因子的混合物或單一的因子或因子的部分(例如，源自親和性純化或?qū)游龅?)施用于測(cè)試對(duì)象(例如測(cè)試動(dòng)物)一段時(shí)間并且是在某些條件下，從而足以提供治療性/預(yù)防性的益處，并且評(píng)估休眠或基礎(chǔ)或禁食的葡萄糖水平和/或進(jìn)行葡萄糖耐受測(cè)試。使用商業(yè)可購(gòu)的試劑盒和/或設(shè)備來(lái)進(jìn)行此類測(cè)試。基礎(chǔ)或禁食葡萄糖水平在禁食后進(jìn)行評(píng)估，例如，進(jìn)行大約8至大約14小時(shí)。對(duì)于葡萄糖耐受測(cè)試，將對(duì)象禁食大約8至大約14小時(shí)然后消耗葡萄糖(例如，每千克體重大約1.75克的葡萄糖)并在大約2至3小時(shí)后評(píng)估葡萄糖的血液水平。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization),禁食血衆(zhòng)葡萄糖應(yīng)該是低于6.lmmol/1 (100mg/dl)。介于6.1和7.0mmol/1 (100和126mg/dl)之間的禁食水平是臨界(〃受損禁食糖血〃)，而反復(fù)處于或高于7.0mmol/1 (126mg/dl)的禁食水平是糖尿病的診斷。2小時(shí)葡萄糖水平應(yīng)該低于
7.8mmol/l (140mg/dl)。介于此水平和11.lmmol/1 (200mg/dl)之間的水平表明受損的葡萄糖耐受。在2小時(shí)的葡萄糖水平高于11.lmmol/1 (200mg/dl)確認(rèn)了糖尿病的診斷。
[0169]優(yōu)選所述測(cè)試對(duì)象患有胰功能異常。例如，所述測(cè)試對(duì)象是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(I型糖尿病的模型)或者施用了鏈脲菌素的小鼠或大鼠(I型和/或II型糖尿病的模型；參見(jiàn) Liikic et al., Developmental Immunol.6:119-128，1998 和 Arulmozhi etal., Indian J.Pharmacol., 36:217-221，2004), Goto Kakizaki (GK)大鼠(II 型糖尿病的模M ), New Zealand Obese (NZO)小鼠(II型糖尿`病的模型)。其它I型和/或II型糖尿病的模型在例如，Rees and Alcolado, Diabet.Med.22:359-70，2005 中有描述。
[0170]在此種胰功能異常模型中與未經(jīng)治療的動(dòng)物或治療前的測(cè)試對(duì)象相比降低基礎(chǔ)葡萄糖水平和/或改善葡萄糖耐受的細(xì)胞和/或可溶因子被認(rèn)為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發(fā)作或進(jìn)展。
[0171]作為選擇，或者此外，對(duì)測(cè)試對(duì)象的循環(huán)中的胰島素水平進(jìn)行評(píng)估，例如，使用酶聯(lián)-或熒光聯(lián)-免疫吸附測(cè)定。在測(cè)試對(duì)象的循環(huán)中提高胰島素水平的細(xì)胞和/或可溶因子被認(rèn)為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發(fā)作或進(jìn)展。
[0172]用于確定血清胰高血糖素和促生長(zhǎng)素抑制素水平的試劑盒和測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的和 / 或商業(yè)可購(gòu)，例如，來(lái)自 Immuno-Biological Laboratories, Inc 或 MilliporeCorporation 的。
[0173]作為選擇，或者此外，淀粉酶的血清水平是用色度測(cè)定法確定的，例如，如Caraway, Am.J.Clin.Pathol.，32:97-99，1959中所述，或者用熒光測(cè)定來(lái)確定，例如，如Rinderknecht and Marbach, Clin.Chem.Acta., 29:107-110，1972 中所述的。將血清淀粉酶水平維持在正常水平(例如，21-101U/L)的因子或細(xì)胞被認(rèn)為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發(fā)作或進(jìn)展。[0174]淀粉酶水平還可以在胰切片中或在胰液中確定，例如，由經(jīng)葉二指腸插管獲得的。這些樣品還提供了用于測(cè)量胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶水平的樣品。例如，Connon et al., Digestive Diseases andSciences, 23:472-475，1978描述了用于確定胰液中胰脂肪酶水平的測(cè)定法。
[0175]前段中所描述的測(cè)定法還適于對(duì)接受本文中根據(jù)任何實(shí)例所述治療的對(duì)象實(shí)行進(jìn)行中的監(jiān)測(cè)。
[0176]根據(jù)前文，對(duì)于技術(shù)人員顯見(jiàn)的是，本發(fā)明還提供了對(duì)用于治療胰功能異常的細(xì)胞或可溶因子進(jìn)行鑒定或分離的方法，所述方法包括:
[0177](i)向患有胰功能異常的測(cè)試對(duì)象施用細(xì)胞或可溶因子并評(píng)估該對(duì)象的胰功能；
[0178](ii)將(i)中所述對(duì)象的胰功能，與患有胰功能異常但并未施用所述細(xì)胞或可溶因子的對(duì)照對(duì)象的胰功能進(jìn)行比較，
[0179]其中所述測(cè)試對(duì)象中與對(duì)照對(duì)象相比改善了的胰功能表明該細(xì)胞或可溶因子治療緩胰功能異常。
[0180]本發(fā)明還提供了對(duì)用于防止或延緩胰功能異常的細(xì)胞或可溶因子進(jìn)行鑒定或分離的方法，所述方法包括:
[0181](i)向測(cè)試對(duì)象施用細(xì)胞或可溶因子并繼而在該測(cè)試對(duì)象中誘導(dǎo)胰功能異常；
[0182](ii)將(i)中所述對(duì)象的胰功能，與患有胰功能異常但并未施用所述細(xì)胞或可溶因子的對(duì)照對(duì)象的胰功能進(jìn)行比較，
[0183]其中所述測(cè)試對(duì)象中與對(duì)照對(duì)象相比改善了的胰功能表明該細(xì)胞或可溶因子防止或延緩胰功能異常的發(fā)作。`
[0184]所述細(xì)胞可以是本文中根據(jù)任何實(shí)例所描述的任何細(xì)胞。
[0185]細(xì)朐纟目合物
[0186]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞以組合物的形式施。優(yōu)選此種組合物包含藥物可接受載體和/或賦形劑。
[0187]術(shù)語(yǔ)〃載體〃和〃賦形劑〃是指物質(zhì)的組合物，其在本領(lǐng)域中被常規(guī)用于促進(jìn)活性化合物的儲(chǔ)存、施用、和/或生物活性(參見(jiàn)例如，Remington’s PharmaceuticalSciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)。載體還可以降低所述活性化合物的任何不期望的副作用。適宜的載體例如是穩(wěn)定的，如不能與載體中的其它成分反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，所述載體在用于治療的劑量和濃度不會(huì)再接受者中產(chǎn)生顯著的局部或全身性副作用。
[0188]適于本發(fā)明的載體包括常規(guī)使用的那些，例如，水、鹽水、水成葡聚糖、乳糖、Ringer溶液、緩沖溶液、透明質(zhì)酸和乙二醇是優(yōu)選的液體載體，特別是對(duì)于溶液而言(當(dāng)?shù)葷B時(shí))。適宜的藥物載體和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸那、單硬脂酸甘油鹽/酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、
乙醇等。
[0189]在另一個(gè)實(shí)例中，載體是介質(zhì)組合物，例如，細(xì)胞在其中生長(zhǎng)或懸浮。優(yōu)選此種介質(zhì)組合物不會(huì)在其所施用的對(duì)象中誘導(dǎo)任何副作用。
[0190]優(yōu)選的載體和賦形劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活力和/或細(xì)胞降低、防止或延緩胰功能異常的能力帶來(lái)不利的影響。[0191]在一個(gè)實(shí)例中，所述載體或賦形劑提供緩沖活性以將所述細(xì)胞和/或可溶因子維持在適宜的PH，由此發(fā)揮生物學(xué)活性，例如，所述載體或賦形劑是磷酸緩沖鹽水(PBS)。PBS是有吸引力的載體或賦形劑，因?yàn)槠渥畹拖薅鹊呐c細(xì)胞和因子相互作用并且允許細(xì)胞和因子的快速釋放，在此種情況中，本發(fā)明的組合物可以被生產(chǎn)為液體以直接應(yīng)用于血流或者進(jìn)入組織或環(huán)繞或鄰近組織的區(qū)域，例如通過(guò)注射。
[0192]還可以將STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞摻入或插入支架內(nèi)，所述支架是接受者相容性的并且降解成對(duì)接受者無(wú)害的產(chǎn)物。這些支架向要移植入接受者對(duì)象中的細(xì)胞提供支持和保護(hù)。此類支架的實(shí)例有天然的和/或合成的生物可降解支架。
[0193]多種不同的支架可以成功的用于本發(fā)明的實(shí)踐。優(yōu)選的支架包括但不限于生物的、可降解的支架。天然生物可降解支架包括，膠原、纖連蛋白、和層粘連蛋白支架。用于細(xì)胞移植支架的適宜的合成材料應(yīng)該能夠支持廣泛的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞功能。此種支架還可以是可吸收的。適宜的支架包括聚乙醇酸支架，例如Vacanti, et al.J.Ped.Surg.23:3-91988; Cima, et al.Biotechnol.Bioeng.38:1451991; Vacanti, et al.Plast.Reconstr.Surg.88:753-91991中所描述的；或者合成聚合物如聚酐、多正酯類、和聚乳酸。
[0194]在另一個(gè)實(shí)例中，所述細(xì)胞可以在凝膠支架中施用(如來(lái)自Upjohn Company的Gelfoam)。
[0195]可用于本發(fā)明的細(xì)胞組合物可以單獨(dú)施用或者作為與其它細(xì)胞的摻合物來(lái)施用?？梢耘c本發(fā)明的組合物協(xié)同施用的細(xì)胞包括但不限于，其它多能或多潛能細(xì)胞或干細(xì)胞、或者骨髓細(xì)胞。不同類型的細(xì)胞可以在施用前才即時(shí)與本發(fā)明的組合物摻和，或者可以在施用前將它們一起共培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0196]優(yōu)選所述組合物包含有效量的或者治療或預(yù)防有效量的細(xì)胞。例如，所述組合物包含大約IxlO5個(gè)STRO-1+細(xì)胞/kg至大約IxlO7個(gè)STRO-1+細(xì)胞/kg或者大約IxlO6個(gè)STRO-1+細(xì)胞/kg至大約5xl06個(gè)STRO-1+細(xì)胞/kg。要施用的細(xì)胞的確切量取決于多種因素，包括患者的年齡、重量、和性別，以及胰功能異常的程度和嚴(yán)重性。
`[0197]在一些實(shí)例中，將細(xì)胞包含在室內(nèi)使得該細(xì)胞不能進(jìn)入對(duì)象的循環(huán)，然而該室卻允許所述細(xì)胞分泌的因子進(jìn)入循環(huán)。以此方式，可以通過(guò)允許細(xì)胞將因子分泌至對(duì)象的循環(huán)內(nèi)從而將可溶因子施用于該對(duì)象。此種室同樣可以被植入對(duì)象中的部位以提高所述可溶因子的局部水平，例如植入胰內(nèi)或其附近。
[0198]在本發(fā)明的一些實(shí)例中，可能無(wú)須或者不期望在開(kāi)始用細(xì)胞組合物治療前對(duì)患者進(jìn)行藥理學(xué)的免疫阻抑。因此，在某些情況中移植同種異源或者甚至是異種異源的STRO-1+細(xì)胞或其后代是可以耐受的。
[0199]然而，其它情況中，在開(kāi)始細(xì)胞治療前對(duì)患者進(jìn)行藥理學(xué)的免疫阻抑是期望的或者適當(dāng)?shù)?。這可以通過(guò)使用全身性的或局部的免疫阻抑劑來(lái)完成，或者可以通過(guò)在包囊化的裝置里遞送細(xì)胞來(lái)完成?？蓪⑺黾?xì)胞包囊在膠囊中，所述膠囊對(duì)于細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣以及治療因子是可滲的而該細(xì)胞對(duì)于免疫體液因子和細(xì)胞是不可滲的。優(yōu)選包囊材料是低變應(yīng)原性的、容易且穩(wěn)定地位于靶標(biāo)組織中、并且對(duì)植入的結(jié)構(gòu)提供增加的保護(hù)。用于降低或消除對(duì)移植細(xì)胞的免疫應(yīng)答的這些以及其它方法是本領(lǐng)域已知的。作為選擇，可以將細(xì)胞遺傳改造以降低其免疫原性。
[0200]可溶因子的組合物[0201]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，源自STRO-1+細(xì)胞和/或后代細(xì)胞的上清液或可溶因子以組合物的形式施用，例如，包含適宜的載體和/或賦形劑。優(yōu)選所述載體或賦形劑不會(huì)對(duì)所述可溶因子或上清液的生物學(xué)作用帶來(lái)不利影響。
[0202]在一個(gè)實(shí)例中，所述組合物包含物質(zhì)的組合以使可溶因子或上清液的成分穩(wěn)定，例如，蛋白酶抑制劑。優(yōu)選所包含的蛋白酶抑制劑的量不足以給對(duì)象帶來(lái)不利影響。
[0203]含有源自STRO-1+細(xì)胞和/或后代細(xì)胞的上清液或可溶因子的組合物可以被制成適當(dāng)?shù)囊后w懸濁液，例如，在培養(yǎng)基中或者在穩(wěn)定的載體或緩沖溶液中，例如，磷酸緩沖鹽水。適宜的載體在本文上文中有描述。在另一個(gè)實(shí)例中，含有源自STRO-1+細(xì)胞和/或后代細(xì)胞的上清液或可溶因子的懸濁液是用于注射的油懸濁液。適宜的親酯溶劑或媒介物(vehicle)包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯類；或脂質(zhì)體。用于注射的懸濁液還可以含有提高該懸濁液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或葡聚糖。任選地，懸濁液還可以含有適宜的穩(wěn)定劑或提高混合物溶解度的物質(zhì)以使得可以制備高濃度溶液。
[0204]可以通過(guò)將所需量的上清液或可溶因子摻入到適當(dāng)?shù)娜軇?根據(jù)需要具有一種或一組上述的成分)中，從而制備無(wú)菌的可注射溶液，隨后進(jìn)行過(guò)濾消毒。
[0205]通常，通過(guò)將所述上清液或可溶因子摻入到無(wú)菌的媒介物中而制備分散體，所述媒介物含有堿性分散介質(zhì)以及所需的其它成分(如上所列舉的)。在用無(wú)菌粉末制備無(wú)菌可注射溶液的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，其從先前經(jīng)過(guò)濾消毒的溶液產(chǎn)生所述活性成分加上另外所期望成分的粉末。根據(jù)本發(fā)明的作為選擇的方面，所述上清液或可溶因子可以與一或多種增強(qiáng)其可溶性的額外的化合物一起配制。
[0206]其它示例性的載體或賦形劑在如下中有描述，例如Hardman, et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork, N.Y.;Gennaro(2000)Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wil`kins, New York, N.Y.; Avis, et al.(eds.) (1993)PharmaceuticalDosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker,NY;Lieberman, et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY;Lieberman, etal.(eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms!Disperse Systems,MarceIDekker, NY;Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,MarcelDekker, Inc., New York, N.Y0
[0207]治療性組合物通常應(yīng)該是無(wú)菌的以及在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定的。組合物可被配制成溶液、微乳劑、脂質(zhì)體、或其它有序的結(jié)構(gòu)。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)、以及其適宜的混合物。可以通過(guò)如下來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如通過(guò)使用包被如卵磷脂、在分散體的情況中通過(guò)保持所需的顆粒大小、以及通過(guò)使用表面活性劑。在很多情況中，會(huì)優(yōu)選在之外中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。可以通過(guò)在組合物中包含延緩吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鹽和明膠從而使可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。此外，可以在緩釋配制物中施用所述可溶因子，例如在包含緩釋聚合物的組合物中?；钚曰衔锟梢耘c保護(hù)該化合物以免快速釋放的載體一起制備，如控釋配制物，包括植入和微囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菥酆衔铮缫蚁┐姿嵋蚁?、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備此類配制物的許多方法已獲得專利或者通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0208]所述上清液或可溶因子可以與適當(dāng)?shù)幕|(zhì)組合施用，例如用于使所述可溶因子的緩釋。
[0209]組合物的另外的成分
[0210]所述源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代可與其它有益的藥物或生物分子(生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子)一起施用。當(dāng)與其它物質(zhì)一起施用時(shí)，它們可以與所述其它物質(zhì)在單一的藥物組合物中一起施用、或者在分別的藥物組合物中施用、同時(shí)或者順序施用(在施用所述其它物質(zhì)之前或之后)?？梢怨彩┯玫纳锘钚砸蜃影沟蛲鰟?例如，EPO、EPO模擬抗體(mimetibody)、TPO、IGF-1和IGF-1I, HGF、胱天蛋白酶抑制劑);抗炎劑(例如，P38MAPK抑制、TGF-β抑制劑、抑制素、IL-6和IL-1抑制劑、PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIR0UMUS、和 NSAID (非甾體抗炎藥物；例如，TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPR0FEN);免疫阻抑/免疫調(diào)節(jié)劑(例如，鈣神經(jīng)素抑制劑如環(huán)孢菌素、他羅利姆；mT0R抑制劑(例如，SIROUMUS、EVER0LIMUS);抗增殖劑(例如，硫唑嘌呤、嗎替麥考酚酯)；皮質(zhì)類固醇類(例如，潑尼松龍、氫化可的松)；抗體如單克隆抗-1L-2Ra受體抗體(例如，巴利昔單抗、達(dá)克珠單抗)、多克隆抗-T-細(xì)胞抗體(例如，抗-胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG);抗-淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG);單克隆抗-T細(xì)胞抗體0KT3));抗-血栓形成劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack (右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗-凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫、魚(yú)精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑、以及血小板抑制劑)；和抗-氧化劑例如，普羅布可、維生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉劑。
[0211]在一個(gè)實(shí)例中，如本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的組合物包含用于治療或預(yù)防胰功能異常的額外的因子。例如，該組合物包含雙縮胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、苯甲酸衍生物、α -葡糖苷酶抑制劑、SGLT2抑制劑、和INGAP肽、二肽肽酶-1V抑制劑、胰島素致敏物(例如，PPAR激動(dòng)劑或雙縮胍)、胰島素、胰島素模擬物、胰高血糖素受體拮抗劑、GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1受體激動(dòng)劑；GIP、GIP模擬物、GIP受體激動(dòng)劑、PACAP、PACAP模擬物、PACAP受體3激動(dòng)劑；膽固醇降低劑(例如，HMG-CoA還原酶抑制劑、多價(jià)螯合劑、煙醇、煙酸)、PPAR α/gamma雙重激動(dòng)劑或抗-肥胖化合物。
[0212]在另一個(gè)實(shí)例中，如本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的組合物另外包含誘導(dǎo)或增強(qiáng)先祖細(xì)胞分裂成胰細(xì)胞的因子。示例性的因子包括，fct、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或 TGF β。
[0213]在另一個(gè)實(shí)例中，如本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的組合物另外包含誘導(dǎo)或增強(qiáng)先祖細(xì)胞分裂成血管細(xì)胞的因子。示例性的因子包括，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、源自血小板的生長(zhǎng)因子O3DGF;例如，PDGF-BB)、以及FGF。
[0214]在另一個(gè)實(shí)例中，如本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的組合物另外包含組織特異性定型細(xì)胞(TSCC)。對(duì)于這個(gè)，International Patent Application N0.PCT/AU2005/001445證明了施用TSCC和STRO-1+細(xì)胞可以導(dǎo)致TSCC的增殖增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)例中，TSCC是胰細(xì)胞，例如β細(xì)胞或胰細(xì)的混合物，例如朗格漢斯胰島。向?qū)ο笫┯么私M合物可以導(dǎo)致例如β細(xì)胞胰島的產(chǎn)生增加。在另一個(gè)實(shí)例中，TSC是血管細(xì)胞。向?qū)ο笫┯么私M合物可以導(dǎo)致脈管系統(tǒng)的產(chǎn)生增加，例如，在胰中增加，例如，導(dǎo)致遞送到胰的營(yíng)養(yǎng)增加。
[0215]醫(yī)療設(shè)各
[0216]本發(fā)明還提供了用于本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的方法(或在所述方法中使用時(shí))的醫(yī)療設(shè)備。例如，本發(fā)明提供了注射器或?qū)Ч芑蚱渌m宜的遞送設(shè)備，其中包含STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子和/或本發(fā)明的組合物。任選地，所述注射器或?qū)Ч馨b有使用說(shuō)明書(shū)用本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的方法。
[0217]在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了植入物，其包含STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子和/或本發(fā)明的組合物。任選地，所述植入物包裝有使用說(shuō)明書(shū)用本文根據(jù)任何實(shí)例所描述的方法。適宜的植入物可以由支架(例如，如本文上文中所描述的)以及STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子所形成。
[0218]施用的方式
[0219]源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代可經(jīng)手術(shù)植入、注射、遞送(例如，通過(guò)導(dǎo)管或注射器的方式)、或者另外可以直接或間接地施用于需要修復(fù)或加強(qiáng)的部位如胰、或者進(jìn)入對(duì)象的血液系統(tǒng)。
[0220]優(yōu)選所述的源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代被遞送至對(duì)象的血液系統(tǒng)。例如，所述的源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代被腸胃外遞送。示例性的腸胃外施用途徑包括，但不限于腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)。優(yōu)選所述的源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)遞送至大動(dòng)脈內(nèi)、遞送至心臟的心房或心室內(nèi)、或者遞送至與胰連接的血管，例如腹部大動(dòng)脈、上腸系膜動(dòng)脈、胰十二指腸動(dòng)脈或脾動(dòng)脈。在另外的實(shí)例中，將源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+`細(xì)胞或其后代施用于股動(dòng)脈腹腔動(dòng)脈。
[0221]在細(xì)胞遞送至心臟的心房或心室的情況中，優(yōu)選將細(xì)胞施用于左心房或心室以避免由細(xì)胞快速遞送至肺部所帶來(lái)的并發(fā)癥。
[0222]優(yōu)選所述的源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代被注射至遞送部位，例如使用注射器或者通過(guò)導(dǎo)管或中心靜脈導(dǎo)線。
[0223]選擇用于治療配制物的施用方案取決于幾個(gè)因素，包括該實(shí)體的血清或組織周轉(zhuǎn)率、癥狀的水平、以及該實(shí)體的免疫原性。優(yōu)選地，施用方案將遞送至患者的治療化合物的量最大化并與可接受的水平的副作用相協(xié)調(diào)。因此，所遞送的配制物的量部分取決于特定的實(shí)體以及要治療的病癥的嚴(yán)重性。
[0224]在一個(gè)實(shí)例中，源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代被作為單一的丸劑遞送。或者，源自STRO-1+細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細(xì)胞或其后代通過(guò)連續(xù)的灌輸而施用，或者通過(guò)例如I天、I周、或每周1-7次的間隔來(lái)給藥。優(yōu)選的給藥方案涉及避免了顯著的不期望副作用的最大劑量或給藥頻率。每周的總劑量取決于所使用化合物的類型和活性。適當(dāng)?shù)膭┝坑膳R床醫(yī)師確定，例如，使用本領(lǐng)域中已知或者懷疑會(huì)影響治療或者預(yù)計(jì)會(huì)影響治療的參數(shù)。通常，以稍低于最佳劑量的劑量開(kāi)始，之后以小的增量增加直至達(dá)到期望的效果或者相對(duì)于任何負(fù)面的副作用的最佳效果。重要的診斷量度包括糖尿病癥狀的那些。
[0225]根據(jù)本發(fā)明用于治療或延緩胰功能異常的進(jìn)展的實(shí)例，優(yōu)選在對(duì)病癥的診斷后施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子，例如使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法和/或本文所述的方法來(lái)診斷，例如葡萄糖耐受。
[0226]對(duì)于那些用于預(yù)防或延緩胰功能異常的發(fā)作的實(shí)例，優(yōu)選在病癥的臨床診斷前施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子，例如，當(dāng)對(duì)象患有受損葡萄糖耐受和/或受損的禁食糖血時(shí)，和/或在自身免應(yīng)答之前的或伴有自身免應(yīng)答的I型糖尿病的情況，如由T細(xì)胞群體和/或B細(xì)胞群體的擴(kuò)展所指示出的和/或由自身抗體的產(chǎn)生所指示出的(例如，在I型糖尿病的發(fā)作或進(jìn)展中針對(duì)胰胰島細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì)胞的擴(kuò)展和/或針對(duì)一或多種胰β_胰島細(xì)胞標(biāo)記物的自身抗體的擴(kuò)展)。用于對(duì)自身免疫應(yīng)答的發(fā)作進(jìn)行確定或預(yù)測(cè)的方法對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯見(jiàn)的和/或在本文中有描述。例如，檢測(cè)到針對(duì)源自胰細(xì)胞或在胰細(xì)胞表面的抗原自身抗體，表明了對(duì)象針對(duì)所述細(xì)胞的免疫應(yīng)答。一種此類測(cè)定檢測(cè)對(duì)象血清中的胰島細(xì)胞抗體。此測(cè)定包括使含有胰島細(xì)胞的胰的切片接觸來(lái)自測(cè)試對(duì)象的血清。繼而用結(jié)合人免疫球蛋白的經(jīng)標(biāo)記的二抗來(lái)檢測(cè)來(lái)自對(duì)象的血清中的免疫球蛋白(其能夠結(jié)合胰β_胰島細(xì)胞)。用于檢測(cè)胰島細(xì)胞抗體的適宜的方法(其中使用熒光標(biāo)記物)在例如Bottazzo et al，Lancet2:1279-83，1974中有描述。作為選擇，或者此外，使用測(cè)定法來(lái)檢測(cè)結(jié)合對(duì)象中特定抗原的自身抗體。舉例來(lái)說(shuō)，Brooking et al.(Clin Chim Acta331:55-59，2003)描述了基于 ELISA 的測(cè)定法，用于檢測(cè)針對(duì)GAD65的自身抗體。所描述的測(cè)定法在微量滴定平板上使用低濃度的GAD抗原以捕獲樣品中的自身抗體。加入液態(tài)的生物素化GAD并且其被自身抗體的第二結(jié)合位點(diǎn)所捕獲，而且被檢測(cè)到產(chǎn)生非同位素的可探測(cè)信號(hào)的是經(jīng)生物素化的GAD65。Nagata etal, Ann.New York AcacL Scil037:10-15，2004 描述了 ELISPOT 測(cè)定法，其可用于檢測(cè)針對(duì)胰島素、IA-2和GAD65的自身抗體的存在。
[0227]用于監(jiān)測(cè)治療/預(yù)防的方法
[0228]用于監(jiān)測(cè)治療/預(yù)防的方法在本說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將會(huì)是很顯然的。例如，血液葡萄糖水平和/或胰島素水平和/或淀粉酶水平用本領(lǐng)域公知的方法和/或本文所述的方法進(jìn)行評(píng)估`。
[0229]在另一個(gè)實(shí)施例中，在處理之后獲得胰的樣品(例如，活組織檢查)，以及β細(xì)胞(例如，表達(dá)胰島素的細(xì)胞)和/或α細(xì)胞(例如，表達(dá)胰高血糖素的細(xì)胞)和/或胰島和/或PDX-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目，例如使用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、或核酸擴(kuò)增測(cè)定法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。此類測(cè)定法在本文中有描述。
[0230]本發(fā)明將在下述非限制性的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
[0231]實(shí)施例1
[0232]用STRO-1+細(xì)胞治療糖尿病小鼠
[0233]1.1材料和方法
[0234]小鼠中鏈脲菌素(STZ)-誘導(dǎo)的糖尿病
[0235]在第1-4天于4-h的午前禁食后，每天用35mg/kg的β -細(xì)胞毒素，鏈脲菌素(STZ; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)經(jīng)腹膜內(nèi)(1.p.)注射7-8周齡的雄性免疫缺陷NOD/scid 小鼠(NOD.CB17-Prkdcscld/J； Animal Research Centre, Perth, Australia) ? 將 STZ 溶解于pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液中，并在制備好后的15min之內(nèi)注射。將小鼠保持在無(wú)菌條件下。[0236]細(xì)胞的灌輸和治療組
[0237]將經(jīng)免疫磁性選擇的來(lái)自積累的骨髓細(xì)胞的人STRO-1+基質(zhì)細(xì)胞基本上按照Gronthos 和 Zannetino (Methods Mol Biol.449:45-57, 2008)所述的那樣進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)展，并且得自 Angioblast Systems, USA。將傳代 4，在 ProFreeze?-CDM(Lonza, USA)中低溫保存的STRO-1+基質(zhì)細(xì)胞解凍，并對(duì)每個(gè)小鼠將2.5xl06的細(xì)胞配制到200 μ I的媒介物中用于立即注射。在第10天，STZ處理后，將每個(gè)NOD/scid小鼠，用單一劑量的細(xì)胞經(jīng)胸壁注射入經(jīng)麻醉小鼠的左心室(動(dòng)脈途徑)。對(duì)照小鼠則通過(guò)動(dòng)脈或靜脈途徑注射200 μ I的媒介物(含有 7.5%DMS0 和 a -MEM 的 ProFreeze?-CDM)。
[0238]對(duì)血液葡萄糖和胰島素的測(cè)定
[0239]在4_h 的午前禁食后，用葡萄糖計(jì)(Optimum Xceed? Diabetes MonitoringSystem; Abbott Diagnostics, Victoria, Australia)測(cè)定尾靜脈血液中的血液葡萄糖。通過(guò)使用小鼠特異的ELISA試劑盒(Ultrasensitive Mouse Insulin ELISAMercodia, Uppsala, Sweden),在第32天處死小鼠前通過(guò)對(duì)麻醉的小鼠進(jìn)行心臟內(nèi)穿刺(puncture)而獲得的血液中測(cè)定血液胰島素。
[0240]組織樣品的制備
[0241]通過(guò)斷頸法對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，將胰摘除并對(duì)稱地切開(kāi)，將一半在10%的中性福爾馬林中固定，而將另一半包埋入Tissue-Tek OCT Compound(SakuraFinetek, Torrance, CA)并在干冰上冷凍且儲(chǔ)存于_70°C。胰被特定地用于本研究中大部分的分析，而其它組織如肺、肝、心臟、脾、胃、腸/盲腸、膀胱、睪丸和腦則被收集用于組織病理學(xué)。
[0242]胰組織的組織學(xué)和`免疫熒光染色
`[0243]對(duì)于胰的組織學(xué)，將經(jīng)福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色。將裝載至顯微鏡載玻片上的FFPE組織切片(5μπι)去石蠟化，并通過(guò)在高壓鍋中的檸檬酸鹽緩沖液中加熱而進(jìn)行抗原恢復(fù)(antigen retrieval) ?在抗原恢復(fù)后用10%的正常山羊血清將該切片封閉2h并用于使用如下抗體(先前經(jīng)測(cè)試和驗(yàn)證可檢測(cè)經(jīng)抗原恢復(fù)的組織中的小鼠特異性分子)的免疫熒光檢測(cè):豚鼠抗-胰島素抗體(1:100; Millipore，USA)、小鼠抗-胰高血糖素抗體(10 μ g/ml;克隆 K79bB10; AbCAM)、小鼠抗-PDX-1抗體(10 μ g/ml;克隆267712 ;R&D Systems)。在2h的初抗溫育步驟之后，用1%的正常山羊血清/PBS將載玻片洗滌3次5min并在室溫與物種特異性二抗(1:400;山羊抗-小鼠Alexa Fluor555; Molecular Probe或山羊-抗-膝鼠羅丹明；JacksonLaboratories或山羊-抗-小鼠IgGl-FITC; AbCAM)進(jìn)一步溫育90min。對(duì)照省略掉初抗。胰組織中平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)的染色通過(guò)使用小鼠抗-SMA-FITC mAb (2mg/ml;克隆1A4; AbCAM)的直接熒光染色來(lái)進(jìn)行。
[0244]免疫染色的評(píng)估
[0245]在Zeiss Observer Zl顯微鏡(Germany)中觀察載玻片并用AxioCam MRm拍攝圖片。用Axio Vision Rel4.7軟件分析所拍攝的胰組織(經(jīng)H&E或者針對(duì)胰島素、胰高血糖素、PDX-1和SMA的抗體染色并且經(jīng)熒光探針檢測(cè))的圖片。來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的每個(gè)5mm的H&E切片被用于計(jì)數(shù)胰島的總數(shù)目以及分析胰島的大小(面積和直徑量度)并且針對(duì)每個(gè)相應(yīng)的經(jīng)圖像分析所測(cè)量的總切片面積進(jìn)行歸一化(normalize)。此外，每個(gè)經(jīng)抗原恢復(fù)的5 μ m FFPE切片(由抗-胰島素、胰高血糖素或PDX-1抗體染色)被計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞的總數(shù)目并且針對(duì)相應(yīng)的經(jīng)測(cè)量的總切片面積或總胰島面積來(lái)進(jìn)行歸一化。通過(guò)圖像分析對(duì)不同直徑的胰微血管的分布進(jìn)行計(jì)數(shù)以及測(cè)量，并且針對(duì)其相應(yīng)的經(jīng)檢驗(yàn)的切片面積進(jìn)行歸一化。所有的圖像均在20-40X的物鏡放大倍數(shù)下進(jìn)行分析。
[0246]通過(guò)半-定量RT-PCR的RNA分析
[0247]來(lái)自實(shí)驗(yàn)組胰的RNA樣品是在Trizol試劑中從來(lái)自每個(gè)冷凍組織的總共IOOmm的切片中提取的。用 illustra RNAspin Mini RNA Isolation試劑盒(GE Healthcare, UK)從該Trizol組織提取物中純化RNA。用分光光度計(jì)對(duì)總RNA進(jìn)行定量并將I μ g用oligo-dT (pdT12-18)和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在表1所給出的擴(kuò)增條件下用Tth PlusDNA聚合酶(Roche Applied Science)以及用針對(duì)鼠基因MafA、Ngn3、和Pdx-1的引物來(lái)將cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-肌動(dòng)蛋白基因被用于對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行歸一化。用KodakID3.5軟件通過(guò)對(duì)UV-照射下可見(jiàn)條帶的光密度測(cè)定分析來(lái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。
[0248]表1.PCR 條件
[0249]
【權(quán)利要求】
1.用于在有需要的對(duì)象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的施用促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對(duì)象中降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對(duì)象中提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或降低胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或提高胰島的數(shù)目。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對(duì)象的胰中提高胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達(dá)和/或提高表達(dá)rox-1的細(xì)胞的數(shù)目。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對(duì)象的胰中誘導(dǎo)或促進(jìn)動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法，其中所述對(duì)象患有與胰的內(nèi)分泌和/或外分泌功能相關(guān)的胰功能異常。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起異常水平的胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述異常水平的胰高血糖素是由分泌胰高血糖素的腫瘤所引起的。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起營(yíng)養(yǎng)的吸收障礙。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)胰炎、胰機(jī)能不全，獲得性自身免疫缺陷綜合癥、癌癥、囊性纖維化或Zollinger Ellison綜合癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常導(dǎo)致低血糖或高血糖、降低的血清氨基酸水平、蛋白尿、或者壞死松解性游走性紅斑。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起碳水化合物代謝病。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述碳水化合物代謝病通過(guò)由胰所產(chǎn)生的胰島素的降低所引起或者通過(guò)由胰所產(chǎn)生的淀粉酶的降低所引起。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中所述碳水化合物代謝病是糖尿病。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中將所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子直接施用至對(duì)象的血流中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中動(dòng)脈內(nèi)施用所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中施用于對(duì)象的所述STRO-1+細(xì)胞是STRO-1b"、和/或表達(dá)組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)，和/或所述后代細(xì)胞和/或可溶因子衍生自是STRO-1b"和/或表達(dá)TNAP的STRO-1+細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-1 8任一項(xiàng)的方法用于治療或延緩胰功能異常的進(jìn)展，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子在病癥的診斷后施用。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，另外包括監(jiān)測(cè)或探測(cè)胰功能異常的發(fā)病和/或進(jìn)展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰島素水平、和/或β細(xì)胞的數(shù)目、和/或α細(xì)胞的數(shù)目、和/或胰島的數(shù)目、和/或rox-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目、和/或rox-1表達(dá)的量和/或血管的數(shù)目。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子以組合物的形式施用，所述組合物包含所述STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子以及載體和/或賦形劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物另外包含誘導(dǎo)或增強(qiáng)先祖細(xì)胞分化成血管細(xì)胞的因子，或者所述組合物包含組織特異性定型細(xì)胞。
23.STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物，其用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于減少胰α細(xì)胞的數(shù) 目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或 (vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生。
24.STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或 (vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生， 的用途
25.STRO-1+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子在制備用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對(duì)于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或(vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-1表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動(dòng)脈發(fā)生或血管發(fā)生， 的藥物中的用途 。
【文檔編號(hào)】A61K35/12GK103800370SQ201310652234
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2008年11月20日
【發(fā)明者】S·伊泰斯庫(kù), R·克里希南 申請(qǐng)人:中胚有限公司