一種基因工程菌及其在生產(chǎn)輔酶q10中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程菌及其在生產(chǎn)輔酶Q10中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 輔酶Q是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，不同來源的輔酶Q其側(cè)鏈異 戊烯單位的數(shù)目不同，人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶Q10,其結(jié)構(gòu)式如式 (I)所示：
[0003]
[0004] 輔酶Q10是生物細(xì)胞呼吸鏈中的重要遞氫體，是一種良好的生化藥物，近年來已 廣泛應(yīng)用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。此外，在治療 壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進(jìn)胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最 近，研究者發(fā)現(xiàn)CoQlO具有抗衰老作用，從而將其應(yīng)用擴展到化妝品和保健品領(lǐng)域，使其在 國內(nèi)外的需求進(jìn)一步擴大。
[0005] 輔酶Q10的制備方法主要有三種，即動植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā) 酵法。動植物組織提取法中動植物輔酶Q10含量低，而且各種化學(xué)成份復(fù)雜，并受原料和來 源限制，因此產(chǎn)品成本高，價格昂貴，規(guī)模化生產(chǎn)受到了一定限制?；瘜W(xué)合成法技術(shù)上比較 成熟，主要是以來源較豐富的茄尼醇為原料合成的，但其產(chǎn)物為順反異構(gòu)體的混合物，生物 活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的程度。微生物發(fā)酵法合成的輔酶 Q10成本低、無光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性高，大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用效果好。
[0006] 常用的微生物包括紅螺菌，土壤桿菌，類球紅細(xì)菌，根瘤菌等。其中類球紅細(xì)菌培 養(yǎng)簡單，是輔酶Q10高效的生產(chǎn)菌之一。在細(xì)菌中，輔酶Q由兩部分組成：醌環(huán)部分和異戊 二烯側(cè)鏈部分。醌環(huán)骨架由分支酸途徑合成，前體是對羥基苯甲酸。側(cè)鏈由異戊二烯途徑 合成，側(cè)鏈的長短決定了輔酶Q的種類的不同。在類球紅細(xì)菌中，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)體二 甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP)與9分子異戊二烯焦磷酸（IPP)依次在物牛兒基物牛兒基焦磷 酸合成酶及聚十異戊二烯膠磷酸合酶的催化下生成聚十異戊二烯膠磷酸（DPP)。聚十異戊 二烯膠磷酸和對羥基苯甲酸縮合形成輔酶Q10的前體物，該前體物的苯環(huán)經(jīng)修飾之后形成 目標(biāo)產(chǎn)物輔酶Q10。
[0007] 利用代謝工程手段對輔酶Q10的生物合成途徑進(jìn)行遺傳修飾和改造，可以提高微 生物的輔酶Q10產(chǎn)率。輔酶Q10的生物合成途徑中存在較多的限速步驟，增強催化限速反 應(yīng)的酶的表達(dá)量或活性是提高輔酶Q10產(chǎn)率的一種方法。
[0008] 但現(xiàn)有通過代謝工程改造手段獲得的基因工程菌，其合成輔酶Q10的能力還有待 提1?。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種基因工程菌，該基因工程菌利用UbiE，UbiF，UbiG基因串聯(lián)過 表達(dá)來強化輔酶Q10產(chǎn)生菌的輔酶Q10合成能力。
[0010] 一種基因工程菌，包括輔酶Q10產(chǎn)生菌及轉(zhuǎn)入所述輔酶Q10產(chǎn)生菌的目的基因， 所述目的基因為去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiE)、2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧 基一1，4-對苯二酚羥化酶基因（UbiF)和3-去甲基泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiG)。
[0011] 輔酶Q10的苯環(huán)修飾反應(yīng)是輔酶Q10合成的限速步驟之一。其中，去甲基萘醌甲 基轉(zhuǎn)移酶（Demethylmenaquinone methyltransferase，UbiE)催化生成 C1 位上的甲基（甲 基化反應(yīng)），2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酉分輕化酶（2-〇(^&口代1^1-3-methyl-6-methoxy-l，4_benzoquinol hydroxylase，UbiF)催化生成 C3 位上的羥基（羥基 化反應(yīng)），3_ 去甲基泛醌 _93_ 甲基轉(zhuǎn)移酶（3-demethylubiquinone-93_methyltransferas e，UbiG)進(jìn)一步將C3位上的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榧籽趸谆磻?yīng)）。本發(fā)明創(chuàng)造性地將UbiE， UbiF，UbiG基因構(gòu)建于輔酶Q10產(chǎn)生菌中，利用UbiE，UbiF，UbiG基因串聯(lián)過表達(dá)來強化輔 酶Q10產(chǎn)生菌的輔酶Q10合成能力。
[0012] 作為優(yōu)選，所述去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 和2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酚羥化酶基因依次連接在表達(dá)載體的 同一啟動子下游。
[0013] 作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體為泛宿主性質(zhì)粒。泛宿主性質(zhì)粒能在多種不同種屬的細(xì) 胞中生存，因此可選用多種受體菌來構(gòu)建本發(fā)明的基因工程菌。
[0014] 所述泛宿主性質(zhì)?？蛇x用pBBRlMCS-2。
[0015] 由于所述表達(dá)載體為泛宿主性質(zhì)粒，因此本發(fā)明基因工程菌的宿主菌可選種類多 樣。作為優(yōu)選，所述輔酶Q10產(chǎn)生菌為類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides)。在輔酶 Q10的常用產(chǎn)生菌中，類球紅細(xì)菌不僅培養(yǎng)簡單，而且合成輔酶Q10的效率較高。
[0016] 作為優(yōu)選，所述目的基因來源于類球紅細(xì)菌。目的基因與受體菌同源，可進(jìn)一步提 高所述目的基因的轉(zhuǎn)錄效率。
[0017] 本發(fā)明中，所述去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiE)的堿基序列如SEQ ID No. 1所 示，所述2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酚羥化酶基因（UbiF)的堿基序 列如SEQ ID No. 2所示，所述3-去甲基泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiG)的堿基序列如 SEQ ID No. 3 所示。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0019] (1)從供體菌中提取總DNA ;
[0020] (2)以所述總DNA為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴增，分別獲得所述去甲基萘醌甲基 轉(zhuǎn)移酶基因、2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酚羥化酶基因和3-去甲基 泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因；
[0021] (3)將所述去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 和2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酚羥化酶基因依次連接于質(zhì)粒 pBBRlMCS-2的啟動子下游，獲得表達(dá)載體；
[0022] (4)將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌與宿主菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移， 獲得轉(zhuǎn)化子；
[0023] (5)從所述轉(zhuǎn)化子中篩選出所述基因工程菌。
[0024] 其中，擴增去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiE)所采用的引物為：
[0025] 上游引物：5 ' -TCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGAGCGACGAAACTTCCAAC-3 '（ 下劃線處為Xbal酶切位點）（SEQ ID No. 4);
[0026] 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTCGAGCTCCGGCCGCTACTAGTTGCGAACCAGCCGCCAGA-3 '（下劃 線處為Hindlll酶切位點）（SEQ ID No. 5);
[0027] 擴增3-去甲基泛醌-93-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（UbiG)所采用的引物為：
[0028] 上游引物：5 ' -CCAAGCTTCATCAACGGAGGAGGAGTTTGCAATGGAATCGT-3 '（下劃線處為 Hindlll 酶切位點）（SEQ ID No. 6);
[0029] 下游引物：5' -GGACTAGTTCAGCTGCGCCGCACGCTCGCGGTAACGT-3' (下劃線處為 Spel 酶切位點）（SEQ ID No. 7);
[0030] 擴增2-八異戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-對苯二酚羥化酶基因（UbiF)所 采用的引物為：
[0031] 上游引物：5 ' -CAAGCTTTCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGACAAATCAACCAACG GA-3'（下劃線處為Hindlll酶切位點）（SEQ ID No. 8);
[0032] 下游引物：5 ' -CGAGCTCCGGCCGCTACTAGTAGGCTACAACCCTAACGCAT-3 '（下劃線處為 SacI 酶切位點）（SEQ ID No. 9)。
[0033] 本發(fā)明還提供了所述基因工程菌在生產(chǎn)輔酶Q10中的應(yīng)用。
[0034] 所述應(yīng)用包括：
[0035] (1)將所述基因工程菌經(jīng)活化后接種于種子培養(yǎng)液中，進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，獲得一 級種子液；
[0036] 作為優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)液的配方為（100ml) :(NH4)2S04 0 . 25g，玉米漿0.05g，酵 母提取物 〇· 14g，NaCl 0· 2g，葡萄糖 0· 3g，Κ2ΗΡ040· 05g，ΚΗ2Ρ04 0· 05g，MgS04 0· lg，F(xiàn)eS04 0· 01g，CoCl2 0· 003g，MnS04 0· 0001g，CaC03 0· 8g，維生素 B1 0· 1 μ g，維生素 K 0· 1 μ g，維 生素 A 0. 15μ g ;pH調(diào)節(jié)為7. 2 ;
[0037] 作為優(yōu)選，所述一級種子培養(yǎng)的條件為：在30°C、200r/min下培養(yǎng)23h ;適當(dāng)?shù)呐?養(yǎng)條件使一級種子培養(yǎng)結(jié)束時，一級種子液中的較多菌體處于對數(shù)生長期。
[0038] (2)將所述一級種子液接種于種子培養(yǎng)液中，進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，獲得二級種子 液；
[0039] 所述一級種子液的接種量優(yōu)選為1%。通過二級培養(yǎng)可以使二級種子液中菌體狀 態(tài)更為均勻，基本處于對數(shù)生長期，便于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的進(jìn)行。二級種子培養(yǎng)的條件與一級 種子培養(yǎng)的條件相同。
[0040] (3)將所述二級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0041] 所述二級種子液的接種量優(yōu)選為為1%。
[0042] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為（100ml) :(NH4)2S04 0 . 3g，NaCl 0.28g，葡萄 糖 4g，ΚΗ2Ρ04 0· 15g，味精 0· 3g，MgS04 0· 63g，玉米漿 0· 4g，F(xiàn)eS04 0· 12g，CoCl2 0· 005g， CaC03 0· 6g，維生素 B1 0· 1 μ g，維生素 K 0· 1 μ g，維生素 A 0· 15 μ g ;pH 調(diào)節(jié)為 7. 2 ;
[0043] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：在30°C、200r/min下培養(yǎng)120h。
[0044] 作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：在30°C、200r/min下培養(yǎng)120h。
[0045] (4)收集菌液，從菌液中分離純化獲得輔酶Q10。
[0046] 與未轉(zhuǎn)化有目的基因的類球紅細(xì)菌相比，利用本發(fā)明的基因工程菌生產(chǎn)輔酶Q10， 輔酶Q10的產(chǎn)量提高了 20%以上。<