促凝血化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供蛋白酶可活化的促凝血化合物，其包含促凝血多肽例如促凝血肽和/或凝血因子，和含有蛋白酶可切割的底物(例如，合成的凝血酶底物)和自分解性間隔子(例如，氨基甲酸對(duì)氨基芐酯)的接頭。在蛋白酶可切割的底物被蛋白酶(例如，凝血酶)切割時(shí)，自分解性間隔子將其自身從促凝血多肽上切割以使該多肽是未衍生的活性形式。還提供藥物組合物、使用本發(fā)明的化合物用于治療出血病癥的方法、增強(qiáng)促凝血多肽的體內(nèi)功效的方法、增加包含促凝血多肽的化合物的蛋白水解切割功效的方法、使促凝血多肽活化的方法和從異源部分諸如PEG釋放促凝血多肽的方法。
【專利說明】促凝血化合物
[0001] 背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于治療出血疾病或病癥的促凝血化合物。
[0003] 背景
[0004] 凝血途徑部分涉及在血小板表面上形成因子VlIIa(FVIIIa)和因子IXa(FIXa) (X 酶復(fù)合物）的酶復(fù)合物。如沒有其輔因子FVIIIa，F(xiàn)IXa是具有相對(duì)弱催化活性的絲氨酸蛋 白酶。X酶復(fù)合物將因子X(FX)切割成因子Xa(FXa)，其進(jìn)而與因子Va(FVa)相互作用以切 割凝血酶原并產(chǎn)生凝血酶。血友病A是通過導(dǎo)致FVIII活性缺陷的因子VIII (FVIII)基因 突變和/或缺失而引起的出血病癥（Peyvandi等，2006)。血友病B(也稱為克雷司馬斯病 (Christmas disease))是全世界最常見的一種遺傳性出血病癥。它導(dǎo)致體內(nèi)和體外凝血活 性的降低并且在受影響個(gè)體的整個(gè)生命期間要求廣泛的醫(yī)療監(jiān)視。
[0005] 血友病的治療是通過靶向凝血活性恢復(fù)的替代治療。存在血漿源性的和重組的 凝血因子產(chǎn)品，可以用于按需治療出血發(fā)作或通過預(yù)防性治療來防止出血發(fā)作的發(fā)生?；?于這些產(chǎn)品的半衰期，治療方案需要頻繁的靜脈內(nèi)施用。此類頻繁施用是疼痛的且不方 便。延長(zhǎng)凝血因子半衰期的策略包括聚乙二醇化（Rostin J,等，Bioconj.Chem.2000; 11:387-96)、糖聚乙二醇化（Stennicke HR,等，Thromb. Haemost. 2008;100:920-8)、用 聚乙二醇化的脂質(zhì)體配制（Spira J,等，Blood 2006;108:3668-3673, Pan J,等，Blood 2009 ; 114:2802-2811)和用白蛋白偶聯(lián)（Sc hulte S.,Thromb. Res. 2008 ; 122 增刊 4:S14-9)。然而，用半衰期延長(zhǎng)的部分（例如，PEG)修飾凝血因子和促凝血肽以及其它延 長(zhǎng)它們半衰期的類似策略可導(dǎo)致活性降低。為了拯救其活性，在目標(biāo)蛋白或肽及其改性劑 之間可以插入可切割的接頭。所選擇的可切割的接頭必須被蛋白酶（例如，參與凝血級(jí)聯(lián) 的蛋白酶）有效且快速地切割。為許多凝血因子活性劑的凝血酶是最普遍的選擇。然而， 由天然氨基酸組成的所有已知的底物序列（例如，LVPR，ALRPR(SEQ ID NO:7)，等）并不是 最理想的底物。此外，可切割的接頭與凝血因子或促凝血肽的共價(jià)結(jié)合可導(dǎo)致可防止有效 酶切反應(yīng)的空間位阻（例如，由于氨基酸諸如脯氨酸、異亮氨酸或精氨酸C-末端在切割位 點(diǎn)的存在）。 發(fā)明概要
[0006] 本發(fā)明提供包含蛋白酶可切割的底物（例如，合成的凝血酶底物）和與促凝血多 肽（例如，凝血因子或促凝血肽）連接的自分解性（self-immolative)間隔子（例如，PABC) 的促凝血化合物。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有下式的促凝血化合物：
[0007] (Het2) - (Pep2) - (Hetl) - (L) -Zy-Bx-Pepl (式 I)
[0008] 其中，
[0009] Hetl是第一異源分子，為不存在或存在的；
[0010] Het2是第二異源分子，為不存在或存在的；
[0011] L是接頭，為不存在或存在的；
[0012] Zy是蛋白酶可切割的底物；
[0013] Bx是自分解性間隔子；
[0014] P印1是多肽；并且，
[0015] P印2是多肽，為不存在或存在的；
[0016] 其中，P印1或P印2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，在對(duì)蛋白酶可切割的底物進(jìn)行酶切后，本發(fā)明的促凝血化合 物的自分解性間隔子經(jīng)歷1，4消除。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)蛋白酶可切割的底物進(jìn)行酶 切后，本發(fā)明的促凝血化合物的自分解性間隔子經(jīng)歷1，6消除。在一些實(shí)施方案中，自分解 性間隔子是氨基甲酸對(duì)氨基芐酯（PABC)、對(duì)氨基芐基醚（ΡΑΒΕ)或碳酸對(duì)氨基芐酯。在某 些實(shí)施方案中，自分解性間隔子包含芳基。在一些實(shí)施方案中，芳基選自芐基、肉桂基、萘基 和聯(lián)苯基。在一些實(shí)施方案中，芳基是雜環(huán)的。在其它實(shí)施方案中，芳基包含至少一個(gè)取代 基。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)取代基選自F、C1、I、Br、0Η、甲基、甲氧基、Ν0 2、ΝΗ2、Ν03+、 NHC0CH3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、鹵代烷基、C1-C8烷基鹵化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯、 磺酸酯或其任意組合。在其它實(shí)施方案中，芳基中至少一個(gè)C被N、0或C-R 1取代，其中Ri 獨(dú)立地選自 H、F、CI、I、、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH 3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、 鹵代烷基、C1-C8烷基鹵化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的促凝血化合物中的蛋白酶可切割的底物包含凝血 級(jí)聯(lián)蛋白酶底物。在一些實(shí)施方案中，凝血級(jí)聯(lián)蛋白酶選自凝血酶、凝血激酶、因子Va、 因子Vila、因子Villa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa或其任意組合。在其它 實(shí)施方案中，凝血級(jí)聯(lián)蛋白酶底物是凝血酶底物。在一些實(shí)施方案中，凝血酶底物是合 成的凝血酶底物。在其它實(shí)施方案中，合成的凝血酶底物包含D-Phe-Pip-Arg序列。在 一些實(shí)施方案中，凝血酶底物選自 D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 17)、Ala-Leu-Val-Pro-Ar g(SEQ ID NO: 17)、Leu-Val-Pr〇-Arg(SEQ ID NO: 18)或 Ala-Leu-Arg-Pro-Arg(SEQ ID NO:90)。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，蛋白酶可切割的底物包含選自以下的蛋白酶的切割位點(diǎn)：中 性溶酶（CALLA或⑶10)、甲拌磷寡肽酶（TOP)、白三烯A4水解酶、內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶、 ste24蛋白酶、溶神經(jīng)素、線粒體中間肽酶、間質(zhì)膠原酶、膠原酶、溶基質(zhì)素、巨噬細(xì)胞彈性 酶、基質(zhì)溶解因子、明膠酶、跨膜肽酶（meprins)、前膠原C-內(nèi)肽酶、前膠原N-內(nèi)肽酶、 ADAM和ADAMT金屬蛋白酶、髓磷脂相關(guān)的金屬蛋白酶、釉質(zhì)溶素（enamelysin)、腫瘤壞死 因子α-轉(zhuǎn)換酶、胰島素溶酶（insulysin)、nardilysin、線粒體處理肽酶、magnolysin、 dactylysin樣金屬蛋白酶、嗜中性粒細(xì)胞膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、 SP2內(nèi)肽酶、前列腺特異性抗原（PSA)、纖溶酶、尿激酶、人成纖維細(xì)胞活化蛋白質(zhì)（FAPa)、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、降I丐蛋白酶（caldecrin)、胰彈性蛋白酶、胰內(nèi)肽酶、腸肽酶、白細(xì)胞 彈性蛋白酶、成髓細(xì)胞、糜蛋白酶類（chymase)、類胰蛋白酶、粒酶、角質(zhì)層糜蛋白酶、頂體蛋 白酶、激肽釋放酶、補(bǔ)體成分和因子、替代補(bǔ)體途徑c3/c5轉(zhuǎn)換酶、甘露糖結(jié)合蛋白相關(guān)的 絲氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纖溶酶原活性劑、組織蛋白酶G、肝絲酶 (hepsin)、絲氨酸蛋白水解酶（prostasin)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子活化內(nèi)肽酶、枯草桿菌蛋白酶 /kexin型前蛋白轉(zhuǎn)化酶、弗林蛋白酶、前蛋白轉(zhuǎn)化酶、脯氨酰肽酶、?；被；拿?、肽 基-glycaminase、信號(hào)肽酶、η-末端親核試劑氨基水解酶、20s蛋白酶體、γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽 基酶、線粒體內(nèi)肽酶、線粒體內(nèi)肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶（matriptase)、位點(diǎn)1蛋白 酶、天冬酰胺內(nèi)肽酶（Iegumain)、組織蛋白酶、半胱氨酸組織蛋白酶、鈣蛋白酶、泛素異肽酶 T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白轉(zhuǎn)酰胺基酶、癌癥促凝血?jiǎng)?、激素原硫醇蛋白酶、Y-谷 氨?；饷?、博萊霉素水解酶、成纖維細(xì)胞活化蛋白（seprase)、組織蛋白酶D、胃蛋白酶 (pepsin)、凝乳酶（chymosyn)、胃亞蛋白酶（gastricsin)、腎素、酵母天冬酶（yapsin)和/ 或memapsin、前列腺特異性抗原（PSA)或其任意組合。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，P印1和P印2是不同的。在其它實(shí)施方案中，P印1和P印2是 相同的。在一些實(shí)施方案中，P印1是凝血因子或其片段。在其它實(shí)施方案中，其中P印2是 凝血因子或其片段。在某些實(shí)施方案中，P印1和P印2均是凝血因子或其片段。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，P印1是凝血因子的重鏈，并且P印2是凝血因子的輕鏈。在其 它實(shí)施方案中，凝血因子選自FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa、vWF或其任意組合。在其它 實(shí)施方案中，Pepl是合成的促凝血肽。在其它實(shí)施方案中，Pep2是合成的促凝血肽。在一 些實(shí)施方案中，P印1和P印2均是合成的促凝血肽。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，接頭（L)是肽接頭。在一些實(shí)施方案中，肽接頭包含至少兩個(gè) 氨基、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少 50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)或至少100個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方 案中，肽接頭包含至少200個(gè)、至少300個(gè)、至少400個(gè)、至少500個(gè)、至少600個(gè)、至少700 個(gè)、至少800個(gè)、至少900個(gè)或至少1000個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽接頭包含具有式 [(Gly) x-Sery]z的肽，其中X為1至4，y為0或1，并且z為1至50。在一些實(shí)施方案中，接 頭（L)包含非膚接頭。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，接頭（L)由非肽接頭組成。在其它實(shí)施方案中，非肽接頭選自 MC、MP、MPEG、SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP、SMPB 或其任意組合。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，異源部分包含半衰期延長(zhǎng)的部分。在其它實(shí)施方案中，半衰期 延長(zhǎng)的部分是低復(fù)雜度的多肽。在其它實(shí)施方案中，半衰期延長(zhǎng)的部分包含白蛋白、白蛋白 結(jié)合多肽或脂肪酸、Fc、轉(zhuǎn)鐵蛋白、PAS、人絨毛膜促性腺激素的β亞基的C-末端肽（CTP)、 聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結(jié)合小分子、vWF、XTEN或其任意組合。在一些實(shí) 施方案中，半衰期延長(zhǎng)部分包含清除受體或阻斷促凝血化合物與清除受體結(jié)合的其片段。 在一些實(shí)施方案中，清除受體為L(zhǎng)RPl。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，異源部分包含能夠使促凝血化合物或其片段可視化或定位的 肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，可視化或定位能夠在體外、體內(nèi)、離體或其任意組合中。在 一些實(shí)施方案中，能夠可視化或定位的肽或多肽選自生物素受體肽、硫辛酸受體肽、熒光蛋 白、用于連接雙砷染料或用于偶聯(lián)亞穩(wěn)锝的含有半胱氨酸的肽、用于基于熒光共振能量轉(zhuǎn) 移（FRET)的鄰近測(cè)定（proximity assay)的用于偶聯(lián)銪包合物的肽、或其任意組合。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，熒光蛋白選自6--、1^\￥--』6--』￥--或其任意組合。在一 些實(shí)施方案中，雙砷染料為4'，5'-雙（1，3, 2-二硫代砷雜環(huán)戊烷（dithi〇ars〇lan)-2-基） 熒光素（FlAsH)。在一些實(shí)施方案中，生物素受體肽促進(jìn)基于抗生物素蛋白的試劑和基于鏈 霉親和素的試劑的偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，硫辛酸受體肽促進(jìn)硫醇反應(yīng)性探針與結(jié)合的 硫辛酸偶聯(lián)或直接連接熒光性硫辛酸類似物。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，異源部分包含非肽活性劑。在一些實(shí)施方案中，非肽活性劑是 促凝血分子。在一些實(shí)施方案中，非肽活性劑是小分子藥物。在一些實(shí)施方案中，異源部分 包含靶向部分或配體結(jié)合部分。在一些實(shí)施方案中，異源部分包含錨或支架分子。在一些 實(shí)施方案中，錨或支架分子是脂質(zhì)、碳水化合物或巰基。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的促凝血化合物包含式Het-L-Zy-Bx-Pepl,其中：
[0029] Het是半胱氨酸，
[0030] L是肽接頭；
[0031] Zy是合成的凝血酶底物，
[0032] Bx是自分解性間隔子，并且
[0033] P印1是促凝血肽。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，肽接頭包含GGGG氨基酸序列，合成的凝血酶底物包含序列 DPhe-Pip-Arg，自分解性間隔子是PABC，并且促凝血肽包含序列：
[0035]
【權(quán)利要求】
1. 一種促凝血化合物，其具有下式： (Het2)-(P印2)- (Hetl) - (L)-Zy-Bx-P印1 其中， Hetl是第一異源分子，為不存在或存在的； Het2是第二異源分子，為不存在或存在的； L是接頭，為不存在或存在的； Zy是蛋白酶可切割的底物； Bx是自分解性間隔子； P印1是多肽；并且， P印2是多肽，為不存在或存在的； 其中，P印1或P印2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性間隔子在對(duì)蛋白酶可切割 的底物進(jìn)行酶切后經(jīng)歷1，4消除。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性間隔子在對(duì)蛋白酶可切割 的底物進(jìn)行酶切后經(jīng)歷1，6消除。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性間隔子是氨基甲酸對(duì)氨基 芐酯（PABC)、對(duì)氨基芐基醚（ΡΑΒΕ)或碳酸對(duì)氨基芐酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性間隔子包含芳基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基選自芐基、肉桂基、萘基和聯(lián)苯 基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基是雜環(huán)基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述芳基包含至少一個(gè)取 代基。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的促凝血化合物，其中所述至少一個(gè)取代基選自F、C1、I、Br、 OH、甲基、甲氧基、N02、NH2、NO3+、NHCOCH3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、鹵代烷基、C1-CiJ^基鹵化 物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的促凝血化合物，其中所述芳基中的至少一個(gè)C被N、0或C-R i 取代，其中 R1獨(dú)立地選自 H、F、C1、I、Br、0H、甲基、甲氧基、NO 2, NH2、NO3+、NHC0CH3、N(CH3) 2、 NHC0CF3、烷基、鹵代烷基、C1-C8烷基鹵化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底物包含凝血級(jí) 聯(lián)蛋白酶底物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血級(jí)聯(lián)蛋白酶選自凝血酶、凝 血酶原、因子Va、因子Vila、因子Villa、因子IXa、因子Xa、因子XIa和因子Xlla。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血級(jí)聯(lián)蛋白酶底物是凝血酶底 物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物是合成的凝血酶底 物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列 D-Phe-Pip-Arg0
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物選自 D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Leu-Val-Pro-Arg 和 Ala-Leu-Arg-Pro-Arg0
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底 物包含選自以下的蛋白酶的切割位點(diǎn)：中性溶酶（CALLA或CD10)、甲拌磷寡肽酶（TOP)、白 三烯A4水解酶、內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶、ste24蛋白酶、溶神經(jīng)素、線粒體中間肽酶、間質(zhì)膠原 酶、膠原酶、溶基質(zhì)素、巨噬細(xì)胞彈性酶、基質(zhì)溶解因子、明膠酶、跨膜肽酶、前膠原C-內(nèi)肽 酶、前膠原N-內(nèi)肽酶、ADAM和ADAMT金屬蛋白酶、髓磷脂相關(guān)的金屬蛋白酶、釉質(zhì)溶素、腫瘤 壞死因子ct -轉(zhuǎn)換酶、胰島素溶酶、nardilysin、線粒體處理肽酶、magnolysin、dactylysin 樣金屬蛋白酶、嗜中性粒細(xì)胞膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、SP2內(nèi)肽酶、 前列腺特異性抗原（PSA)、纖溶酶、尿激酶、人成纖維細(xì)胞活化蛋白質(zhì)（FAPa)、胰蛋白酶、 糜蛋白酶、降鈣蛋白酶、胰彈性蛋白酶、胰內(nèi)肽酶、腸肽酶、白細(xì)胞彈性蛋白酶、成髓細(xì)胞、糜 蛋白酶類、類胰蛋白酶、粒酶、角質(zhì)層糜蛋白酶、頂體蛋白酶、激肽釋放酶、補(bǔ)體成分和因子、 替代補(bǔ)體途徑c3/c5轉(zhuǎn)換酶、甘露糖結(jié)合蛋白相關(guān)的絲氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋 白c、u和t型纖溶酶原活性劑、組織蛋白酶G、肝絲酶、絲氨酸蛋白水解酶、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 活化內(nèi)肽酶、枯草桿菌蛋白酶/kexin型前蛋白轉(zhuǎn)化酶、弗林蛋白酶、前蛋白轉(zhuǎn)化酶、脯氨酰 肽酶、酰基氨基?；拿浮㈦幕?glycaminase、信號(hào)肽酶、η-末端親核試劑氨基水解酶、20s 蛋白酶體、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶、線粒體內(nèi)肽酶、線粒體內(nèi)肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶、 位點(diǎn)1蛋白酶、天冬酰胺內(nèi)肽酶、組織蛋白酶、半胱氨酸組織蛋白酶、鈣蛋白酶、泛素異肽酶 T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白轉(zhuǎn)酰胺基酶、癌癥促凝血?jiǎng)?、激素原硫醇蛋白酶、Y-谷 氨?；饷?、博萊霉素水解酶、成纖維細(xì)胞活化蛋白、組織蛋白酶D、胃蛋白酶、凝乳酶、胃 亞蛋白酶、腎素、酵母天冬酶和/或memapsin，和前列腺特異性抗原（PSA)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是不同的。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是相同的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1是凝血因子或其片 段。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印2是凝血因子或其片 段。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是凝血因 子或其片段。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1是凝血因子的重 鏈，并且P印2是所述凝血因子的輕鏈。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述凝血因子選自 FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa 和 vWF。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1是合成的促凝血 肽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印2是合成的促凝血 肽。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2均是合成 的促凝血肽。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述接頭是肽接頭。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接頭包含至少兩個(gè)氨基、至少 三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少 60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)或至少100個(gè)氨基酸。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接頭包含至少200個(gè)、至少300 個(gè)、至少400個(gè)、至少500個(gè)、至少600個(gè)、至少700個(gè)、至少800個(gè)、至少900個(gè)或至少1000 個(gè)氨基酸。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接頭包含具有式[(Gly) X-Sery] z的肽，其中X為1至4,y為0或1,并且Z為1至50。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接頭包含非肽接頭。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接頭由非肽接頭組成。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的促凝血化合物，其中所述非肽接頭選自MC、MP、MPEG、 SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP 和 SMPB。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述異源部分包括半衰 期延長(zhǎng)部分。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分是低復(fù)雜度的多 肽。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分包含白蛋白、白 蛋白結(jié)合多肽或脂肪酸、Fc、轉(zhuǎn)鐵蛋白、PAS、人絨毛膜促性腺激素的β亞基的C-末端肽 (CTP)、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結(jié)合小分子、vWF或其任意組合。
38. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分包含清除受體或 阻斷促凝血化合物與清除受體結(jié)合的其片段。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的促凝血化合物，其中所述清除受體是LRPl。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述異源部分包含能夠 使促凝血化合物或其片段可視化或定位的肽或多肽。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的促凝血化合物，其中所述可視化或定位能夠在體外、體內(nèi)、 離體或其任意組合中。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的促凝血化合物，其中所述能夠可視化或定位的肽或多肽選 自生物素受體肽、硫辛酸受體肽、熒光蛋白、用于連接雙砷染料或用于偶聯(lián)亞穩(wěn)锝的含有半 胱氨酸的肽、用于基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)的鄰近測(cè)定的用于偶聯(lián)銪包合物的肽、及 其任意組合。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的促凝血化合物，其中所述熒光蛋白選自GFP、RFP、YFP、 EGFP、EYFP及其任意組合。
44. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的促凝血化合物，其中所述雙砷染料為4'，5'-雙（1，3, 2-二 硫代砷雜環(huán)戊烷-2-基）熒光素（FlAsH)。
45. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的促凝血化合物，其中所述生物素受體肽促進(jìn)基于抗生物素 蛋白的試劑和基于鏈霉親和素的試劑的偶聯(lián)。
46. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的促凝血化合物，其中所述硫辛酸受體肽促進(jìn)硫醇反應(yīng)性探 針與結(jié)合的硫辛酸偶聯(lián)或直接連接熒光性硫辛酸類似物。
47. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述異源部分包含非肽活性劑。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性劑是促凝血分子。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性劑是小分子藥物。
50. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述異源部分包含靶向部分或配體結(jié) 合部分。
51. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中所述異源部分包含錨或支架分子。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的促凝血化合物，其中所述錨或支架分子是脂質(zhì)、碳水化合 物或疏基。
53. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物,包含式Het-L-Zy-Bx-Pepl,其中： Het是半胱氨酸， L是膚接頭； Zy是合成的凝血酶底物， Bx是自分解性間隔子，并且 Pepl是促凝血肽。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的促凝血化合物，其中所述肽接頭包含GGGG氨基酸序列，所 述合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg,所述自分解性間隔子是PABC，并且所述促凝 血肽包含序列
55. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其包含式Zy-Bx-P印1，其中： Zy是合成的凝血酶底物， Bx是自分解性間隔子，并且 Pepl是凝血因子。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列 DPhe-Pip-Arg，所述自分解性間隔子是PABC，并且所述凝血因子是因子Xa或FVIIa。
57. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促凝血化合物，其中使用選自以下的方法來測(cè)量所述促凝 血活性：活化部分凝血活酶時(shí)間（aPTT)測(cè)定、改進(jìn)的活化部分凝血活酶時(shí)間（aPTT*)測(cè)定、 凝血酶生成測(cè)定（TGA)和ROTEM測(cè)定。
58. -種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物和藥學(xué) 上可接受的載體。
59. -種用于治療、改善或預(yù)防受試者中出血疾病或病癥的方法，其包括給所述受試者 施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物或根據(jù)權(quán)利要求58所述 的藥物組合物。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述出血疾病或病癥由凝血障礙引起。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述凝血障礙選自血友病和血管性血友病 (vffD) 〇
62. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述凝血障礙是血友病A或血友病B。
63. 根據(jù)權(quán)利要求59至62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述出血疾病或病癥選自關(guān)節(jié)積 血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、消化道出血、顱內(nèi)流 血、腹腔內(nèi)流血、胸內(nèi)流血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后區(qū)出血、腹膜后隙出血和骼腰肌 鞘出血。
64. -種治療、改善或預(yù)防哺乳動(dòng)物受試者中至少一種凝血因子缺乏的方法，其中所述 凝血因子選自FV、FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXI和vWF，所述方法包括給所述受試者施 用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物或根據(jù)權(quán)利要求58所述的 藥物組合物。
65. 根據(jù)權(quán)利要求59至64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人受試者。
66. 根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物或根據(jù)權(quán)利要求58所述的藥 物制劑用于治療患有凝血障礙的受試者。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的促凝血化合物，其中所述受試者是人受試者。
68. 根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物或根據(jù)權(quán)利要求58所述的藥 物制劑用于生產(chǎn)用于治療、預(yù)防或改善凝血障礙的藥物的用途。
69. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物的方法，所述方法包 括使用固相肽合成。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其包括使用正交固相肽合成。
71. -種增強(qiáng)促凝血多肽的體內(nèi)功效的方法，所述方法包括使所述多肽與自分解性間 隔子偶合，其中所述自分解性間隔子與蛋白酶可切割的底物部分偶合。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述自分解性間隔子包含PABC基團(tuán)。
73. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物部分包含合成的凝血 酶底物。
74. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述促凝血多肽是凝血因子或促凝血肽。
75. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述促凝血肽是合成的。
76. -種增加可操作地連接至促凝血肽或凝血因子的蛋白酶底物的切割功效的方法， 所述方法包括使自分解性接頭與所述促凝血多肽偶聯(lián)，其中將所述自分解性接頭插入在所 述蛋白酶底物和所述促凝血肽或凝血因子之間。
77. -種使促凝血肽活化的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝 血化合物與對(duì)所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特異性的蛋白酶接觸，其 中所述活化的促凝血肽在對(duì)所述蛋白酶可切割的底物部分進(jìn)行蛋白水解切割時(shí)釋放。
78. -種使凝血因子活化的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝 血化合物與對(duì)所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特異性的蛋白酶接觸，其 中所述活化的凝血因子在對(duì)所述蛋白酶可切割的底物部分進(jìn)行蛋白水解切割時(shí)釋放。
79. -種從異源部分釋放促凝血肽的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所 述的促凝血化合物與對(duì)所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特異性的蛋白酶接 觸，其中所述活化的促凝血多肽在對(duì)所述蛋白酶可切割的底物進(jìn)行蛋白水解切割時(shí)釋放。
80. -種從異源部分釋放凝血因子的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所 述的促凝血化合物與對(duì)所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特異性的蛋白酶接 觸，其中所述活化的凝血因子在對(duì)所述蛋白酶可切割的底物進(jìn)行蛋白水解切割時(shí)釋放。
81. 根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中當(dāng)與具有所述相同序列 但不具有自分解性接頭的參考促凝血化合物相比時(shí)，所述促凝血化合物被對(duì)所述蛋白酶可 切割的底物部分特異性的蛋白酶切割快至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、 至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
82. 根據(jù)權(quán)利要求1至81中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中當(dāng)與具有所述相同序列 但不具有自分解性接頭的參考促凝血化合物相比時(shí)，所述促凝血化合物被對(duì)所述蛋白酶可 切割的底物部分特異性的蛋白酶切割快至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少 60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
83. 根據(jù)權(quán)利要求1至57中任一項(xiàng)所述的促凝血化合物，其中所述自分解性間隔子包 含外部位結(jié)合肽。
84. -種蛋白酶可切割的多肽，其包含凝血因子的輕鏈、所述凝血因子的截短的重鏈 (〃tHC〃）和蛋白酶切割位點(diǎn)，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)連接所述凝血因子的截短的重鏈和 所述凝血因子的輕鏈。
85. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的蛋白酶可切割的多肽，其還包含在所述蛋白酶切割位點(diǎn)和 所述凝血因子的輕鏈之間的細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)。
86. 根據(jù)權(quán)利要求84或85所述的蛋白酶可切割的多肽，其還包含通過任選的接頭與所 述凝血因子的截短的重鏈的C-末端連接的異源部分。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述異源部分包含半衰期延長(zhǎng) 部分。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分包含白蛋 白、白蛋白結(jié)合多肽或脂肪酸、Fc、轉(zhuǎn)鐵蛋白、PAS、人絨毛膜促性腺激素的β亞基的C-末端 肽（CTP)、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結(jié)合小分子、清除受體或阻斷所述促 凝血化合物與清除受體結(jié)合的其片段、或其任意組合。
89. 根據(jù)權(quán)利要求86至88中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述異源部分包 含F(xiàn)c區(qū)。
90. 根據(jù)權(quán)利要求86至89中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述異源部分包 含通過接頭融合的兩個(gè)Fc區(qū)。
91. 根據(jù)權(quán)利要求84至90中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是 因子VII或因子X。
92. 根據(jù)權(quán)利要求84至90中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽，其中與所述凝血因子 的所述野生型重鏈相比，所述凝血因子的截短的重鏈在所述重鏈的N-末端不包含一個(gè)或 多個(gè)氨基酸。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸在所述 重鏈的N-末端包含2個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸、4個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基 酸、8個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸、11個(gè)氨基酸、12個(gè)氨基酸、13個(gè)氨基酸、14個(gè)氨基 酸或15個(gè)氨基酸。
94. 根據(jù)權(quán)利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子VII 并且所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸是IVGGKV(SEQIDNO:83)或IVGGKVCPKGE(SEQIDNO:84)。
95. 根據(jù)權(quán)利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子X并 且所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸是IVGGQE(SEQIDN0:85)或IVGGQECKDGE(SEQIDN0:86)。
96. 根據(jù)權(quán)利要求84至95中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述蛋白酶可切 割的位點(diǎn)包含SUMO。
97. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求84至96中任一項(xiàng)所述的可切割的多肽。
98. -種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求97所述的多核苷酸。
99. 一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求98所述的載體。
100. -種制備可切割的多肽的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求97所述的多核苷酸或根 據(jù)權(quán)利要求98所述的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并且在足以表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主 細(xì)胞。
101. -種制備促凝血化合物的方法，其包括在足以切割蛋白酶可切割的位點(diǎn)的條件下 使根據(jù)權(quán)利要求84至96中任一項(xiàng)所述的蛋白酶可切割的多肽與蛋白酶組合，其中所述蛋 白酶可切割的多肽導(dǎo)致被切割的多肽。
102. 根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其還包括向所述被切割的多肽中加入硫酯肽，其 中所述硫酯肽與所述凝血因子的截短的重鏈的N-末端融合。
103. 根據(jù)權(quán)利要求101或102所述的方法，其中所述硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物 (Zy)。
104. 根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述硫酯肽還包含在所述蛋白酶可切割的底 物和所述凝血因子的截短的重鏈之間的自分解性間隔子（Bx)。
105. 根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，所述硫酯肽還包含在所述自分解性間隔子和所述 凝血因子的截短的重鏈之間的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
106. 根據(jù)權(quán)利要求104或105所述的方法，其中所述硫酯肽包含式： Zy-Bx-W, 其中Zy是蛋白酶可切割的底物； Bx是自分解性間隔子；并且 W是一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
107. 根據(jù)權(quán)利要求104或105中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸（W) 與對(duì)應(yīng)于野生型凝血因子的N-末端的所述氨基酸序列相同，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸 和所述凝血因子的截短的重鏈在融合時(shí)產(chǎn)生所述凝血因子的完整重鏈。
108. 根據(jù)權(quán)利要求105至107中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包含 IVGGKV(SEQ ID N0:83)或IVGGKVCPK GE(SEQ ID N0:84)并且其中所述凝血因子包含因子 VII。
109. 根據(jù)權(quán)利要求104至107中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包含 IVGGQE(SEQ ID N0:85)或IVGGQECKD GE(SEQ ID N0:86)并且其中所述凝血因子包含因子 X。
110. 根據(jù)權(quán)利要求103至109中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物包 含凝血酶切割位點(diǎn)。
111. 根據(jù)權(quán)利要求110所述的方法，其中所述凝血酶切割位點(diǎn)包含D-Phe-Pip-Arg。
112. 根據(jù)權(quán)利要求104至111所述的方法，其中所述自分解性間隔子包含PABC。
113. 根據(jù)權(quán)利要求100至112中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的位點(diǎn)包 含 smro。
【文檔編號(hào)】A61K38/36GK104519897SQ201380036823
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】洪吳鵬, 亞當(dāng)·R·梅祖, 喬·薩拉斯, 羅伯特·彼得斯 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司