溫度穩(wěn)定性疫苗制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供在經歷冷凍和解凍條件之后保持穩(wěn)定的疫苗抗原，如炭疽保護性抗原的制劑。還提供使用所述制劑來制備疫苗的方法。包含所述制劑的疫苗適用于例如預防、抑制或減輕如與炭疽感染有關的疾病或感染。
【專利說明】溫度穩(wěn)定性疫苗制劑
[0001] 政府權利
[0002] 本發(fā)明是部分地在政府扶持下依據許可HHS0100201000059C完成的。政府可以對 本發(fā)明具有某些權利。
[0003] 以電子方式遞交的序列表的參考
[0004] 與本申請一起提交的以電子方式遞交的在ASCII文本文件（名稱"2479115PC02_ sequencelisting· txt" ；大?。?2, 954字節(jié)；以及創(chuàng)建日期：2013年6月25日）中的序列 表的內容以引用的方式整體并入本文中。 發(fā)明領域
[0005] 本發(fā)明涉及含有吸附于鋁佐劑的抗原的溫度穩(wěn)定性疫苗制劑以及制備這些制劑 的方法。本發(fā)明包括凍干和冷凍的疫苗制劑。本發(fā)明包括溫度穩(wěn)定性疫苗、制造溫度穩(wěn)定 性疫苗的方法和使用方法。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 炭疽是一種熟知的由革蘭氏陽性細菌炭疽桿菌（Bacillus anthracis ; B. anthracis)引起的傳染病。在三種類型的炭疽感染（皮膚感染、胃腸感染和吸入性感染） 中，皮膚炭疽最常見并且可用多種抗生素相對容易地治療。另兩種類型的炭疽感染是罕見 的，但是即便在用積極的抗微生物療法下通常也是致命的。
[0008] 主要的毒力因子炭疽毒素由以下三種蛋白質組成：保護性抗原（PA，83千道爾頓， kDa)、水腫因子（EF，89kDa)和致死因子（LF，90kDa)。毒素組分以PA+EF(水腫毒素）和 PA+LF (致死毒素）的雙重組合起作用。PA是一種細胞受體結合蛋白并且將另兩種蛋白質 (EF和LF)遞送到受感染細胞的細胞溶質中。
[0009] 最有效的預防炭疽的已知方法是接種。美國目前唯一的經FDA批準的炭疽疫苗 (由Emergent BioSolutions Inc.以商標BioThrax? (炭疽吸附疫苗）制造）是從來自 無毒力炭疽桿菌V770-NP1-R菌株的無不育細胞的濾液制得。得到許可的炭疽疫苗也稱為 炭疽吸附疫苗（或AVA)。所述疫苗主要由PA組成，并且將氫氧化鋁用作佐劑。所述疫苗是 在20世紀50和60年代期間開發(fā)出并且由FDA向Emergent BioSolutions Inc頒發(fā)許可。 所述疫苗示出小于0.06%的全身性反應。關于疫苗在人體內引發(fā)免疫反應的能力有較多的 文獻記錄。目前許可AVA疫苗在18個月內用五劑，接著每年進行加強。
[0010] 雖然AVA疫苗有效且安全，但是正在開發(fā)用于制備使用重組技術來保護受試者免 受致命性炭疽桿菌感染的疫苗的新型免疫原性組合物。因為保護性抗原（PA)是LF和EF 起作用都需要的常見因子，所以其經常用于制備炭疽用疫苗。處于開發(fā)中的PA疫苗的實例 包括美國專利 6, 316, 006 和 6, 387, 665 以及專利申請 US 2010/0183675、US2011/0229507 和TO2010/053610中所公開的那些。
[0011] 諸如AVA和PA的疫苗典型地含有至少一種佐劑以增強受試者的免疫反應。經 常稱為明礬的鋁鹽佐劑是目前最廣泛使用的人用佐劑。明礬通常是氫氧化鋁（也作為 ALHYDROGEL? (氫氧化鋁）或磷酸鋁銷售）。用結合抗原的ALHYDR0GEL配制AVA 和"下一代"炭疽疫苗（如重組型PA)。
[0012] 目前，含有明礬的疫苗需要冷鏈。全世界已經建立了冷鏈以將疫苗在存放和配送 期間保持在2-8°C下。維持冷鏈是昂貴且困難的。在冷鏈發(fā)生故障的情況下，疫苗可能暴露 于高于或低于預期溫度的溫度。如果含有明礬的疫苗在貨運和存放期間經歷冷凍/解凍處 理，那么通常建議將其丟棄。工業(yè)化國家和發(fā)展中國家都會發(fā)生冷鏈故障，并且冷鏈故障有 許多原因，例如設備故障、資源缺乏或順應性差。在許多發(fā)展中國家如印度尼西亞，在75% 的基線貨運中記錄到冷凍溫度并且具有冷凍敏感性的冷凍是廣泛的。參見H印atitis B vaccine freezing in the Indonesian cold chain !evidence and solutions，Bulletin of the World Health Organization 2004 ;82 :99_105。
[0013] 將依賴于冷鏈的疫苗以及時的方式配送到有需要者也可能花費更長的時間。在生 物恐怖事件或其它公共健康緊急事件的情況下，快速遞送疫苗和其它醫(yī)學對策的能力是重 要的。消除對配送冷鏈的依賴使醫(yī)學對策的遞送在多種氣候下更迅速和有效。
[0014] 為了避免或最小化冷鏈要求，將許多得到許可的疫苗配制成可在施用之前立即復 原的干粉組合物。到目前為止，所有在美國許可使用的干粉疫苗都是通過凍干工藝制造的。 凍干也稱為冷凍干燥，是一種提高疫苗的長期穩(wěn)定性的工藝。所述工藝涉及冷凍所述液體 疫苗制劑并在真空下升華所述冷凍制劑。已經開發(fā)了其它技術如噴霧干燥和泡沫干燥以達 到制造穩(wěn)定的干粉疫苗的目的。這些較新的技術在不需要冷凍的情況下制得干粉疫苗物質 并且可用于含明礬的疫苗。參見例如Chen等，2010，Vaccine 28:5093-5099。然而，這些較 新的技術仍在起步階段并且有待在美國用于制造得到許可的疫苗。
[0015] 含明礬的疫苗組合物的冷凍（作為凍干工藝的部分或者用以制造冷凍疫苗）通常 誘導鋁粒子聚集并且引起吸附到明礬佐劑上的抗原降解，導致效力損失。另外，冷凍致使沉 降的錯凝膠的高度降低（通常稱為凝膠塌縮）。參見例如"The effect of freezing on the appearance,potency and toxicity of adsorbed and unadsorbed DPT vaccines,"1980, WHO Weekly Epidemiological Record 55 :385-92 "'Temperature Sensitivity of ￥&。(^1^8，"2006年8月，腿0出版物腿0/1￥8/06.10;0111^1181^等，1999，￥&。(^116，18(1-2) : 3-17;1&^等，2003，了卩1^1'1115(^92(2):319-332。
[0016] 因此，需要制造能耐凍的含明礬的疫苗?？梢詫⑦@種疫苗冷凍，作為制造工藝（例 如凍干或冷凍的疫苗）、貨運過程或在存放期間的部分。本發(fā)明公開了用于制造含有明礬的 溫度穩(wěn)定性疫苗的新型制劑。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 本發(fā)明提供含有明礬并且能夠在效力極少降低至不降低的情況下冷凍的疫苗制 齊IJ。在一個實施方案中，冷凍疫苗組合物顯示極少至無的冷凍所致的明礬凝膠塌縮。
[0019] 在一個實施方案中，疫苗或組合物包含至少20%充當穩(wěn)定劑的糖。在一個實施方 案中，疫苗或組合物包含大于15%、大于20%、大于25%或大于30%的糖。在一些實施方 案中，如果添加其它穩(wěn)定劑如氨基酸和/或表面活性劑，那么可減少糖量而不削弱效力。對 于冷凍和凍干的疫苗制劑，也可通過增大冷凍速率和通過冷凍懸浮粒子（如與沉降粒子相 反）來提商效力。
[0020] 本發(fā)明包括冷凍疫苗組合物、凍干疫苗組合物（其經歷冷凍，作為凍干工藝的部 分）以及在貨運和存放期間對冷凍/解凍條件不敏感的其它疫苗制劑。
[0021] 本發(fā)明的一些實施方案包括用于制備凍干疫苗的組合物，其包含至少一種吸附于 鋁佐劑的抗原和至少20% (w/v)的非還原糖。另一實施方案包括一種溫度穩(wěn)定性液體疫苗 組合物，其包含至少一種吸附于鋁佐劑的抗原和至少20% (w/v)的糖。另一實施方案包括 組合物，其在凍干之前包含至少一種吸附于鋁佐劑的抗原和至少20% (w/v)的非還原糖， 其中在復原之后，所述非還原糖是至少6% (w/v)。本發(fā)明的組合物可以進一步包含表面活 性劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種吸附于鋁佐劑的抗原、表面活性劑 和至少15% (w/v)的糖，其可用于制備凍干疫苗。
[0022] 本發(fā)明還包括溫度穩(wěn)定性液體疫苗組合物，其包含至少一種吸附于鋁佐劑的抗 原、表面活性劑和至少15% (w/v)的糖。在一些實施方案中，組合物進一步包含氨基酸。還 包括穩(wěn)定的液體疫苗組合物，其包含至少一種吸附于鋁佐劑的抗原、表面活性劑、氨基酸和 至少10% (w/v)的糖。
[0023] 本發(fā)明進一步提供用于制備凍干疫苗的組合物，其包含至少一種吸附于鋁佐劑的 抗原、表面活性劑、氨基酸和至少10% (w/v)的糖。
[0024] 本發(fā)明可應用于眾多含有吸附于鋁佐劑的抗原的疫苗。在一個實施方案中，疫苗 是炭疽疫苗如rPA或炭疽吸附疫苗。
[0025] 可以改變保護性抗原的來源。因此，在一些實施方案中，從不產孢子的炭疽桿菌 細菌制造炭疽桿菌保護性抗原蛋白。在一些實施方案中，不產孢子的炭疽桿菌細菌是細菌 的ASterne-l(pPA102)CR4菌株。在一些實施方案中，PA蛋白在其它生物體如大腸桿菌 (E. coli)中表達。
[0026] 在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以進一步包含佐劑（例如，除鋁以外）。
[0027] 本發(fā)明包括預防和治療炭疽感染的方法，其包括向受試者施用藥學上有效量的本 發(fā)明的疫苗之一。在另一實施方案中，本發(fā)明包括在受試者體內誘導免疫反應的方法，其包 括向受試者施用本發(fā)明的疫苗。
[0028] 本發(fā)明提供將疫苗凍干的方法，其包括（i)冷凍本發(fā)明的組合物和（ii)使冷凍的 組合物升華。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖1.與在-80°C下冷凍并且解凍的相同組合物相比，在2_8°C下的沒有糖穩(wěn)定劑 的rPA疫苗的照片。
[0031] 圖2.與在-80°C下冷凍并且解凍的相同組合物相比，在2-8°C下的具有20%海藻 糖和2%精氨酸的rPA疫苗的照片。
[0032] 圖3.在2_8°C下和在_80°C下接著解凍的有和無蔗糖的rPA疫苗的照片。
[0033] 圖4.示出無糖rPA制劑在冷凍前后的NF50幾何平均值的圖以及示出明礬凝膠塌 縮的照片。
[0034] 圖5.示出未冷凍的有和無糖的凍干樣本的NF50幾何平均值反應的圖。
[0035] 圖6.示出含有20%海藻糖的rPA組合物在冷凍/解凍前后NF50幾何平均值的 圖。
[0036] 圖7.示出與液體對照物相比，所有凍干樣本的NF50幾何平均值的圖。
[0037] 圖8A-B.示出凍干rPA在（A) 5°C和50°C下與以線性NF50標度所示的AVA相比以 及在（B) 5°C和50°C下與以對數(shù)NF50標度所示的AVA相比隨時間變化的NF50的圖，每一疫 苗處于I : 4的稀釋度下。
[0038] 圖9A-B.示出凍干rPA在（A) 5°C和50°C下與以線性NF50標度所示的AVA相比以 及在（B) 5°C和50°C下與以對數(shù)NF50標度所示的AVA相比隨時間變化的NF50的圖，每一疫 苗處于1 : 16的稀釋度下。
[0039] 圖10A-B.示出凍干rPA在（A) 5°C和50°C下與以線性NF50標度所示的AVA相比 以及在（B) 5°C和50°C下與以對數(shù)NF50標度所示的AVA相比隨時間變化的NF50的圖，每一 疫苗處于1 : 64的稀釋度下。
[0040] 圖11A-B.示出在5°C和50°C下的凍干rPA和AVA在⑷第35天和⑶第42天 時的NF50的比較的圖，每一疫苗處于1 : 4的稀釋度下。
[0041] 圖12A-B.示出在5°C和50°C下的凍干rPA和AVA在⑷第35天和⑶第42天 時的NF50的比較的圖，每一疫苗處于1 : 16的稀釋度下。
[0042] 圖13A-B.示出在5°C和50°C下的凍干rPA和AVA在⑷第35天和⑶第42天 時的NF50的比較的圖，每一疫苗處于1 : 64的稀釋度下。
[0043] 圖14.示出存放一個月的rPA液體疫苗（液體rPA Fl)相對于存放四個月的凍干 疫苗（LyoA、LyoB和LyoC)隨溫度變化的MLA (小噬細胞溶解分析）％值的比較的圖。
[0044] 圖15A-B. (A)相對于參考對照物，三種存放四個月的rPA凍干制劑（LyoA、LyoB和 LyoC)與存放一個月的液體rPA相比隨存放溫度變化的SEC純度％的相對下降的圖。（B) 示出了 rPA BDS參考標準的典型尺寸排阻色譜（SEC-HPLC)色譜圖。
[0045] 圖16A-B. (A)相對于參考對照物，三種存放四個月的rPA凍干制劑（LyoA、LyoB和 LyoC)與存放一個月的液體rPA相比隨存放溫度變化的AEX純度％的相對下降的圖。（B) 示出了 rPA BDS參考標準的陰離子交換色譜（AEX-HPLC)色譜圖。
[0046] 圖17A-D.示出在5°C、25°C和40°C下存放一個月的LyoA在劑量水平0. 25(A圖）、 0· 125(B圖）、0· 0625(C圖）和0· 03125(D圖）下的NF50的比較的圖。
[0047] 圖18A-D.示出在5°C、25°C和40°C下存放一個月的LyoB在劑量水平0. 25(A圖）、 0· 125(B圖）、0· 0625(C圖）和0· 03125(D圖）下的NF50的比較的圖。
[0048] 圖19A-D.示出在5°C、25°C和40°C下存放一個月的LyoC在劑量水平0. 25(A圖）、 0· 125(B圖）、0· 0625(C圖）和0· 03125(D圖）下的NF50的比較的圖。
[0049] 圖20A-D.示出在5°C、25°C和40°C下存放一個月的液體rPA在劑量水平0. 25(A 圖）、0· 125(B圖）、0· 0625(C圖）和0· 03125(D圖）下的NF50的比較的圖。
[0050] 圖21.示出12種如實施例8中所述的制劑的NF50值和平均數(shù)標準差的圖。
[0051] 詳述
[0052] 多年來，一直認為含明礬的疫苗不能冷凍。因此，不將含明礬的疫苗冷凍或凍干 (需要冷凍），并且如果冷鏈中斷引起冷凍，那么典型地將含明礬的液體疫苗丟棄。本發(fā)明 的發(fā)明人得到激動人心的發(fā)現(xiàn)：當諸如海藻糖或鹿糖的糖構成炭疽疫苗組合物的約20% (w/v)或更多時，組合物中的明礬不會因冷凍或解凍而塌縮。明礬塌縮是容易鑒別的并且與 疫苗效力損失和粒子聚集相關。
[0053] 本發(fā)明人還鑒別了有助于防止和減少明礬凝膠塌縮的其它穩(wěn)定化成分和工藝參 數(shù)。例如通過向制劑中添加氨基酸，可減少防止明礬凝膠塌縮所需的糖量，例如減至約10% (w/v)。對明礬凝膠高度具有積極作用的工藝變化包括冷凍懸浮粒子（而非沉降粒子）和 增大冷凍速率。
[0054] 本文使用的章節(jié)標題僅用于組織目的并且不將其視為限制所述的主題。所有在本 文中引用的文獻或文獻的部分（包括但不限于專利、專利申請、條款、書和論文）都以引用 的方式整體明確并入本文中以達到任何目的。在一個或多個所并入的文獻或文獻的部分對 術語的定義與本申請中對所述術語的定義相矛盾的情況下，以本申請中出現(xiàn)的定義為準。
[0055] 除非另外具體規(guī)定，否則使用單數(shù)包括復數(shù)。除非另外具體規(guī)定，否則措詞"一種 (個）（a或an) "意指"至少一種（個）"。除非另有說明，否則使用"或者"意指"和/或"。 詞語"至少一種（個）"的含義等效于詞語"一種（個）或多種（個）"的含義。此外，使用 術語"包括（including)"以及其它形式，如"包括（includes)"和"包括（included)"是沒 有限制性的。此外，除非另外具體規(guī)定，否則術語如"要素"或者"組分"涵蓋包含一個單位 的要素或組分和包含大于一個單位的要素或組分二者。措詞"約"意指在約1個單位內。
[0056] 本文所用的保護性抗原（PA)或重組型保護性抗原（rPA)是含有受體結合和移位 結構域的炭疽毒素的組分（約83kDa)。全長PA胺基酸序列的一個實例是：
[0057] EVKQENRLLNESESSSQGLLGYYFSDLNFQAPMVVTSSTTCDLSIPSSELENIPSENQYFQSAIWSGFI KVKKSDEYTFATSADNHVTMWVDDQEVINKASNSNKIRLEKGRLYQIKIQYQRENPTEKGLDFKLYffTDSQNKKEVI SSDNLQLPELKQKSSNSRKKRSTSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDYKNKRTFLSPfflSNIHEKKGLTKYKSSP EKffSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPEARHPLVAAYPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHT SEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTffAETMGLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNV LPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQ YYGNIATYNFENGRYRVDTGSNffSEVLPQIQETTARIIFNGKDLNLVERRIAAYNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAF GFNEPNGNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDRNNIAVGAD ESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKL PLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG
[0058] (SEQ ID NO ：1) 〇
[0059] SEQ ID NO :1是rPA102的氨基酸序列，其從質粒pPA102表達。在rPA102從炭疽 桿菌ASterne-I (pPA102)CR4分泌到細胞外間隙內的期間，前29個氨基酸（信號肽）被除 去，得到735個氨基酸的成熟rPA蛋白（82,674Da)。對成熟rPA序列加下劃線（SEQ ID NO: 2)。
[0060] rPA102氨基酸序列只是在本發(fā)明的范圍內的一種具體炭疽蛋白的一個實例。 來自多種炭疽菌株的PA蛋白（包括天然蛋白質）的其它氨基酸序列為本領域中已知 的并且包括例如以下 GenBank 登記號：NP_652920. 1、ZP_02937261. 1、ZP_02900013. 1、 ZP_02880951. 1，將其以引用的方式并入。還已知PA中用于降低其毒性或改善其表達特征 的多種片段、突變和修飾，如在本說明書中別處所述的那些，多種融合蛋白也是如此。除 非上下文或文本中明確表明排除那些形式，否則那些片段、突變體和融合蛋白包括于術語 "PA"中。當有指示時，PA片段、突變體和融合蛋白（無論具有全長PA或PA片段）是在毒 素中和分析（TNA)中活性的引發(fā)抗血清的那些。
[0061] 本文所用的"溫度穩(wěn)定性"、"穩(wěn)定"或"穩(wěn)定性"是指在冷凍/解凍循環(huán)之后明礬 凝膠的穩(wěn)定性和疫苗的效力。本文所用的穩(wěn)定疫苗是與保持在2-8°C之間的相當?shù)囊后w疫 苗相比，在冷凍/解凍循環(huán)之后顯示活性和/或效力和/或明礬凝膠塌縮和/或粒子聚集 不降低或者降低極少的疫苗?？墒褂帽疚乃龅姆治鲋械娜我环N或多種來測量穩(wěn)定性，包 括工作實施例，以及在本領域中已知的用于測量活性、效力和/或肽降解的分析。
[0062] 在某些實施方案中，可通過計算50%中和因子（NF50)來測量抗原或疫苗例如保 護性抗原的免疫原性?？苫趤碜越o定數(shù)目的數(shù)據點的NF50值來計算疫苗制劑的NF50的 幾何平均數(shù)（幾何平均值或<NF50>gm)。在某些實施方案中，通過使用來自標準毒素中和 分析（TM) (Hering 等，Biologicals 32(2004) 17-27 ;0mland 等，Clinical and Vaccine Immunology (2008) 946-953;和 Li 等，Journal of Immunological Methods (2008) 333: 89-106)的血清樣本，例如來自免疫小鼠或兔的血清測定NF50和/或幾何平均值。使得毒 素50%中和的血清稀釋度是"ED50"。由參考血清的ED50和測試血清的ED50的商計算每 一測試血清相對于參考血清的中和能力（50%中和因子或者NF50,也稱作中和比率），即如 下計算中和因子NF50 :
[0063]
【權利要求】
1. 一種用于制備凍干疫苗的組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原和至少 20% (w/v)的非還原糖。
2. -種溫度穩(wěn)定性液體疫苗組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原和至少 20% (w/v)的糖。
3. -種組合物，其在凍干之前包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原和至少20% (w/v)的 非還原糖，其中在復原之后，所述非還原糖是至少6% (w/v)。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含表面活性劑。
5. -種用于制備凍干疫苗的組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原、表面活性 劑和至少15% (w/v)的糖。
6. -種溫度穩(wěn)定性液體疫苗組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原、表面活性 劑和至少15% (w/v)的糖。
7. 如權利要求1至6中任一項所述的組合物，其中所述組合物進一步包含氨基酸。
8. -種用于制備凍干疫苗的組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原、表面活性 齊U、氨基酸和至少10% (w/v)的糖。
9. 一種穩(wěn)定的液體疫苗組合物，其包含至少一種吸附于鉛佐劑的抗原、表面活性劑、氨 基酸和至少10% (w/v)的糖。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的組合物，其中所述鉛佐劑選自磯酸鉛和硫酸鉛。
11. 如權利要求1至9中任一項所述的組合物，其中所述鉛佐劑是氨氧化鉛。
12. 如權利要求11所述的組合物，其中所述組合物含有約0. 5至1. 5mg/ml氨氧化鉛。
13. 如權利要求12所述的組合物，其中所述組合物含有約0. 5mg/ml氨氧化鉛。
14. 如權利要求12所述的組合物，其中所述組合物含有約1. 5mg/ml氨氧化鉛。
15. 如權利要求4至14中任一項所述的組合物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇醋 80和聚山梨醇醋20。
16. 如權利要求15所述的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇醋80。
17. 如權利要求4至16中任一項所述的組合物，其中所述組合物含有約0. 020%或 0.025% (w/v)的表面活性劑。
18. 如權利要求1至17所述的組合物，其中所述糖是選自海藻糖、藏糖和其組合的非還 原糖。
19. 如權利要求18所述的組合物，其中所述糖是海藻糖。
20. 如權利要求18所述的組合物，其中所述糖是藏糖。
21. 如權利要求18所述的組合物，其中所述糖是海藻糖和藏糖。
22. 如權利要求5至21中任一項所述的組合物，其中所述組合物含有約15-40% (w/v) 的糖。
23. 如權利要求1至22中任一項所述的組合物，其中所述組合物含有約20-40% (w/v) 的糖。
24. 如權利要求23所述的組合物，其中所述組合物含有約20-35% (w/v)的糖。
25. 如權利要求24所述的組合物，其中所述組合物含有約25-40% (w/v)的糖。
26. 如權利要求1至25中任一項所述的組合物，其中所述組合物含有大于約20%、 21%、22%、23%、24%和25%(訊八）的糖。
27. 如權利要求1至26中任一項所述的組合物，其中所述抗原是炭痘抗原。
28. 如權利要求27所述的組合物，其中所述炭痘抗原是保護性抗原。
29. 如權利要求28所述的組合物，其中所述保護性抗原與SEQ ID NO ;2的多膚具有至 少約80%的同一性。
30. 如權利要求28至29中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含約150-500 y g/ ml保護性抗原。
31. 如權利要求30所述的組合物，其中所述組合物包含約150、175、200、225、250、275、 300、325、400、375、400、425、450、475 或 500 y g/ml 保護性抗原
32. 如權利要求31所述的組合物，其中所述炭痘抗原是來自無毒力炭痘桿菌菌株的無 細胞濾液。
33. 如權利要求32所述的組合物，其中所述無毒力炭痘桿菌菌株是V770-NP1-R。
34. 如權利要求7至33中任一項所述的組合物，其中所述氨基酸選自精氨酸、丙氨酸、 脯氨酸、甘氨酸和其任何組合。
35. 如權利要求34所述的組合物，其中所述組合物含有約0.5-4% (w/v)的丙氨酸或 精氨酸。
36. 如權利要求40所述的組合物，其中所述組合物含有約2% (w/v)的丙氨酸或精氨 酸。
37. 如權利要求34所述的組合物，其中所述組合物含有約6-12% (w/v)的甘氨酸。
38. 如權利要求37所述的組合物，其中所述組合物含有約10% (w/v)的甘氨酸。
39. 如權利要求1、3至5、7、8和10至38中任一項所述的組合物，其中所述組合物在真 空下經歷升華W產生凍干組合物。
40. -種凍干組合物，其從如權利要求1、3至5、7、8和10至38中任一項所述的組合物 凍干。
41. 一種復原的組合物，其包含在水溶液中復原的如權利要求39或40所述的凍干組合 物。
42. 如權利要求41所述的復原的組合物，其中所述水溶液選自水、Tris邸TA(TC)、磯 酸鹽緩沖鹽水（PBS)、Tris緩沖液或鹽水。
43. 如權利要求1、3至5、7、8和10至38中任一項所述的組合物，其中所述組合物在W 凍干形式在5(TC下存放至少4個月之后保持至少80%、至少90%或至少95%的純度。
44. 如權利要求1、3至5、7、8和10至38中任一項所述的組合物，其中所述組合物在W 凍干形式在4(TC下存放至少1個月之后保持至少80%、至少90%或至少95%的免疫原性。
45. -種針對病原體對受試者接種的方法，其包括施用如權利要求1至44中任一項所 述的組合物。
46. -種針對病原體對受試者接種的方法，其包括向受試者施用從如權利要求39或40 所述的凍干組合物復原的藥物組合物。
47. -種制造強效的基于明機的冷凍疫苗的方法，其包括息浮包含至少約10%糖和吸 附于鉛佐劑的抗原的組合物W及W足W在發(fā)生沉降之前冷凍所述息浮組合物的速率冷凍 所述組合物。
48. 如權利要求47所述的方法，其中所述組合物含有至少約15%的糖。
49. 如權利要求47所述的方法，其中所述組合物含有至少約20%的糖。
50. -種制備穩(wěn)定的凍干組合物的方法，其包括將如權利要求1、3至5、7、8和10 至38中任一項所述的組合物凍干，其中通過小瞻細胞溶解分析（MLA)、尺寸排阻色譜 (SEC-H化C)和/或陰離子交換色譜（AEX-H化C)測量所述復原的凍干組合物的穩(wěn)定性。
【文檔編號】A61K9/18GK104470506SQ201380037918
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權日:2012年6月25日
【發(fā)明者】J·盧克, C·F·魯伊斯, A·P·麥爾斯, R·W·韋爾奇 申請人:新興產品開發(fā)蓋瑟斯堡有限公司