一種用于抗腫瘤的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于腫瘤治療的siRNA及其應(yīng)用。經(jīng)RT-QPCR、Western?Blot和MTT染色法檢測發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的siRNA能通過特異性沉默人Pokemon基因，降低相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為針對Pokemon基因治療腫瘤提供了可能，也為針對該基因的腫瘤分子靶向治療提供了良好的前景，具有重大價(jià)值。
【專利說明】—種用于抗腫瘤的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于抗腫瘤的SiRNA及其應(yīng)用,尤其涉及祀向人Pokemon基因的siRNA及其抗腫瘤作用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)啟動(dòng)的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。在這一過程中，dsRNA被核酸內(nèi)切酶切割成小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(siRNA-1nduced silencing complex, RISC), RISC 識(shí)別并降解革巴信使 RNA(message RNA,mRNA)，終止其參與的翻譯過程，從而抑制基因表達(dá)。RNAi技術(shù)具有高度特異性、作用迅速、起效快等特點(diǎn)，可以有效減少毒副作用發(fā)生的可能，現(xiàn)已被證實(shí)在多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療中具有極大的潛力。
[0003]Pokemon 基因，即 POK 紅系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenicfactor)，也被稱為LRF、0CZF或FB1-1，是轉(zhuǎn)錄抑制因子POK家族的一員，也是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)對抑癌基因，可變讀框基因(alterative reading frame,ARF)的特異性轉(zhuǎn)錄有抑制作用的因子，現(xiàn)已被確認(rèn)為原癌基因。該基因主要通過調(diào)節(jié)ARF-p53路徑，特異性抑制腫瘤抑制蛋白ARF及其激動(dòng)劑，使細(xì)胞的增殖調(diào)控失效，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生(Maeda T7Hobbs RM7PierPaolo Pandolf1.Cancer Res, 2005，65:8575-8578)。此外，Pokemon 還位于多種腫瘤抑制基因和原癌基因的上游，在腫瘤轉(zhuǎn)化分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中能控制其他癌基因的活性，并對腫瘤細(xì)胞的一些重要特性產(chǎn)生影響，被視為“腫瘤總開關(guān)”。例如，有研究表明，Pokemon為癌基因LAZ-3 / BCL-6的潛在靶點(diǎn)，可與BCL-6協(xié)同作用促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展；還可以反饋性增高人類腫瘤中廣泛表達(dá)的凋亡抑制基因BCL-2的表達(dá)(Davies JM, Hawe N, KabarowskiJ, et al.0ocogene, 1999,18 (2):365)。Pokemon基因的編碼產(chǎn)物，POK蛋白也可以介導(dǎo)蛋白二聚體形成，通過募集組蛋白脫乙?；?HDACs)引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，引起特定DNA基因的開關(guān)，從而行使轉(zhuǎn)錄抑制功能。
[0004]Pokemon基因在人類多發(fā)性腫瘤，如淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等中均有高度表達(dá)，而缺失此基因的細(xì)胞則不易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此該基因有望成為腫瘤預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后評價(jià)的新靶標(biāo)，能夠特異性抑制Pokemon的藥物，極有可能成為一種強(qiáng)有力的抗癌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要提供的是一種能特異性抑制人Pokemon基因表達(dá)的siRNA,通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]根據(jù)siRNA靶序列基本原則，針對人Pokemon基因(NM_015898)設(shè)計(jì)了 I條21個(gè)核苷酸的siRNA靶點(diǎn)序列，即s1-Pokemon，包括正義鏈和反義鏈，其堿基序列如下:
[0007]正義鏈 5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；[0008]反義鏈5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述干擾片段的3 ’端還添加了兩個(gè)呈單鏈懸掛結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核苷酸，以增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)和體外的穩(wěn)定性，防止降解。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，選擇目前較為常見的陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑。
[0011]根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的SiRNA能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞中人Pokemon基因的表達(dá)，可應(yīng)用于制備抗腫瘤基因藥物。優(yōu)選實(shí)施例為人肝癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明要提供的siRNA的應(yīng)用，是指所提供的siRNA在制備對人Pokemon基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)、調(diào)整或抑制的基因藥物，特別是治療人Pokemon基因過度表達(dá)所引起的疾病(如惡性腫瘤)的基因藥物中的應(yīng)用。
[0013]上述基因藥物可通過靜脈或皮下給藥；所述藥物可通過局部給藥。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為RT-QPCR檢測人肝癌細(xì)胞株H印G2各實(shí)驗(yàn)組Pokemon基因的mRNA表達(dá)水平的結(jié)果圖。
[0015]圖2為RT-QPCR檢測人肺癌細(xì)胞株A549各實(shí)驗(yàn)組Pokemon基因的mRNA表達(dá)水平的結(jié)果圖。
[0016]圖3為RT-QPCR檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7各實(shí)驗(yàn)組Pokemon基因的mRNA表達(dá)水平的結(jié)果圖。
[0017]圖4為Western Blot檢測上述三株細(xì)胞H印G2、A549、MCF_7中各實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)水平的結(jié)果圖。
[0018]圖5為MTT法分析s1-Pokemon對人肝癌細(xì)胞株IfepG2細(xì)胞毒作用的結(jié)果圖。
[0019]圖6為MTT法分析s1-Pokemon對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞毒作用的結(jié)果圖。
[0020]圖7為MTT法分析s1-Pokemon對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞毒作用的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。
[0022]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，均為市售廣品。
[0023]實(shí)施例1siRNA的合成
[0024]本發(fā)明所提供的s1-Pokemon是根據(jù)人Pokemon mRNA序列而設(shè)計(jì),過程如下:從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的起始密碼(AUG)開始尋找，搜索“AA”二連序列，以其3’端相鄰19個(gè)堿基序列作為候選靶點(diǎn)，從中選擇GC含量不超過36.8%的siRNA序列，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫的blast功能，將所選序列與人類基因組序列進(jìn)行比對，排除和人的其他編碼序列同源的序列。在正義鏈3’端加2個(gè)dTdT的尾，指導(dǎo)siRNA形成RISC，也避免受核酸酶的降解。
[0025]本實(shí)施例選擇的s1-Pokemon對應(yīng)人Pokemon基因mRNA中1759-1779核苷酸位點(diǎn)，堿基序列如下:[0026]正義鏈5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；
[0027]反義鏈5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0028]本實(shí)施例選擇的陰性對照組(NC)堿基序列如下:
[0029]正義鏈5，-UUCUCCCGAACGUGUACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO:3)；
[0030]反義鏈5，-ACGUACACGUUCGGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0031]將上述設(shè)計(jì)序列委托百奧邁科生物技術(shù)有限公司通過化學(xué)法合成，本發(fā)明使用的siRNA雙鏈純度大于99%。
[0032]實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量PCR (RT-QPCR)檢測mRNA表達(dá)水平
[0033]1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0034]本實(shí)施例采用人肝癌細(xì)胞株H印G2、人肺癌細(xì)胞株A549和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行研究。以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基中加入濃度為IOOU / mL青霉素和IOOyg / mL鏈霉素(Invitrogen公司)，于37?、體積分?jǐn)?shù)5% CO2,相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035]2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0036]以肝癌細(xì)胞HepG2為例，另兩種細(xì)胞株可采用相同方法處理。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照24孔板接種密度為1.0 X IO5個(gè)/孔，提前一天接種細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度約為50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞內(nèi)，方法按照產(chǎn)品說明，siRNA終濃度為ΙΟΟηΜ。轉(zhuǎn)染時(shí)以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C轉(zhuǎn)染6h后，換成有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)的總RNA提取。
[0037]3、RT-QPCR 檢測 mRNA 表達(dá)水平
[0038](I)總RNA的提取:轉(zhuǎn)染48h后，采用RISO? RNA提取試劑(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)，按其說明書進(jìn)行提取細(xì)胞的總RNA，步驟如下:
[0039]I)棄去24孔板內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，加入250 μ L RISO試劑進(jìn)行裂解。室溫下放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離，轉(zhuǎn)移到離心管中。
[0040]2) 12000g，4°C離心10min，小心吸取上清液，移入新的離心管中。得到的勻漿液中加入50 μ L氯仿，蓋緊管蓋，上下振蕩15s，得渾濁液，無分層現(xiàn)象，室溫靜置2-3min。
[0041]3) 12000g，4°C離心15min。離心后，樣品分為三層:無色上清水相、中間蛋白層及下層有機(jī)相，水相的體積約為所用RISO試劑的60%。小心吸取無色上清液至另一離心管。加入125 μ L異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置lOmin。
[0042]4) 12000g，4°C離心10min。棄去上清，加250 μ L70%乙醇，渦旋振蕩混勻。7500g，4°C離心5min。棄盡上清，超凈工作臺(tái)真空離心干燥，加入適量DEPC-H2O溶解RNA沉淀。
[0043](2) RT-QPCR 檢測 mRNA 表達(dá)水平
使用EzOmics? One-Step QPCR試劑盒(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)，按操作說明進(jìn)行檢測。PCR 條件為:反應(yīng)體系 25yL，反應(yīng)程序:1)95°C，10min，2)95°C，20s，3)55°C，20s，4) 72°C，30s，2)-4)，45個(gè)循環(huán)。同時(shí)以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1，結(jié)果如圖1所示。
[0044]表1、RT-QPCR檢測用弓丨物序列
【權(quán)利要求】
1.一種用于抗腫瘤的SiRNA干擾片段，其特征在于，所述SiRNA的堿基序列如下: 正義鏈 5’-AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)； 反義鏈 5’-CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.權(quán)利要求1中所述的用于抗腫瘤的SiRNA，在制備對人Pokemon基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)、調(diào)整或抑制的基因藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，制備人Pokemon基因過度表達(dá)所引起疾病的基因藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，制備人Pokemon基因所調(diào)控的下游基因過度表達(dá)引起疾病的基因藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2~4中任一項(xiàng)所述的基因藥物，可用于腫瘤的預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后評價(jià)。
6.如權(quán)利要求2~5任一項(xiàng)所述的基因藥物，其特征在于，可通過靜脈或皮下給藥。
7.如權(quán)利要求2~6任一項(xiàng)所述的基因藥物，其特征在于，可通過局部給藥。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103937792SQ201410000101
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】周建平, 王偉, 王雅哲, 丁楊, 鮑秀麗 申請人:中國藥科大學(xué)