異香豆素類新抗生素和田霉素（Hetiamacin）B、C、D 及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供三個(gè)異香豆素類新抗生素和田霉素（Hetiamacin）B、C、D及其制備方法以及和田霉素B、C、D及其組合物在制備抗生素藥物中的應(yīng)用。上述化合物左側(cè)都具有所有Amicoumacin類化合物的骨架結(jié)構(gòu)：甲基丁基氨基-3,4-二氫-8-羥基異香豆素；右側(cè)側(cè)鏈上10′-C、11′-C、12′-C、14′-C與13′-NH、15′-NH相連，形成一個(gè)六氫嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)。上述化合物通過對枯草芽孢桿菌菌株的發(fā)酵并分離而得，對革蘭氏陽性細(xì)菌如葡萄球菌屬及其耐藥菌等具有很高的抑制活性，有望成為抗革蘭氏陽性菌藥物及其先導(dǎo)化合物而具有良好的藥用開發(fā)前景。
【專利說明】異香豆素類新抗生素和田霉素(Hetiamacin) B、C、D及其
制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組天然來源的異香豆素類(isocoumarin)新抗生素及其制備方法，以及其在制備抗革蘭氏陽性細(xì)菌及其耐藥菌感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]以“ESKAPE”為代表的耐藥菌日益猖獗，嚴(yán)重威脅著全球感染性疾病的治療。自1961年在英國首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)以來，MRSA占臨床上分得金黃色葡萄球菌的比例由20世紀(jì)80年代中期的1%~5%迅速迅速增加至目前的60%~70%，美國每年超過94000人感染MRSA，19000人死亡。據(jù)我國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)報(bào)告顯示:2011年我國臨床耐甲氧西林金葡菌MRSA分離率高達(dá)50%以上，部分MRSA對糖肽類抗生素低水平耐藥，即萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(VISA)，可見MRSA感染也是我國細(xì)菌耐藥的突出問題。雖然萬古霉素、利奈唑胺、達(dá)托霉素和替加環(huán)素等少數(shù)藥物經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)已用于臨床治療MRSA感染，但近年來臨床上已發(fā)現(xiàn)上述藥物的耐藥菌株，尤其是1996年萬古霉素不敏感金黃色葡萄球菌(VISA)及2002年第I株耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)的出現(xiàn)。MRSA已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的“超級細(xì)菌”，與艾滋病、病毒性乙型肝炎并稱為世界三大感染性疾病，成當(dāng)今感染醫(yī)學(xué)一個(gè)難題。因此研究開發(fā)針對MRSA的新的抗菌藥物刻不容緩。
[0003]Amicoumacin是一類來源于微生物的異香豆素類化合物。該類化合物具有異香豆素(isocoumarin)類母核結(jié)構(gòu)，自1975年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)該類抗生素baciphelacin以來，已報(bào)道了 20多種來源于微生物的Amicoumacin類化合物，它們具有抗菌、抗腫瘤，抗痕，抗病毒，抗炎，潰瘍保護(hù)，植物生長調(diào)節(jié)等廣泛的生物活性，尤其是抗MRSA的活性極為突出。1975年武田制藥株式會社Hisayoshi Okazaki等發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Amicoumacin類抗生素Baciphelacin對耐藥(耐青霉素、鏈霉素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)金黃色葡萄球菌有很好的抑制；而后1981年日本明治制菓株式會社(Meiji Seika Kaisha, Ltd.) Jiro Itoh等從短小芽抱桿菌Bacillus pumilus BN-103中首次分離到Amicoumacin A,對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的 MIC 值均小于 I μ g/mL ；2007 年日本武蔵野大學(xué)(Musashino University)的 Makoto Hasimoto 等活性研究表明，Amicoumacin A耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC43300的抗菌活性與萬古霉素相當(dāng)，MIC值分別為4和2.5 μ g/mL ;另外，1992年日本山之內(nèi)制藥株式會社Tutomu Sato等從芽抱桿菌BaciIIus sp.Y-05460M-A中分離得到的Y-05460M-A,2012年香港科技大學(xué)Li Yongxin等分離到的Bacilosarcins B,以及1981年美國專利報(bào)道的Amicoumacin類抗生素Kristenin,都具有抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或者抗MRSA的強(qiáng)活性。
[0004]本發(fā)明人從一株植物葉片內(nèi)生枯草芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物中分離得到三個(gè)Amicoumacin類抗生素一和田霉素(Hetiamacin) B、C、D,經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振等波譜學(xué)數(shù)據(jù)的仔細(xì)分析，確定和田霉素(Hetiamacin) B、C、D為Amicoumacin類新抗生素，該結(jié)構(gòu)與本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)表的Amicoumacin類抗生素Hetiamacin A(參見發(fā)明人的專利申請CN102977082A)相似，其側(cè)鏈都有一個(gè)獨(dú)特的六氫嘧唳環(huán)，但是與Hetiamacin A側(cè)鏈的成環(huán)位點(diǎn)不同。對Hetiamacin B、C、D進(jìn)行抗菌活性評價(jià)發(fā)現(xiàn)，三者對葡萄球菌屬，包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)都有抑制活性，其中Hetiamacin B的抗菌活性最強(qiáng)，MIC值均在1_2 μ g/ml范圍內(nèi)。因此，Hetiamacin B、C、D有望成為抗革蘭氏陽性細(xì)菌如葡萄球菌屬及其耐藥菌(MRSA)感染的藥物及先導(dǎo)化合物并具有潛在的良好開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是:提供三個(gè)異香豆素類新抗生素和田霉素(Hetiamacin) B、C、D，結(jié)構(gòu)如式(1)、(2)、(3)所示:
【權(quán)利要求】
1.和田霉素(Hetiamacin)B、C、D，結(jié)構(gòu)如式(I)、(2)、(3)所示:
2.—種權(quán)利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin) B、C、D的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 首先發(fā)酵培養(yǎng)保藏編號為CGMCC N0.6688的枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subtilissubsp.1naquosorum) PJS ； 然后從發(fā)酵物中提取、分離所述的和田霉素(Hetiamacin) B、C、D。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟為:將保藏編號為CGMCC N0.6688 的枯草芽抱桿菌菌株(Bacillus subtilis subsp.1naquosorum) PJS 接種于種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后收獲發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述提取、分離步驟包括:將發(fā)酵液離心后，上清濾液用大孔樹脂HP-20吸附，經(jīng)過不同比例的丙酮-水在大孔樹脂HP-20上洗脫，除去丙酮的洗脫液冷凍干燥后得粗提物；粗提物經(jīng)反向C18中壓柱洗脫分離，LC-MS檢測合并得到半純品；半純品溶于甲醇，用HPLC進(jìn)行制備，除去甲醇的水溶液冷凍干燥，得到成品。
5.如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述提取、分離步驟包括:發(fā)酵液經(jīng)離心、布氏漏斗抽濾后，以3-4BV/h (倍柱體積/小時(shí))的速度通過HP-20型大孔樹脂，流出液棄去；用1-2BV體積的蒸餾水洗滌樹脂層，再分別用2-3BV的30%、50%、80%丙酮-水溶液洗脫樹脂，除去洗脫液中丙酮，獲得的水溶液經(jīng)冷凍干燥后分別獲得30%丙酮-水溶液、50%丙酮-水溶液、80%丙酮-水溶液洗脫出的粉末狀粗品；而后50%丙酮-水溶液洗脫的粉末狀粗品用甲醇溶解，濕法上樣于RP-C18中壓柱，用甲醇-水進(jìn)行分級梯度洗脫(30%甲醇-水溶液150mL，60%甲醇-水溶液200mL，90%甲醇-水溶液200mL)，按5_6mL/管收集洗脫液；60%甲醇-水洗脫液進(jìn)行LC-MS的檢測，含相同成分的管合并后減壓濃縮，得到分別含有不同目標(biāo)化合物(MW=449或463)的半純品；半純品溶于甲醇，用HPLC進(jìn)行制備，以48%甲醇-水溶液，2mL/min的流速進(jìn)行等度洗脫，分別收集254nm紫外波長下出現(xiàn)在29min、26min、33min附近的色譜峰，除去甲醇的水溶液經(jīng)冷凍干燥，得到白色或淺黃色粉末狀的成品化合物即和田霉素(Hetiamacin) B、C、D。
6.如權(quán)利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin)B、C、D及其組合物在制備抗生素藥物中的用途。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗生素用于抗革蘭氏陽性細(xì)菌感染。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述細(xì)菌感染為革蘭氏陽性菌葡萄球菌屬及其耐藥菌所造成的感染。
9.枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的和田霉素(Hetiamacin)B、C、D中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為保藏編號為CGMCCN0.6688 的枯草芽抱桿菌 菌株 (Bacillus subtilis subsp.1naquosorum) PJS0
【文檔編號】A61P31/04GK103880824SQ201410047279
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】孫承航, 劉少偉, 王飛飛, 劉佳萌, 胡辛欣, 游雪甫, 蔣忠科 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所