O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑及其制備方法，該凝膠佐劑包括19～23g泊洛沙姆407、1～8g泊洛沙姆188以及水。制備方法是將泊洛沙姆407與泊洛沙姆188加入部分去離子水，冷藏靜置至完全溶解，加入剩余去離子水，臨用前，添加O型口蹄疫多肽抗原，使其濃度達(dá)到50μg/mL，搖勻。本發(fā)明制備的泊洛沙姆凝膠佐劑具有高的免疫學(xué)性能及良好的體外緩釋性能。
【專利說明】O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑，屬于藥劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]泊洛沙姆是一類由聚氧乙烯(ΡΕ0)、聚氧丙烯(PPO)組成的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0型非離子三嵌段共聚物，已被美國和歐洲藥典收錄，已注冊的商品名有Pluronic, Synperonic或Tetronic0當(dāng)泊洛沙姆水溶液的濃度處于某一臨界值之上之后，隨著溫度的上升，表現(xiàn)出溶膠-凝膠(低溫溶膠-凝膠邊界)和凝膠-溶膠(高溫凝膠-溶膠邊界)的轉(zhuǎn)變，凝膠相在兩臨界轉(zhuǎn)變溫度之間出現(xiàn)，轉(zhuǎn)變溫度依聚合物組成和濃度而異。
[0003]泊洛沙姆溫敏凝膠具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括良好的生物相容性、順應(yīng)性和緩控釋能力，和較高的安全性，泊洛沙姆188的急性毒性試驗表明其LD50 (小鼠，iv)達(dá)到lg/kg，大鼠為
7.5g/kg，對家兔進(jìn)行為期14天的靜脈注射(0.5g/kg.d)未見明顯不良反應(yīng)。溫度敏感原位凝膠給藥體系經(jīng)液體形式注射，在注射部位形成藥物儲庫，達(dá)到緩慢釋放藥物的目的?，F(xiàn)有研究多應(yīng)用于藥物制劑，滴眼劑，栓劑，凝膠劑等，在生物制品上的應(yīng)用報道較少，尤其是獸醫(yī)上應(yīng)用目前國內(nèi)未見報道。
[0004]近年來，我國在多肽類抗原藥物的研究有了較大的發(fā)展，多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問題。由于多肽疫苗價廉、安全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到重視，但也因其免疫原性差、功效低以及半衰期短等不足影響了免疫效果。Freund等首次報道油乳佐劑具有增強(qiáng)疫苗免疫活性的作用，有人發(fā)現(xiàn)礦物油制成的佐劑可刺激機(jī)體產(chǎn)生更高的抗體水平，其中使用較多的是弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐`劑(FIA)。弗氏完全佐劑是礦物油和乳化劑形成W/0乳液后，再加入滅活的分支桿菌；弗氏不完全佐劑是在弗氏完全佐劑中未加分支桿菌成分。兩種佐劑因具有高度活性被應(yīng)用于科研工作中，但其較大的毒副反應(yīng)(包括潰瘍、肉芽腫、發(fā)熱等)限制了其在臨床上的應(yīng)用；AS02佐劑是含有MPL和QS-21的乳劑，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答、Thl型和CTL應(yīng)答。臨床試驗表明，AS02佐劑在結(jié)核、乙肝、癌癥、瘧疾和HIV疫苗中的主要副反應(yīng)包括全身寒戰(zhàn)、肌痛、頭痛和局部疼痛，而且在瘧疾疫苗的臨床試驗中發(fā)現(xiàn)對兒童可產(chǎn)生良好的持續(xù)性抗體應(yīng)答。整體而言，油乳佐劑雖然具有增強(qiáng)疫苗免疫活性的功能，但毒副作用大，對機(jī)體的刺激性強(qiáng)，容易引起炎癥反應(yīng)及其他不良反應(yīng)，需要改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑，具有高的免疫性性能及具有良好的緩慢釋放性能。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑，其特征在于包括以下組份:
[0008]泊洛沙姆407 19~23g[0009]泊洛沙姆188 I~8g
[0010]水加至 100mL。
[0011]制備方法如下:稱量去離子水，將泊洛沙姆407與泊洛沙姆188加入去離子水適量，4°C靜置24h，加入去離子水至所需比例，臨用前，添加O型口蹄疫多肽抗原，使其濃度達(dá)到50 μ g/mL,搖勻。
[0012]1、本發(fā)明申請采用泊洛沙姆作為疫苗佐劑，具有較好的生物相容性及安全性，將兩種不同規(guī)格的泊洛沙姆進(jìn)行配比，調(diào)節(jié)凝膠的膠凝溫度和粘度，可以產(chǎn)生不同程度的免疫效果，試驗中發(fā)現(xiàn)，粘度較高的高配比佐劑激發(fā)的免疫效果更好。采用冷溶法制備泊洛沙姆溫敏凝膠，通過調(diào)整泊洛沙姆407和泊洛沙姆188用量比例控制其穩(wěn)定性和膠凝溫度，獲得膠凝溫度為33.0±2.(TC的泊洛沙姆溫敏凝膠溶液；
[0013]2、建立無膜溶出模型，采用測重法對泊洛沙姆溫敏凝膠的體外溶蝕情況進(jìn)行檢測，并采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對泊洛沙姆溫敏凝膠的體外多肽釋放情況進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在8h時的蛋白釋放度已達(dá)到全部蛋白水平的90%。
[0014]3、將泊洛沙姆溫敏凝膠包裹O型口蹄疫多肽疫苗，對Wistar大鼠進(jìn)行免疫，于3-8周采用ELISA檢測免疫后抗體產(chǎn)生情況，抗體效價最高能夠達(dá)到29，而商品化油佐劑對照組為 210。
[0015]總體而言，本申請制備了 O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑，延長了泊洛沙姆在體內(nèi)的多肽釋放時間、提高了 O型口蹄疫多肽疫苗的免疫效價。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為實(shí)施例2所制備的泊洛沙姆溫敏凝膠體外蛋白釋放曲線；進(jìn)行釋放度試驗時設(shè)定恒溫?fù)u床的溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，在一 50mL離心管中，先將2mL含有口蹄疫多肽的凝膠加入到離心管底部放置0.5h，待凝膠完全膠凝后在凝膠上層小心加入20mL的同溫水，分別在0.5，I, 2，4，8，12，18，24h取上層水0.5mL，緩慢補(bǔ)充0.5mL的同溫水。由圖1可見，在8h時的蛋白釋放度已高于全部蛋白水平的90%。
[0017]圖2是所得泊洛沙姆凝膠佐劑的免疫學(xué)試驗結(jié)果圖，由圖2可見，陽性對照組抗體效價較高，在6-8周達(dá)到了 21° ;實(shí)施例1組與實(shí)施例2組的血清抗體效價低于陽性對照組，且在6-8周時抗體效價從25-2w不等。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019]O型口蹄疫多肽抗原(由申聯(lián)生物醫(yī)藥(上海)有限公司提供)，濃度7.88mg/mL;泊洛沙姆407和泊洛沙姆188 (購于巴斯夫(中國)有限公司)。
[0020]實(shí)施例1至5制備泊洛沙姆凝膠佐劑所采用的原料用量如表1:
[0021]表1
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑，其特征在于包括以下組份: 泊洛沙姆40719~23g 泊洛沙姆1881~8g 水加至1OOmL。
2.權(quán)利要求1所述的O型口蹄疫多肽的泊洛沙姆凝膠佐劑制備方法，其特征在于步驟如下:將泊洛沙姆407與泊洛沙姆188加入部分去離子水，冷藏靜置至完全溶解，加入剩余去離子水，臨用前，添加O型口蹄疫多肽抗原，使其濃度達(dá)到50μ g/mL，搖勻。
【文檔編號】A61K9/06GK103751779SQ201410063148
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】王霄旸, 王昊欣, 張可煜, 薛飛群, 張麗芳, 費(fèi)陳忠, 王米 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所