一種降血脂活性組份的制備方法及醫(yī)療用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降血脂活性組份的制備方法及醫(yī)療用途，本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一類從五加科人參屬植物人參中提取、分離獲得的具有抑制二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)活性的組份。經(jīng)多次體外二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶抑制實驗表明，該組份具有明顯的DGAT1抑制活性，可在制備治療和預防高血脂、動脈粥樣硬化、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應用。對開發(fā)利用中國的藥用植物資源具有重要意義。
【專利說明】一種降血脂活性組份的制備方法及醫(yī)療用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種治療高血脂癥的人參活性組份，并公開其具有降血脂作用的活性組份及提取方法，同時還提供了其醫(yī)療用途。本發(fā)明活性組份經(jīng)多次體外二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶I (Diacylgycerol Acyltransferase, DGATl)實驗表明，該活性組份能夠明顯的抑制DGATl活性，可在制備降血脂、抗動脈粥樣硬化、降體重及并發(fā)癥藥物中應用，涉及中醫(yī)藥學【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]高血脂癥主要是指血清總膽固醇(TC)或三酰甘油(TG)水平過高和(或)血清高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平過低，而引起的一系列嚴重危害人體健康的疾病。隨著人們生活水平的逐漸提高，飲食及生活方式的改變，人口老齡化的到來，患高血脂癥的人群不斷增長。研究表明，高血脂是導致動脈粥樣硬化的元兇，而動脈硬化是導致心腦血管疾病(心絞痛、心肌梗塞、偏癱)的罪魁禍首。由高血脂引發(fā)心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，全世界每年有1500萬人死于心腦血管疾病，遠遠高于癌癥死亡人數(shù)。
[0003]DGAT 是一種二脂酸甘油酸基轉(zhuǎn)移酶(Diacylgycerol Acyltransferase, DGAT),該酶與脂肪代謝、脂類在組織中的沉積有很大關(guān)系，它的主要作用機制是使二酰甘油(Diacylgycerol,DAG)加上脂肪酸?；纬扇８视?triacylgycerol, TG)。編碼該酶的基因有DGATl和DGAT2，前者屬于ACAT基因家族，后者屬于MGATl基因家族。DGATl催化?；妮o酶A和二酰基甘油合成TG，TG在體內(nèi)過剩時導致動脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病。因此，通過尋找選擇性作用于DGATl的抑制劑，降低血清中三酰甘油的形成，從而調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，降低體重，改善脂肪肝，成為越來越受關(guān)注的治療及預防高脂血癥的新途。Zhao 等[Zhao G, Souers AJ, Voorbach M, et al.Validation ofdiacyl glycerolacyItransferase I as a novel target for the treatment of obesityand dyslipidemia using a potent and selective small molecule inhibitor.J MedChem, 2008, 51: 380-3]報道針對DGATl化學合成的小分子化合物4a對鼠和人的DGATl有較強的抑制效果，IC5tl分別為24nmol/L、7 nmol/L, 口服化合物4a可使飲食誘導的肥胖小鼠體重減輕，肝臟TG明顯減少，而不影響攝食量，且四周內(nèi)體重未出現(xiàn)反彈。Birch等[Birch AM, Birtles S， Buckett LK, et al.Discovery of a potent, selective, andorally efficacious pyrimidinooxazinyl bieyelooctaneacetic acid diacylglycerolacyltransferase-1 inhibitor.J Med Chem, 2009，52 (6): 1558-68]報道的口服有效DGATl抑制劑(15 nmol/L)對飲食誘導的肥胖小鼠也具有減肥作用。許多醫(yī)藥企業(yè)也針對DGATl開展臨床前研究。
[0004]2006年，輝瑞公司的DGATl抑制劑BAY74-4113已處于I期臨床試驗；2009年，諾華的DGATl抑制劑已進入II臨床試驗。DGATl已逐漸成為肥胖、脂代謝紊亂、糖尿病等疾病藥物的研究熱點。目前還沒有以DGATl為靶點的天然降血脂藥物上市，這為我們從天然資源里尋找高效、高選擇性地小分子DGATl抑制劑提供了機遇。
[0005]本發(fā)明涉及的人參屬于五加科,主要生長在東亞,特別是寒冷地區(qū)，是亞洲常見藥材，用于愈后恢復、增強體力、抗動脈粥樣硬化、降低血糖和控制血壓、控制肝指數(shù)和肝功能保健等功效。
[0006]本發(fā)明首次從人參中分離得到具有抑制DGATl的活性組份，經(jīng)多次藥理實驗研究，發(fā)現(xiàn)該活性組份具有顯著抑制DGATl活性及降血脂作用，經(jīng)文獻檢索，未見該類植物具有此方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供具有降血脂作用的人參醇提活性組份及其制備方法，其目的是用于治療高血脂癥、抗動脈粥樣硬化、肥胖癥及并發(fā)癥疾病。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供如上限定的活性組份在生產(chǎn)用于抑制二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶I (DGATl)的抑制劑。
[0009]本發(fā)明公開人參降血脂活性組份，其主要制備方法包括以下步驟:
1)稱取人參干燥品300g，加入1-2倍量的50%乙醇浸泡I小時，利用超聲波提取I至3小時,抽濾并收集濾液；
2)濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，收集濃縮液，放涼，加入2-3倍量水并攪拌，常溫靜置24小時，析出沉淀，過濾或離心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加熱，除去乙醇和水，直至無醇味，即得人參醇提物；
3)將人參醇提物經(jīng)過150μ m反相色譜，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用反相薄層層析檢測，成份相同的分離組分合并、濃縮后得到Fl至FlO十個分離組分；
4)將F2組分經(jīng)HP-20大孔色譜，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)為流動相進行梯度洗脫，收集乙醇/水(V/V，3:7)的分離組分、濃縮后得到人參活性組份。
[0010]本發(fā)明活性組份不僅可用于二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGATl)的抑制劑及治療各種高血脂癥、動脈粥樣硬化、肥胖癥及其它由此引發(fā)的并發(fā)癥。另外，也可以使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液活者低濃度(如1-100 mM)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為載體加入助溶劑制成口服給藥的溶液劑和懸浮劑。
[0011]對所得本發(fā)明提取物進行了甘油?；D(zhuǎn)移酶抑制活性試驗，表明其具有明顯的抑制活性。
[0012]測試原理:使用表達在昆蟲細胞膜的人類DGATl作為酶源，二酰甘油(Diacylgycerol，DAG)在DGAT的作用下與脂肪酸酰基輔酶A形成三酰甘油(triacylgycerol, TG)。將甘油?；?輔酶A用14C標記,通過液體閃爍照相法檢測產(chǎn)物的放射性來觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。
[0013]試驗例I` 本發(fā)明活性組份的DGATl活性抑制試驗
實驗方法=DGATl抑制劑的體外檢測使用表達在昆蟲細胞膜的人類DGATl作為酶源(Proc.Natl.Acad.sc1.1998, 95，13018-13023)。將 sf9 細胞用包含人類 DGATl 編碼序列的重組桿狀病毒進行感染，48小時后采集。細胞通過超聲溶解法溶解，并在4°C條件下，在40%蔗糖溶液中以28000rpm轉(zhuǎn)速離心分離I小時，得到所述隔膜。收集，清洗細胞間的隔月吳碎片并在液氣中儲存。
[0014]DGATI活性檢測通過修正的科爾曼(CoIeman)所描述的方法進行(methodsinEnzymologyl992, 209, 98-102)。反應體系中包含，10 μ M樣品，上述方法得到的0.4 μ g膜蛋白質(zhì)，5mM 1%(:12和1.2禮^1，2-二?；视?丙三醇，用蒸餾水調(diào)整總檢測體積至200 μ L，在試管中培養(yǎng)。通過在上述體系中加入lOOymol/L 14C甘油?；?輔酶A(0.05 μ Ci)進行反應，并于25°C條件下進行溫和短暫的震蕩。30 min后通過加入1.5mL2-丙醇:庚烷:水(80:20:2)終止反應。反應停止后加入1.0mL庚烷和0.5mL 0.1M碳酸鹽緩沖液(PH9.5)，將放射性三酰甘油產(chǎn)物分離到有機相中，并用2.0 ml的堿性乙醇溶液(乙醇:0.5 N NaOH: H20=50:10:40)洗滌一次。用液體閃爍照相法檢測上層庚烷層的放射性來量化DGATl活性。實驗結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種具有降血脂作用的人參活性組份的制備方法。
2.根據(jù)要求I人參活性組份的制備方法，具體包括以下步驟: 1)稱取人參干燥品300g，加入1-2倍量的50%乙醇浸泡I小時，利用超聲波提取I至3小時,抽濾并收集濾液； 2)濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，收集濃縮液，放涼，加入2-3倍量水并攪拌，常溫靜置24小時，析出沉淀，過濾或離心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加熱，除去乙醇和水，直至無醇味，即得人參醇提物； 3)將人參醇提物經(jīng)過150μ m反相色譜，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用反相薄層層析檢測，成份相同的分離組分合并、濃縮后得到Fl至FlO十個分離組分； 4)將F2組分經(jīng)HP-20大孔色譜，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)為流動相進行梯度洗脫，收集乙醇/水(V/V，3:7)的分離組分、濃縮后得到人參活性組份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于人參活性組份回流提取所用的有機醇濃度大于或等于50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述人參活性組份在治療和預防各種高血脂、動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥藥物中應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述 人參活性組份在脂代謝紊亂中的降體重用途。
【文檔編號】A61P3/06GK103877136SQ201410110998
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】崔龍, 張南, 李佳琳, 李娜, 馬坤, 邢姍姍 申請人:北華大學