一種治療或預(yù)防過敏性疾病的有效成分的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療或預(yù)防過敏性疾病的有效成分，其中該有效成分為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。此外，本發(fā)明還提供了甘油醛-3-磷酸脫氫酶在制備治療或預(yù)防過敏性疾病的藥劑中的用途，以及在制備治療或預(yù)防氣喘或異位性皮膚炎的藥劑中的用途。
【專利說明】一種治療或預(yù)防過敏性疾病的有效成分

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗過敏活性物質(zhì)的用途，具體而言，該包含該抗過敏活性物質(zhì)的 組合物可用于制備預(yù)防或治療過敏性疾病的藥劑，尤其是氣喘或異位性皮膚炎。

【背景技術(shù)】
[0002] 過敏性疾病，例如過敏性濕疹、蕁麻疹、反復(fù)發(fā)作的過敏性鼻炎、過敏性氣喘及異 位性皮膚炎，在臺灣及其他已開發(fā)國家已成為嚴(yán)重的社會問題，廣為人知的衛(wèi)生假說為：嬰 幼兒接觸免疫刺激病原體的機(jī)會愈少，愈容易引發(fā)過敏相關(guān)疾病的產(chǎn)生。相關(guān)研究指出，過 敏性疾病發(fā)生時，人體內(nèi)的免疫反應(yīng)會使Thl細(xì)胞數(shù)量下降，連續(xù)產(chǎn)生多種細(xì)胞激素促使 免疫反應(yīng)朝向Th2途徑，形成體液免疫反應(yīng)，例如IgE的產(chǎn)生及嗜伊紅血球過多等，經(jīng)由刺 激Thl型免疫反應(yīng)以調(diào)節(jié)、平衡過敏所引發(fā)Th2型免疫反應(yīng)，將可達(dá)到改善過敏體質(zhì)的效 果。
[0003] 但針對氣喘的治療，目前仍以藥物治療為主：如類固醇和抑制肥大細(xì)胞釋放發(fā)炎 物質(zhì)的藥物、氣管擴(kuò)張劑和免疫療法等。然而，包括抗發(fā)炎藥物和氣管擴(kuò)張劑在內(nèi)的藥物治 療仍無法真正的改變過敏免疫反應(yīng)，僅為一種治標(biāo)的方法。
[0004] 于異位性皮膚炎治療上，目前為局部涂抹類固醇（topical corticosteroids, TCS)(Lowenberg et al.，2008)或是局部免疫抑制劑（topical calcineurin inhibitors, TCI) (Hultsch et al.，2005;Kim et al·，2010)為最快速有效的 方式。但是，仍有一些副作用的疑慮如長期使用類固醇會有皮膚萎縮、皮膚色素改變、皮膚 出現(xiàn)血絲、甚至造成像妊娠紋般的擴(kuò)張紋，且類固醇于人體吸收后可能影響賀爾蒙分泌。而 免疫抑制劑也會造成皮膚灼熱與刺激感等的副作用。因此，異位性皮膚炎的治療仍需以有 效改善皮膚發(fā)炎反應(yīng)并且沒有副作用為目標(biāo)。
[0005] 另一方面，減敏療法雖能改變過敏免疫體質(zhì)，但是通常需要較長的一段時間，且有 時會出現(xiàn)一些副作用，并非所有的病人都能夠使用。
[0006] 因此，仍需開發(fā)具抗過敏活性的活性成分，以刺激免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)Thl/Th2免疫反 應(yīng)為作用機(jī)制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)甘油醒-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde3_phosphate Dehydrogenase, G3FOH)具有抗過敏活性，可降低個體過敏反應(yīng)，因而可開發(fā)為治療或預(yù)防 過敏性疾病的藥劑，進(jìn)一步驗(yàn)證其亦可開發(fā)為治療或預(yù)防氣喘或異位性皮膚炎的藥劑。
[0008] 因此，本發(fā)明一方面提供一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (Glyceraldehyde3_phosphate Dehydrogenase,63Η)Η)或其具相同功能的變異體或片段在 制備降低個體過敏反應(yīng)的藥劑中的用途。
[0009] 在一方面，本發(fā)明提供一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變異體或片 段在制備治療或預(yù)防過敏性疾病的藥劑中的用途。其中該過敏性疾病可為氣喘或異位性皮 膚炎。
[0010] 另一方面，本發(fā)明所提供的甘油醛-3-磷酸脫氫酶具有SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列。
[0011] 此外，本發(fā)明所提供的甘油醛-3-磷酸脫氫酶是選自由加氏乳酸桿菌 (Lactobacillus gasseri)PM_A0005菌株（簡稱「PM-A0005菌株」）及其萃取物、區(qū)分物、次 區(qū)分物或有效成分所組成的群組；其中該P(yáng)M-A0005菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 其菌種保藏編號為CCTCC NO :M207039。該P(yáng)M-A0005菌株已于2007年1月5日申請專利， 并記載在臺灣專利第1356680號中。
[0012] 在一方面。本發(fā)明所提供的PM-A0005菌株的萃取物、區(qū)分物及次區(qū)分物可與生理 上可接受的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物或食品組合物。
[0013] 在另一方面，本發(fā)明所提供的甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變異體或 片段可與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物或食品組合物。
[0014] 除此之外，本發(fā)明提供一種加氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri)PM_A0005菌 株在制備治療或預(yù)防異位性皮膚炎的藥劑中的用途，其中該P(yáng)M-A0005菌株保藏在中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，其菌種保藏編號為CCTCC NO :M207039。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物為溶菌酶分解該P(yáng)M-A0005菌株 菌體后再以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，該萃取物為以濃度 為大于0且小于等于25% (w/w)或濃度為50-75% (w/w)的硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得， 其萃取物編號分別為AS_0-25%或AS_50-75%。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該P(yáng)M-A0005菌株萃取物的區(qū)分物為溶菌酶分解該 PM-A0005菌株菌體后再以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得萃取物后，其再經(jīng)離子交換層析 (ion-exchange chromatography)分離而得。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，該區(qū)分物編號分別 為 IE1-2、IE1-3、IE3-2 及 IE3-3。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例，該P(yáng)M-A0005菌株萃取物的次區(qū)分物為溶菌酶分解該 PM-A0005菌株菌體后再以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得的萃取物，其再經(jīng)離子交換層析分 離獲得區(qū)分物后，再以膠體過濾層析法分離而得。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，該次區(qū)分物 IE3-3G1的有效成分為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
[0018] 本發(fā)明的各種具體實(shí)施例于下文詳述。本發(fā)明的其他特征將可由下文有關(guān)該等各 種具體實(shí)施例的詳細(xì)敘述、圖式及申請專利范圍而清楚呈現(xiàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 在本發(fā)明中所呈現(xiàn)的較佳具體實(shí)施例圖式為闡述本發(fā)明為目的。應(yīng)被理解的是， 本發(fā)明并不局限于所示的較佳具體實(shí)施例。數(shù)據(jù)以平均值土SD表示。其中*:P< 0.05、 **:P < 0· 01、***:P < 0· 001，成對 t 檢定（paired t-test)。
[0020] 圖1A-1C顯示該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物經(jīng)離子交換層析進(jìn)一步分離活性物質(zhì)的 結(jié)果；圖1A為離子交換層析的條件設(shè)定；圖1B為萃取物AS_0-25%所分離出3個區(qū)分物 (fractions);及圖1C為萃取物AS_50-75%所分離出3個區(qū)分物；
[0021] 圖2A-2E顯示將區(qū)分物IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3利用膠體過濾層析進(jìn)一步 分離活性物質(zhì)的結(jié)果；圖2A為膠體過濾層析的條件設(shè)定；圖2B為區(qū)分物IE1-2所分離出 1個次區(qū)分物（subfraction) IE1-2G1 ;圖2C為IE1-3所分離出2個次區(qū)分物IE1-3G1和 IE1-3G2 ;圖2D為IE3-2所分離出3個次區(qū)分物IE3-2G1、IE3-2G2和IE3-2G3 ;及圖2E為 IE3-3 所分離出 5 個次區(qū)分物 IE3-3G1、IE3-3G2、IE3-3G3、IE3-3G4 和 IE3-3G5 ;
[0022] 圖3為在給予小鼠萃取物AS_50-75% (塵螨致敏-AS)及次區(qū)分物IE3-3G1 (塵螨 致敏-IE)后，以甲基膽堿誘發(fā)氣管收縮并測量小鼠呼吸道阻力的結(jié)果，其中呼吸道阻力是 以Penh表示；
[0023] 圖4A-4C為塵螨致敏小鼠的肺部組織變化評估，顯示投予萃取物AS_50_75%和次 區(qū)分物IE3-3G1可顯著降低肺臟的發(fā)炎與細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；圖4A為肺部細(xì)胞沖洗液的細(xì)胞計 數(shù)結(jié)果；圖4B為肺部細(xì)胞沖洗液的細(xì)胞分類；及圖4C為肺部細(xì)胞沖洗液中胸腺活化調(diào)節(jié) 趨化因子（thymus and activation-regulated chemokine，TARC)濃度，其中塵螨致敏-AS 組投予萃取物AS_50-75% ;塵螨致敏-IE組投予次區(qū)分物IE3-3G1 ;
[0024] 圖5為塵螨致敏小鼠的肺部組織H&E染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)投予萃取物AS_50_75% 和次區(qū)分物IE3-3G1分別可有效地降低小鼠氣管壁增厚及改善免疫細(xì)胞大量浸潤等現(xiàn) 象；其中對照組為正常小鼠；塵螨致敏組以以塵螨致敏；而塵螨致敏-AS組投予萃取物 AS_50-75% ;塵螨致敏-IE組則投予次區(qū)分物IE3-3G1 ;
[0025] 圖6A-6D為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠的生理 特征。圖6A為小鼠皮膚外觀；圖6B為Cutometer ?MPA 580測量皮膚含水量的結(jié)果；圖 6C為Cutometer ?MPA 580所測量的pH值；及圖6D為利用Tewameter TM210儀器測量表 皮水分經(jīng)皮膚蒸發(fā)量（Trans-epidermal water loss, TEWL)的結(jié)果；
[0026] 圖 7A-7D 為 IE3-3G1 或PBS 以腹腔（intraperitoneal，i. ρ·)注射治療以塵螨（Der P)或卵白蛋白（Ovalbumin, OVA)致敏的異位性皮膚炎小鼠生理特征；圖7A為小鼠皮膚外 觀；圖7B為以Cutometer ?MPA 580測量皮膚含水量的結(jié)果；圖7C為Cutometer ?MPA 580所測量的pH值；及圖7D為利用Tewameter TM210儀器測量表皮水分經(jīng)皮膚蒸發(fā)量 (Trans-epidermal water loss, TEWL)的結(jié)果；
[0027] 圖8A-8C為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠 后其皮膚厚度及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤結(jié)果。圖8A為致敏皮膚位置的蘇木精-伊紅染色 (hematoxylin-eosin stain，H&E stain)切片結(jié)果；圖8B為以H&E染色切片所測量的皮膚 厚度；及圖8C為每切片視圖的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目；
[0028] 圖9A-9C為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋白 (0VA)致敏的異位性皮膚炎小鼠其皮膚厚度及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤結(jié)果。圖9A為致敏皮膚 位置的蘇木精-伊紅染色（H&E stain)切片結(jié)果；圖9B為由H&E染色切片所測量的皮膚厚 度；及圖9C為每切片視圖的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目；
[0029] 圖10為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠后其胸腺 基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素 （thymic stromal lymphopoietin，TSLP)的表達(dá)結(jié)果；
[0030] 圖11A-11B為劑量107CFU或109CFU鵝PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠后其 蘭格罕細(xì)胞（langerhans cells)的數(shù)目變化。圖11A為致敏皮膚位置染色切片結(jié)果；圖 11B為每切片視圖于表皮層或真皮層的蘭格罕細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目；
[0031] 圖12為IE3-3G1或PBS以腹腔（i.p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋白（0VA) 致敏的異位性皮膚炎小鼠其TSLP表達(dá)結(jié)果；
[0032] 圖13A-13B為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋 白（0VA)致敏的異位性皮膚炎小鼠其蘭格罕細(xì)胞（langerhans cells)的數(shù)目變化。圖13A 為致敏皮膚位置染色切片結(jié)果；圖13B為每切片視圖于表皮層或真皮層的蘭格罕細(xì)胞細(xì)胞 數(shù)目；
[0033] 圖14A-14B為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠后其 總IgE (圖14A)及0VA-特異性IgE (圖14B)的變化。
[0034] 圖15A-15B為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋 白（0VA)致敏的異位性皮膚炎小鼠其總IgE (圖15A)及0VA-特異性IgE (圖15B)的變化；
[0035] 圖16為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠其以白血 球凝集素（leuc〇agglutinin，PHA-L)或不同濃度0VA刺激脾臟細(xì)胞后，該脾臟細(xì)胞的增生 能力變化結(jié)果；
[0036] 圖17A-17B為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋 白（0VA)致敏的異位性皮膚炎小鼠其以PHA-L、不同濃度0VA (圖17A)或Derp (圖17B)刺 激脾臟細(xì)胞后，該脾臟細(xì)胞的增生能力變化結(jié)果；
[0037] 圖18A-18C為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠其 以PHA-L、不同濃度0VA刺激脾臟細(xì)胞后，其細(xì)胞激素 IFN- γ (Interferon- γ )(圖18A)、 IL-17(圖18B)及IL-10 (圖18C)的變化結(jié)果；
[0038] 圖19A-19C為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. p.)注射治療以塵螨（Der p)或卵白蛋 白（0VA)致敏的異位性皮膚炎小鼠其以PHA-L、不同濃度Der p或0VA刺激脾臟細(xì)胞后，其 細(xì)胞激素 IFN-γ (圖19A)、IL-17 (圖19B)及IL-10 (圖19C)的變化結(jié)果。
[0039] 圖20為劑量107CFU或109CFU的PM-A0005 口服治療異位性皮膚炎小鼠其IL-17 表達(dá)情形的染色切片結(jié)果；
[0040] 圖21為IE3-3G1或PBS以腹腔（i. P.)注射治療以塵螨（Der P)或卵白蛋白（0VA) 致敏的異位性皮膚炎小鼠其IL-17表達(dá)情形的染色切片結(jié)果；
[0041] 圖22為次區(qū)分物IE3-3G1的蛋白質(zhì)二維電泳分析結(jié)果。編號1-編號5為甘油 醛-3-磷酸脫氫酶；編號6為果糖二磷酸醛縮酶；
[0042] 圖23以考馬斯藍(lán)染色及使用抗組胺酸（Histidine)抗體進(jìn)行Western blot分析 鑒定G3PDH重組蛋白質(zhì)；其中Μ :蛋白質(zhì)分子標(biāo)記；1 :次區(qū)分物IE3-3G1 ;2 :G3roH-His重組 蛋白；
[0043] 圖24為G3PDH重組蛋白刺激小鼠樹突細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞激素 IL-12 (IL12p40)以評 估對于免疫調(diào)節(jié)的功效的結(jié)果；其中以添加脂多醣（lip〇P〇lysaccharide，LPS)或PHA為正 對照組，僅有細(xì)胞而未額外添加刺激物組為對照組；
[0044] 圖25為G3PDH重組蛋白刺激小鼠脾臟細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞激素 Interferon- γ (IFN- γ ) 以評估對于免疫調(diào)節(jié)的功效的結(jié)果；其中以添加 LPS或PHA為正對照組，僅有細(xì)胞而未額外 添加刺激物組為對照組。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 除非另有定義，此處所始有使用的技術(shù)及科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】技 術(shù)人員一般所了解的相同含義。此處所使用，如有矛盾的情形，以本文件(包括定義）為準(zhǔn)。
[0046] 本文所使用的「一」一詞，如未特別指明，是指該冠詞的文法上受詞為一個或一個 以上（即至少為一個)。例如「一成份」是指一成份或多于一成份。
[0047] 本文所使用的「過敏性疾病」一詞，是指過敏原、過敏原特異性的免疫球蛋白 E(IgE)以及肥大細(xì)胞等的共同作用所引發(fā)的疾病。首先是過敏原與附在肥大細(xì)胞固定區(qū) (fragment constant, Fc)受體的免疫球蛋白E結(jié)合后，促使肥胖細(xì)胞進(jìn)行去顆粒作用。而 由顆粒釋出一些介質(zhì)如組織胺，白三烯素及趨化因子等，這些介質(zhì)進(jìn)而造成血管的通透性 增加及氣管的收縮而導(dǎo)致癥狀，同時也會吸引一些其他的細(xì)胞如中性白血球，嗜伊紅性白 血球等，導(dǎo)致相當(dāng)程度的發(fā)炎反應(yīng)，造成更進(jìn)一步皮膚、黏膜組織或是血管的慢性發(fā)炎。過 敏疾病包括但不限于異位性皮膚炎、過敏性鼻炎與氣喘、以及一些特定的食物與昆蟲叮咬 引起的過敏。這些疾病會導(dǎo)致相當(dāng)程度的發(fā)炎反應(yīng)，造成皮膚、黏膜組織或是血管的慢性發(fā) 炎。
[0048] 本文所使用的「氣喘」一詞，是指因吸入具有誘發(fā)性的過敏原引起無法控制的氣道 過度反應(yīng)，并伴隨呼吸道結(jié)構(gòu)的改變，包括但不限于上皮的增生、黏膜組織的變形、呼吸道 平滑肌的增生、以及細(xì)胞外基質(zhì)的增生。
[0049] 本文所使用的「異位性皮膚炎」一詞，是指一種皮膚炎的形式，其為一種復(fù)發(fā)性 但不具有傳染性的皮膚發(fā)炎及皮膚搔癢癥狀，包括但不限于神經(jīng)性皮膚炎、內(nèi)源性濕疹、 屈部濕疹及嬰兒濕疹。
[0050] 本文所使用的「具相同功能的變異體」一詞，是指一使用例如重組基因技術(shù)而得， 藉由一或若干個氨基酸插入、缺失或取代不同于已知蛋白質(zhì)氨基酸序列但不影響其功能的 多肽。例如，氨基酸取代是以另一具有相似結(jié)構(gòu)及/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸置換一氨基酸的 結(jié)果(意即保守氨基酸置換)。而保守氨基酸取代可基于涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏 水性、親水性及/或兩親性質(zhì)的相似性而進(jìn)行。氨基酸插入或氨基酸缺失則較佳在約1至 20個氨基酸范圍內(nèi)，更佳為1至10個氨基酸。允許的變化可通過使用重組基因技術(shù)在多肽 分子中系統(tǒng)地使氨基酸插入、缺失或取代及鑒定所得重組變異體的活性及功能實(shí)驗(yàn)而找出 具相同功能的變異體。本文所使用的「具相同功能的片段」一詞，是指已知蛋白質(zhì)或具相同 功能變異體中提供相同功能的部位的氨基酸片段。例如，抗原決定部位的氨基酸序列。
[0051] 本文所使用的「可接受」一詞，是指該載劑必需與組合物的活性成分兼容(較佳為 能穩(wěn)定該活性成分）且對被治療個體無害。
[0052] 本文所使用的「有效量」一詞，是指相較于未接受此量的對應(yīng)個體，藥物或藥劑的 用量造成所欲的藥理或生理上的結(jié)果，或疾病、異常或副作用的治療、治愈、預(yù)防、或改善， 或減少疾病或異常的發(fā)生。服用的有效量或有效劑量可根據(jù)所使用的特定有效成分、服用 模式、年齡、體型、以及所欲治療個體的條件而改變。藥劑的精確服用量則系依醫(yī)師的判斷 進(jìn)行投藥且依個體差異而異。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)甘油醒-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde3_phosphate Dehydrogenase, G3FOH)具有非可預(yù)期的抗過敏活性。在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，針對甘油 醛-3-磷酸脫氫酶（G3PDH)進(jìn)行小鼠樹突細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，顯示G3PDH可有效誘發(fā)小鼠樹 突細(xì)胞表達(dá)IL-12及刺激脾臟細(xì)胞表達(dá)IFN- γ，顯示其具有刺激免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) 的功效。因此，本發(fā)明提供甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變異體或片段在制備 降低個體過敏反應(yīng)的藥劑中的用途。
[0054] 因此，本發(fā)明提供甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變異體或片段在制備 降低過敏性疾病以及氣喘或異位性皮膚炎的藥劑中的用途。
[0055] 本發(fā)明的一實(shí)施例中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列。但本發(fā)明所使用的甘油醛-3-磷酸脫氫酶當(dāng)包含不同來源以及制程的甘油醛-3-磷 酸脫氫酶，或其具相同功能的變異體或片段。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（G3PDH)為活性成分可進(jìn)一步與生理上可 接受的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物，或一食品組合物。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明，包含以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為活性成分的組合物、萃取物、區(qū)分 物、次區(qū)分物（subfraction)亦可用于制備治療或預(yù)防氣喘或異位性皮膚炎藥劑。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明，該甘油醛-3-磷酸脫氫酶是分離自加氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri) PM-A0005菌株，該P(yáng)M-A0005菌株由東宇生物科技股份有限公司開發(fā)，于2007年 4月6日寄存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，寄存編號CCTCC NO :M207039。并于2007年1月 5日申請專利并于2012年1月21日取得臺灣專利第1356680號。但于該已獲準(zhǔn)的專利中 并未曾公開其具有預(yù)防或治療過敏性氣喘或異位性皮膚炎的功效，亦未公開其有效成分。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明，該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物可經(jīng)由本【技術(shù)領(lǐng)域】所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例 如利用溶菌酶分解菌體并以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中， 是將該P(yáng)M-A0005菌株以溶菌酶處理而釋出細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，接續(xù)以濃度遞增的硫酸銨沉淀 蛋白質(zhì)以獲得不同硫酸銨濃度的萃取物，根據(jù)不同的硫酸銨濃度可獲得4個不同蛋白質(zhì)萃 取物，分別命名為AS_0-25%、AS_25-50%、AS_50-75%、AS_75-100%。將此4種蛋白質(zhì)萃取物 與小鼠樹突細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AS_0-25%和AS_50-75%具有誘發(fā)小鼠樹突細(xì)胞產(chǎn)生高于 對照組(僅有細(xì)胞)3倍以上的IL-12表達(dá)量，顯示其具有刺激免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功 效；進(jìn)而將AS_50-75%經(jīng)腹腔注射投予小鼠，可顯著降低塵螨致敏小鼠呼吸道阻力，并顯著 抑制肺臟的細(xì)胞浸潤與發(fā)炎現(xiàn)象。因此證實(shí)該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物具有預(yù)防或治療過 敏性氣喘的功效。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明，該P(yáng)M-A0005菌株的區(qū)分物（fraction),可經(jīng)由本技 術(shù)領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，自上述方法所獲的萃取物，接續(xù)經(jīng)離子交換層析 (ion-exchangechromatography)分離而得。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，進(jìn)一步將萃取物 AS_0-25%和AS_50-75%利用HiTrap?DEAE-FF管柱以離子交換層析法分離活性物質(zhì)。經(jīng)由 離子交換層析法，AS_0-25%可以分離出3個區(qū)分物IE1-UIE1-2和IE1-3 ;AS_50-75%可以 分離出3個區(qū)分物IE3-UIE3-2和IE3-3。將此6種蛋白質(zhì)區(qū)分物與小鼠樹突細(xì)胞共同培 養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該等區(qū)分物可誘發(fā)小鼠樹突細(xì)胞產(chǎn)生高于對照組(僅有細(xì)胞)IL-12表達(dá)量，顯示其 具有刺激免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功效。其中IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3的IL-12表 達(dá)量更高于對照組3倍以上。
[0061 ] 根據(jù)本發(fā)明，該P(yáng)M-A0005菌株的次區(qū)分物（subfraction)，可經(jīng)由本技術(shù)領(lǐng) 域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，自上述方法所獲的區(qū)分物以膠體過濾層析法（Ge 1 -fi 1 trat i on chromatography)的方式進(jìn)行更進(jìn)一步的分離活性物質(zhì)而得。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中， 進(jìn)一步將區(qū)分物IE1-2、IE1-3、IE3-2和IE3-3利用S印hacryl?S-300HR管柱給以膠體過 濾層析分離，IE1-2可以分離出1個次區(qū)分物（subfraction) IE1-2G1 ;ΙΕ1-3可以分離出 2個次區(qū)分物和IE1-3G2 ;IE3-2可以分離出3個次區(qū)分物IE3-2G1、IE3-2G2和 IE3-2G3 ;IE3-3可以分離出5個次區(qū)分物比3-361、比3-362、比3-363、比3-364和比3-365。 將此11種蛋白質(zhì)次區(qū)分物與小鼠樹突細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)次區(qū)分物可誘發(fā)小鼠樹突細(xì)胞 產(chǎn)生高于對照組(僅有細(xì)胞)的IL-12表達(dá)量，顯示其具有刺激免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功 效，尤以IE3-3G1的IL-12表達(dá)量較對照組高出約7. 3倍以上為最佳；其中將IE3-3G1經(jīng)腹 腔注射投予小鼠，可顯著降低塵螨致敏小鼠呼吸道阻力，并顯著抑制肺臟的細(xì)胞浸潤與發(fā) 炎現(xiàn)象，證實(shí)本發(fā)明的次區(qū)分物具有降低過敏反應(yīng)，特別是預(yù)防或治療過敏性氣喘的功效。 此外，在OVA或是Der p經(jīng)皮致敏的小鼠以腹腔注射IE3-3G1后，顯著減緩皮膚發(fā)炎現(xiàn)象， 亦證明本發(fā)明次區(qū)分物具有降低預(yù)防或治療異位性皮膚炎的功效。
[0062] 本發(fā)明該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物、區(qū)分物及次區(qū)分物可進(jìn)一步與生理上可接受 的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物，或一食品組合物。因其具有刺激免疫細(xì)胞IL-12表 達(dá)的功效，可降低塵螨致敏小鼠的呼吸道阻力及抑制肺臟的細(xì)胞浸潤與發(fā)炎現(xiàn)象；亦可刺 激抑制發(fā)炎的IL-10細(xì)胞激素，以降低經(jīng)0VA或是Der p經(jīng)皮致敏所造成的皮膚發(fā)炎反應(yīng)， 故可用于治療或預(yù)防過敏性氣喘或異位性皮膚炎。另外，該P(yáng)M-A0005菌株本身亦具有治療 或預(yù)防異位性皮膚炎的功效。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，可依本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知或標(biāo)準(zhǔn)的方法，依需要選用適當(dāng)?shù)娘嬍秤?材料制成口服藥物、食品或飲品。該食品或飲品包括但不限于乳品、發(fā)酵乳制品、飲料、運(yùn)動 飲料、營養(yǎng)添加物或保健食品、糖果或是膠質(zhì)。
[0064] 一些適當(dāng)賦形劑的實(shí)施例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯 膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、黃蓍樹膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、滅菌 水、糖漿和甲基纖維素其中一種或幾種。該組合物可另外包括潤滑劑，濕潤劑，乳化劑，懸浮 齊IJ，保存劑，甜味劑或調(diào)味劑其中一種或幾種，其中潤滑劑包括滑石粉、硬脂酸鎂或礦物油 其中一種或幾種；保存劑包括羥基苯甲酸甲酯或丙酯其中一種或幾種。
[0065] 本發(fā)明進(jìn)一步以下列實(shí)施例說明，其是提供示范的目的而非用以限制本發(fā)明。
[0066] 實(shí)施例1PM-A0005菌株的制備
[0067] 加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株以MRS培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)24小時，挑選單一菌落于 5ml的無菌培養(yǎng)基(表1)于37°C培養(yǎng)20小時。第3天以無菌方式制作種子罐，取出菌液以 50倍稀釋于培養(yǎng)基中以37°C培養(yǎng)16小時。第4天將100ml菌液接種于含有3. 5公升培養(yǎng) 基的桌上型微處理控制發(fā)酵槽(型號：Major ScienCe，MS-Fl)中進(jìn)行發(fā)酵，于37°C、pH6. 0 條件下培養(yǎng)5. 5小時。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，取出發(fā)酵菌液并使用高速離心機(jī)去除上清液留下菌 泥，計數(shù)菌數(shù)達(dá)到l〇9CFU。
[0068] 表 1
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 甘油醒 _3_ 憐酸脫氧酶（Glyceraldehyde3_phosphate Dehydrogenase，63Η)Η)或其 具相同功能的變異體或片段在制備降低個體過敏反應(yīng)的藥劑中的用途。
2. 甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變異體或片段在制備治療或預(yù)防過敏性 疾病的藥劑中的用途。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中該過敏性疾病為氣喘。
4. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中該過敏性疾病為異位性皮膚炎。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該甘油醛-3-磷酸脫氫酶具有如SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該甘油醛-3-磷酸脫氫酶是選自由加氏乳酸 桿菌（Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株及其萃取物、區(qū)分物、次區(qū)分物或有效成分 所組成的群組；其中該P(yáng)M-A0005菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其菌種保藏編號為 CCTCC NO :M207039。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中該萃取物為溶菌酶分解該P(yáng)M-A0005菌株菌體后再以 硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得。
8. 如權(quán)利要求7的所述用途，其中該萃取物為以濃度為大于0且小于等于25%或濃度 為50-75%的硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得。
9. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中該區(qū)分物為溶菌酶分解該ΡΜ-Α000 5菌株菌體 后再以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得萃取物后，其再經(jīng)離子交換層析（ion-exchange chromatography)分離而得。
10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中該區(qū)分物為選自由IE1-2、IE1-3、IE3-2及IE3-3 所組成的群組。
11. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中該次區(qū)分物為溶菌酶分解該P(yáng)M-A0005菌株菌體后 再以硫酸銨沉淀胞質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得的萃取物，其再經(jīng)離子交換層析分離獲得區(qū)分物后，再 以膠體過濾層析法（gel filtration chromatography)分離而得。
12. 如權(quán)利要求11所述的用途，其中該次區(qū)分物為IE3-3G1。
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中該次區(qū)分物為IE3-3G1的有效成分為甘油 醛-3-磷酸脫氫酶。
14. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中該P(yáng)M-A0005菌株的萃取物、區(qū)分物及次區(qū)分物可與 生理上可接受的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物或食品組合物。
15. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該甘油醛-3-磷酸脫氫酶或其具相同功能的變 異體或片段可與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑制成一醫(yī)藥組合物或食品組合物。
16. 一種加氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri)PM_A0005菌株在制備治療或預(yù)防異 位性皮膚炎的藥劑中的用途，其中該P(yáng)M-A0005菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其菌 種保藏編號為CCTCC NO :M207039。
【文檔編號】A61K38/44GK104056259SQ201410112862
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月22日
【發(fā)明者】蘇偉志, 陳湘陵, 黃浚憲, 吳小俐, 李光智, 蔡佩瑜, 曾群富 申請人:東宇生物科技股份有限公司