槲皮素在制備治療周圍神經損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬藥物制藥領域，涉及槲皮素的新的藥物用途，本發(fā)明通過系列整體動物實驗發(fā)現了槲皮素可以通過增強了周圍神經自身內在的再生能力、延緩遠身側殘端的退化進程，最終促進了周圍神經的再生，使運動、感覺功能的恢復得到改善。實驗結果證明，本發(fā)明所述的槲皮素可作為治療藥物用于治療周圍神經損傷，促進神經損傷后神經功能的恢復。
【專利說明】槲皮素在制備治療周圍神經損傷藥物中的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于神經修復藥物的研發(fā)領域，涉及了槲皮素的新的藥物用途，尤其涉及槲皮素在制備神經損傷后對感覺功能恢復的藥物中的應用。
【背景技術】:
[0002]周圍神經損傷是指周圍神經干或其分支受到外界直接或間接力量作用而發(fā)生的損傷。臨床上周圍神經損傷極為常見，流行病學調查(Eser, F., L.Aktekin, etal.Etiological factors of traumatic peripheral nerve injuries.2009.NeurologyIndia57(4):434-437)顯示，外傷病人中周圍神經損傷病人達10.4%，其中就損傷部位而言，77%位于上肢、23%位于下肢。上下肢中最常見的神經損傷主要為:上側肢體的尺神經(27% )與下側肢體的坐骨神經(11.1% )。
[0003]損傷后的典型表現:運動障礙、感覺障礙和自主神經功能障礙。臨床治療過程中:2.8%的外傷患者誘發(fā)的周圍神經損傷需進行外科手術治療。所有患者經周圍神經修復后可獲得一定程度的功能恢復(Noble J et al.Analysis ofupper and lower extremityperipheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries.JTrauma.1998.45:116-122)，但大部分病例愈后不佳。至此周圍神經損傷后將嚴重影響患者的生活質量并造成極大的社會、經濟負擔。
[0004]目前周圍神經損傷的治療手段主要有手術治療與藥物治療。手術治療為自體神經移植與替代神經移植 ，臨床上一直以自體感覺神經移植作為主要治療手段。而該手術一直受到神經供體的狀態(tài)以及手術產生的合并癥等因素的限制。藥物治療為周圍神經損傷修復治療的重要輔助措施，對于沒有手術適應證或是作為手術治療后的輔助措施，藥物治療將大有作為。糖皮質激素是臨床常用的治療神經損傷藥物。其作用主要是減輕局部神經炎癥反應、防止組織的水腫、減少神經干周圍組織的粘連等。通過坐骨神經損傷的小鼠局部注射地塞米松，證實其促進坐骨神經損傷后脊髓前角運動神經元內降鈣素基因相關肽(CGRP)的表達增強，可能是其促進神經元修復的重要途徑之一。此外，保護血管及營養(yǎng)神經藥物也廣泛運用，但是其單獨運用時療效差且不穩(wěn)定，常需聯合用藥或者合用其他藥物，臨床將維生素B1、維生素B6和地巴唑三藥合用，稱為“神經營養(yǎng)藥”。不過以上臨床常用藥物療效一般，尚未有療效十分理想的藥物。
[0005]黃酮類物質廣泛分布于食用植物中，故而人類的日常飲食中常富含黃酮類物質。槲皮素可能是研究的最為廣泛的黃酮類化合物，因其對多種疾病均具有的一定的改善，如心血管疾病、炎癥以及腫瘤等(Boots AW,Haenen GR,Bast A.Health effects of quercetin:from antioxidant to nutraceutical.Eur J Pharmacol.2008.585:325-37)。近期研究表明，槲皮素對神經系統(tǒng)疾病具有潛在的治療作用(Dajas F，Rivera-Megret F，Blasina F，etal.Neuroprotection by flavonoids.Braz JMed Biol Res.2003.36:1613-20)。
[0006]槲皮素可直接保護神經元，研究表明槲皮素可保護PC12細胞(大鼠嗜鉻細胞瘤)抵御多種氧化應激物質如 H202 (Arredondo MF.Blasina F.Echeverry C.Cytoprotectionby Achyrocline satureioides(Lam)D.C.and some of its main flavonoids againstoxidative stress.J Ethnopharmaco1.2004.91:13-20)、亞油酸過氧化氫(LOOH) (SasakiN, Toda T, Kaneko T, et al.Protective effects of flavonoids on the cytotoxicityof linoleic acid hydroperoxide toward rat pheochromocytoma PC12 cells.Chem BiolInteract.2003.145:101-16)以及叔丁基過氧化氫(t-BOOH) (Silva JP, Gomes AC,Coutinho OP.0xidative DNA damage protection and repair by polyphenolic compounds inPC12 cells.Eur J Pharmacol.2008.601:50-60)。
[0007]槲皮素除可通過直接作用保護神經元外，其抗炎作用也參與了神經保護。對于小膠質細胞，研究人員發(fā)現槲皮素可減少小鼠小膠質細胞中由脂多糖引起的NO釋放，且該依賴與槲皮素誘導的血紅素加氧酶-1的表達。隨后H0-1可降低炎癥反應致使的NO合成。文獻中還報道了，當使用LPS刺激N9細胞(在加入LPS前先與槲皮素孵育)的培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞時，可顯著降低PC12細胞的凋亡(Bureau G,Longpre F,Martinoli MG.Resveratrol andquercetin, two natural polyphenols,reduce apoptotic neuronal cell death induced byneuroinflammation.JNeurosci Res2008.86:403-10)。星形膠質細胞亦參與了神經炎癥，盡管其影響不及小膠質細胞廣泛。在炎癥免疫過程中，星形膠質細胞可釋放促炎因子與神經毒性因子，如 TNF- a、IL-1、IL-6 及NO(Tacconi MT.Neuronal death:is there a role forastrocytes ?.Neurochem Resl998.23:759-65)。觀察發(fā)現，槲皮素可通過降低細胞凋亡、減少ROS合成并促進HO-1表達來保護C6細胞(大鼠神經膠質瘤)來抵御t-B00H (GitikaB.Sai Ram M.Sharma SK.Quercetin protects C6glial cells from oxidative stressinduced by tertiary-butylhydroperoxide.Free Radic Res.2006.40:95-102)與H2O2 (Chen TJ.Jeng JY.Lin Cff.Quercetin inhibition of ROS-dependentand-1ndependentapoptosis in rat glioma C6cells.Toxicology.2006.223:113-26)。此外，在原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質細胞中加 入槲皮素后，可促進谷胱甘肽的表達。在人胚胎腦小膠質細胞培養(yǎng)時加入槲皮素時，可抑制IL-1 β誘導的IL-6、IL-8、INF誘導蛋白、單核細胞趨化蛋白-1及ROS的合成。少突I父質細胞在中樞神經系統(tǒng)的免疫炎癥反應中，既可能存在亦可能不存在。
[0008]但是槲皮素對于有效的逆轉或延緩周圍神經疾病的發(fā)生發(fā)展，仍然沒有相關文獻報道。
【發(fā)明內容】
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[0009]本發(fā)明的目的是提供槲皮素在制藥中的新用途。尤其涉及槲皮素在制備神經損傷后對運動及感覺功能恢復的藥物中的應用。
[0010]本發(fā)明主要通過動物運動與感覺相關的行為學實驗證明了槲皮素能促進周圍神經損傷后運動功能及感覺功能的恢復，其中所述的周圍神經損傷包括由創(chuàng)傷、機能紊亂、突發(fā)性疾病、運動性疾病、脫髓鞘疾病或神經退行性病變引起的神經損傷。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0011]附圖1為坐骨神經夾損后槲皮素對展趾功能影響的檢測。Α，坐骨神經夾損后不同恢復時期時小鼠趾展照片。0，無展趾；1，部分展趾；以及2，完全展趾。B~Ε，通過趾展檢測來評估不同劑量的槲皮素對運動功能恢復的影響。F，小鼠坐骨神經夾損后槲皮素對運動功能的起始恢復時間的影響。G，小鼠坐骨神經夾損后槲皮素對運動功能的完全恢復時間的影響。(η = 9-10每組，數據為平均值土SEM，*ρ < 0.05，T檢驗)
[0012]附圖2為不同劑量的槲皮素對坐骨神經夾損后坐骨神經功能指數(SFI)指數的影響。
[0013]附圖3為不同劑量的槲皮素對坐骨神經夾損后足-底角功能(FBA)的影響。
[0014]附圖4為不同劑量的槲皮素對小鼠坐骨神經夾損后的感覺功能恢復的影響。Α，小鼠后足的分區(qū)示意圖。B~Ε，通過針刺刺激評估不同劑量的槲皮素對小鼠感覺恢復功能的影響。F，槲皮素對小鼠坐骨神經夾損后感覺功能的起始恢復時間的影響。G，槲皮素對小鼠坐骨神經夾損后感覺功能的完全恢復時間的影響。(η = 9-10每組，數據為平均值土SEM，*ρ < 0.05，T 檢驗)
【具體實施方式】:
[0015]實施例1槲皮素對坐骨神經損傷后小鼠運動功能的影響
[0016]1、實驗方法
[0017]I)展趾功能檢測
[0018]為了評估神經損傷(坐骨神經)后運動功能的恢復，我們檢測足趾的運動功能。使用醫(yī)用紗布緩慢包裹小鼠體端，隨后提起小鼠尾部，暴露后足至可清晰觀測。在此條件下，足趾伸展，足趾分開并達到展趾最大距離(展趾反射)。該發(fā)射是由神經所支配的足部小肌肉所控制的，隨后使用已 報道的方法進行評估計分:0，無展趾；1，部分展趾；以及2，完全展趾(見圖1Α)。完全展趾需要趾展充分、趾間距離寬、并能持續(xù)(至少2秒鐘)。在對小鼠患側足部檢測前需觀測到其健側足趾呈現完全展趾。每次試驗期間每只小鼠檢測2次，每次檢測間時間間隔需在45分鐘以上。此外，檢測坐骨神經夾損后第10及20天時，小鼠可活動的足趾數目(單趾評估)。該參數可評得O (無任何可活動足趾)至4 (可活動所有足趾；即4個足趾間均存在活動間隙)。檢測時評估人員對分組情況單盲。
[0019]2)坐骨神經功能指數(SFI)
[0020]SFI可作為后肢感覺及運動功能恢復的重要參考指標。將小鼠后足涂上墨水，并讓其通過一條寬15cm長60cm，底部預鋪有白紙的長廊。隨后按照文獻所述方法測量足印中對側足間的距離、單次足印長度、外側趾間距離以及中間趾間距離。結果中需取每組動物中10只進行試驗，每只小鼠取3對足印進行計算。
[0021]3)足-底角(FBA)檢測
[0022]為了檢測小鼠在地面活動時腿部肌肉的功能，需要訓練小鼠進行經典的線性束行走試驗。在該檢測中，將線性束(長1000毫米，寬38毫米)水平放置，使小鼠鼠籠位于線性束的盡頭，將小鼠放在線性束的一端促使小鼠自由通過線性束，期間使用Nikon D3100對小鼠行走過程進行記錄，每秒25幀并存儲。在坐骨神經損傷后的第3、7、14、21、28及35天進行記錄。使用VirtualDub軟件(http://www.virtualdub.0rg)對所記錄視頻進行逐中貞截取，通過 UTHSCSA Image Tool2.0software (University of Texas, San Antonia, TX, USA,http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/)對截取圖像分析。足-底角:選取腳離開地面的最后一個瞬間，測量足底平面的中線與地面所形成的角度。
[0023]2、實驗結果[0024]I)展趾檢測
[0025]隨后我們對槲皮素是否能提升坐骨神經夾損后運動功能的恢復進行了評估，試驗結果表明給予槲皮素20mg/kg/d治療后可顯著提升小鼠足趾部運動功能的恢復(圖1A)，不過其他治療組間并不顯著性差異(圖1B至D)。同時，槲皮素20mg/kg/d治療組內小鼠展趾反射出現的時間也被大大縮短(圖1E)。其展趾反射完全恢復的時間也有所縮短，不過無顯著性差異(圖1F)。
[0026]2)坐骨神經功能指數 (SFI)
[0027]根據圖2A至2D數據顯示，槲皮素20mg/kg/d及mNGF治療組可將SFI降低至相似水平，而該兩組數據均由于其他治療組數據。
[0028]3)足-底角(FBA)檢測
[0029]我們評估了神經損傷手術前及手術后3、7、14、21、28、35天后股四頭肌中的伸肌功能，根據圖3數據顯示，槲皮素20mg/kg/d及mNGF治療組可將FBA降低至相似水平。
[0030]3、實驗結論
[0031]由結果可看出，槲皮素可顯著恢復周圍神經損傷后運動功能的恢復。
[0032]實施例2槲皮素對坐骨神經損傷后小鼠感覺功能的影響
[0033]1、實驗方法
[0034]在手術(坐骨神經夾損)前一周將小鼠(7至9周齡)置于線絲網中進行3次適應性訓練，隨后在手術后的相應時間點進行檢測。適應性訓練30分鐘后，使用Austerlitzinsect pin (型號000) (FST)輕輕地刺激小鼠足底跖側皮膚表面，刺激時避免移動小鼠足部或刺透皮膚。將小鼠后足跖面的最外側(坐骨神經感受區(qū))分為5區(qū)(見圖1)。自最外側足趾(E區(qū))至足跟(A區(qū))使用針刺刺激(2次)。刺激過程中小鼠后足出現移動將視為有效反應，并將該區(qū)域記為I分，隨后進行下一區(qū)域檢測。如若刺激后不出現有效反應則將該區(qū)域記為O分。在上述情況下，同時檢測對側足部相應區(qū)域作為陽性對照。檢測時評估人員對分組情況單盲。
[0035]2、實驗結果
[0036]在損傷后的不同時間點運用刺激小鼠損傷坐骨神經所支配的遠端皮膚區(qū)域(后足外側區(qū)域)來評估傷害性感覺的恢復。
[0037]在坐骨神經損傷后，模型組中小鼠足部外側的皮膚傷害性感覺在10至12天開始恢復，而槲皮素20mg/kg/d組中這一感覺恢復可顯著提前出至7天)(見圖4B)。而其他組別間未見顯著性差異(圖4C至E)。與mNGF組相比，槲皮素(20mg/kg/d)可顯著提升起始感覺恢復及完全感覺恢復的時間(圖4F至G)。
[0038]3、實驗結論
[0039]由結果可看出，槲皮素可顯著恢復周圍神經損傷后感覺功能的恢復。
【權利要求】
1. 槲皮素在制備治療周圍神經損傷藥物中的應用。
2.槲皮素在制備神經損傷后改善感覺功能的藥物中的應用。
3.槲皮素在制備神經損傷后改善運動功能的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/352GK103989669SQ201410126066
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權日:2014年4月1日
【發(fā)明者】廖紅, 殷志琦, 陳明明, 張陸勇 申請人:中國藥科大學