一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料的應(yīng)用，所述材料由介孔孔道可負載能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的介孔二氧化硅納米粒子、負載在介孔二氧化硅納米粒子介孔孔道中的自由基的化合物或基團，以及包覆所述介孔二氧化硅納米粒子的殼聚糖聚合電解質(zhì)膜組成。所述材料響應(yīng)pH值控制材料負載的能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的釋放速率。
【專利說明】一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種緩控釋材料及其應(yīng)用，具體涉及一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料及其應(yīng)用，屬于納米生物醫(yī)藥材料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧自由基(ROS)是一類活性物種，包括氧分子的還原產(chǎn)物，如:單線態(tài)氧
(1O2),超氧陰離子自由基(02‘_)，過氧化氫(H2O2)，羥基自由基(H0.)，以及碳中心自由基和氧分子的反應(yīng)產(chǎn)物，如:過氧自由基(R00.)，烷氧自由基(R0.)和有機過氧化氫物(ROOH)等。由于自由基具有生物化學(xué)活性，并且可以自由穿過細胞膜，因而自由基具有殺滅細胞的特性。大量研究表明，過量的自由基會引發(fā)細胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷，會抑制蛋白質(zhì)的功能，破壞脂質(zhì)，并引發(fā)DNA鏈斷裂進而引發(fā)細胞死亡。通過輻射誘發(fā)產(chǎn)生自由基(放療)已經(jīng)被證實為一種有效的癌癥治療手段。另外一種方法就是通過藥物誘發(fā)產(chǎn)生自由基(化療)。一些常見的抗癌藥，如喜樹堿，阿霉素，長春新堿，三氧化二砷以及博來霉素等的毒性作用都與自由基有關(guān)。如何能夠在腫瘤組織周圍長時間的釋放自由基將會是一種有效的治療癌癥的方式。
[0003]過氧化物是一類含有過氧鍵(0-0)的化合物，通式為R-0-0-R’。這些分子中的過氧鍵(0-0)具有很強的氧化能力，容易發(fā)生斷裂生成兩個自由基R0.，因此被廣泛用在塑料和橡膠行業(yè)作為自由基引發(fā)劑。這些引發(fā)劑在光/熱的刺激下可以迅速產(chǎn)生自由基。正是由于過氧化物這種產(chǎn)生自由基的特性，我們考慮到使用過氧化物作為一種自由基源用于癌癥的自由基療法。但過氧 化物本身作為自由基引發(fā)劑，對光和熱很敏感，而且在很多溶劑中都不穩(wěn)定，這就使得過氧化物很難用于臨床治療使用。因為這些過氧化物很有可能在還未到達病灶部位的時候已經(jīng)分解產(chǎn)生自由基了，從而對正常細胞造成嚴(yán)重損傷。另外，很多過氧化物，尤其是一些有機過氧化物，在水中溶解度很低，這就限制了他們的進一步的口服及皮下注射應(yīng)用。如何能夠改善這些過氧化物的穩(wěn)定性，提高他們在水中的溶解度并進一步實現(xiàn)可控性的輸運將會是一個非常有前景的研究領(lǐng)域，但是卻還未見報道。
[0004]把過氧化物裝入一種載體可能會是解決這個問題的一個思路，已見的報道使用脂質(zhì)體[VB Patel, AN Misra, YS Marfatia, Drug Dev Ind Pharm.2001，27，863-9],微球[ΜJelvehgarij MR Siah1-Shadbadj S AzarmijInt J Pharm.2006，308，124-32 ;RC Wester, RPatel, S Nachtj J Am Acad Dermatol.1991，24，720-6]，聚合物[J Shim, HS Kang, WSPark, J Control Release.2004，97，477-84]和脂質(zhì)體納米粒子[A Dingier, RP Blum, HNiehusj J Microencapsul.1999，16，751-67]來裝載和輸運過氧化物。但是，這些有機載體因為自身化學(xué)穩(wěn)定性有限，加上藥物裝載效率低，從而限制了他們的臨床應(yīng)用。因此，迫切需要開發(fā)一種具有較高化學(xué)和熱穩(wěn)定性，而且具有極高的生物相容性和可降解性的自由基釋放體系。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有自由基釋放體系存在的缺陷，本發(fā)明提供一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料，所述材料由介孔孔道可負載能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的介孔二氧化硅納米粒子、負載在介孔二氧化硅納米粒子介孔孔道中的自由基的化合物或基團，以及包覆所述介孔二氧化硅納米粒子的殼聚糖聚合電解質(zhì)膜組成。
[0007]較佳地，產(chǎn)生自由基的化合物或基團包括含有過氧鍵的過氧化物或基團。
[0008]較佳地，產(chǎn)生自由基的化合物或基團被裝載入或者被鍵接在介孔二氧化硅基材料的介孔孔道內(nèi)和/或者介孔表面。
[0009]較佳地，自由基是指過氧化物、內(nèi)氧化物在反應(yīng)過程中的一系列中間產(chǎn)物，包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物。
[0010]較佳地，中間廣物包含過氧自由基、烷氧基自由基、烷基自由基、有機過氧化氧物中的至少一種。
[0011]本發(fā)明還提供一種上述述材料的應(yīng)用，所述材料由介孔孔道負載能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的介孔二氧化硅納米粒子和包覆所述介孔二氧化硅納米粒子的殼聚糖聚合電解質(zhì)膜組成，所述材料響應(yīng)PH值控制材料負載的能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的釋放速率。
[0012]較佳地，所述材料負載的能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團在pH = 6.5條件下的釋放率大于在pH = 7.4 條件下的釋放率。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
介孔二氧化硅的孔容大，裝載量大，殼聚糖聚合電解質(zhì)膜在中性及微堿性(模擬正常細胞)的條件下，由于其表面的氨基質(zhì)子化程度低，分子間氫鍵的作用大于靜電斥力的作用，分子鏈團聚，成有序聚集狀態(tài)，有效阻止裝載的化合物或集團釋放，而在酸性(模擬腫瘤細胞)的條件下，其表面的氨基質(zhì)子化程度高，靜電斥力大于分子間氫鍵，與水作用，成溶膠狀態(tài)，使得負載的化合物或基團可以釋放出來，達到靶向緩釋作用本發(fā)明所述的PH響應(yīng)性自由基釋放體系可以響應(yīng)性地在腫瘤組織附近(pH = 6.5)產(chǎn)生自由基，而在正常組織處(pH = 7.4)不釋藥，從而避免了自由基對正常組織的損傷作用。因此，具有重大的醫(yī)藥業(yè)應(yīng)用前景和價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明的一個實施方式中制備的空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)的透射電子顯微照片(TEM)；
圖2為本發(fā)明的一個實施方式中制備的載有過氧化苯甲酰(BPO)的空心介孔二氧化硅納米復(fù)合物(BPOOHMSNs)的傅里葉變換紅外光譜圖(FTIR)；
圖3為本發(fā)明的一個實施方式中制備的BP0@HMSNS-CS-2的釋放液的紫外/可見吸收光譜。
【具體實施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖及下述【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實施方式和/或附圖僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明公開了一種介孔二氧化硅基的pH響應(yīng)性自由基釋放體系的應(yīng)用，屬于納米生物醫(yī)藥材料【技術(shù)領(lǐng)域】。所述的自由基體系是利用介孔二氧化硅基材料為載體，通過物理浸潰裝載能夠產(chǎn)生自由基的化合物或者通過化學(xué)基團修飾鍵接能夠產(chǎn)生自由基的基團。所述的pH響應(yīng)性釋放是通過在介孔二氧化娃表面包覆或者鍵接pH響應(yīng)性的殼聚糖聚電解質(zhì)，實現(xiàn)對產(chǎn)生的自由基的PH響應(yīng)性釋放。所釋放的自由基可以攻擊腫瘤組織，進而導(dǎo)致惡性細胞死亡。本發(fā)明不僅制備工藝簡單，而且可以實現(xiàn)自由基在腫瘤組織周圍靶向、PH響應(yīng)性釋放，從而大幅度降低傳統(tǒng)藥物對于正常組織的損傷，因而具有重大的生理意義和臨床應(yīng)用前景。
[0017]本發(fā)明提供了一種介孔二氧化硅基的pH響應(yīng)性自由基釋放體系，所述體系利用介孔二氧化硅基材料為載體，通過負載自由基產(chǎn)生化合物(基團)，可控的釋放自由基。
[0018]所述的介孔二氧化硅基材料，具有介孔孔道的介孔二氧化硅或者空心介孔二氧化硅納米材料。本發(fā)明利用介孔二氧化硅材料巨大的空腔結(jié)構(gòu)或者豐富的介孔孔道實現(xiàn)自由基產(chǎn)生化合物的大量裝載，或者利用二氧化硅表面豐富的硅羥基，實現(xiàn)與自由基產(chǎn)生基團的大量鍵連，實現(xiàn)對自由基產(chǎn)生化合物的有效負載。
[0019]所述的自由基產(chǎn)生化合物(基團)，含有過氧鍵(0-0)的過氧化物或基團。
[0020]所述的自由基體系的制備方法，自由基產(chǎn)生化合物(基團)被裝載入介孔二氧化硅基材料或者被鍵接在介孔二氧化硅基材料的介孔孔道內(nèi)和(或者)介孔表面。
[0021]所述的自由基體系的制備方法中，自由基產(chǎn)生化合物(基團)的負載方法是物理浸潰或者化學(xué)基團鍵接。
[0022]所述的pH響應(yīng)性自由基釋放體系，介孔二氧化硅表面負載有pH響應(yīng)性的殼聚糖聚電解質(zhì)。
[0023]所述的pH響應(yīng)性的殼聚糖聚電解質(zhì)，殼聚糖聚電解質(zhì)被包覆或者鍵接在介孔二
氧化娃表面。
[0024]所述的可控的自由基釋放體系，所產(chǎn)生的自由基是指過氧化物、內(nèi)氧化物在反應(yīng)過程中的一系列中間產(chǎn)物，包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物。
[0025]所述的過氧化物、內(nèi)氧化物的中間產(chǎn)物，包含過氧自由基(R00.)，烷氧基自由基(R0.)，烷基自由基(R.)和有機過氧化氫物(ROOH)等。
[0026]所述的可控的自由基釋放體系，所述的任一項介孔二氧化硅基的pH響應(yīng)性自由基釋放體系的用途是用于腫瘤組織的損傷和腫瘤細胞的殺滅。
[0027]近些年來，無機的介孔二氧化硅納米載體由于具有較高的化學(xué)和熱穩(wěn)定性，而且具有極高的生物相容性和可降解性，越來越多的被用于催化、生物成像、藥物/基因輸運等方面，因而受到了廣泛的關(guān)注。其中，空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)尤其受到關(guān)注，這主要是因為空心介孔二氧化硅納米粒子具有更大的比表面積，孔體積，具有巨大的空腔結(jié)構(gòu)，從而可以 提高藥物的裝載效率。同時，這些介孔二氧化硅納米材料的表面富含硅羥基，可以鍵接各種官能基團，從而賦予HMSNs各種刺激響應(yīng)的可控性藥物釋放能力。另外，利用納米粒子本身在腫瘤組織周圍的EPR效應(yīng)，可以實現(xiàn)納米粒子對于腫瘤組織周圍的靶向輸運。這就使得介孔二氧化硅納米材料成為一種用于裝載這種不穩(wěn)定的過氧化物的良好的載體材料。
[0028]本發(fā)明所述的自由基產(chǎn)生化合物為過氧化苯甲酰、青蒿素、叔丁基過氧化氫等有機過氧化物。
[0029]本發(fā)明所述的自由基釋放體系的制備方法，包括如下步驟:
步驟A)自由基產(chǎn)生化合物(基團)通過物理浸潰被裝載入介孔二氧化硅基材料或者通過化學(xué)基團鍵接在介孔二氧 化硅基材料的介孔孔道內(nèi)和(或者)介孔表面；
步驟B)通過物理吸附作用或者化學(xué)鍵接方式在介孔二氧化硅基材料表面或者介孔孔道內(nèi)部負載PH響應(yīng)性的殼聚糖聚合電解質(zhì)，實現(xiàn)所裝載化合物的有效包覆以及后續(xù)的pH響應(yīng)性釋放；
步驟A)和步驟B)的順序根據(jù)具體的裝載物質(zhì)和殼聚糖負載方式而有所調(diào)整。
[0030]本發(fā)明所述的介孔二氧化硅基的pH響應(yīng)性自由基釋放體系利用納米粒子本身在腫瘤組織周圍的EPR效應(yīng)，可以實現(xiàn)納米粒子對于腫瘤組織的靶向輸運。本發(fā)明所述的自由基釋放體系的制備方法簡便易行。本發(fā)明所述的pH響應(yīng)性自由基釋放體系可以響應(yīng)性地在腫瘤組織附近(pH = 6.5)產(chǎn)生自由基，而在正常組織處(pH = 7.4)不釋藥，從而避免了自由基對正常組織的損傷作用。因此，具有重大的醫(yī)藥業(yè)應(yīng)用前景和價值。
[0031]圖1為本發(fā)明的一個實施方式中制備的空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)的透射電子顯微照片(TEM)；
圖2為本發(fā)明的一個實施方式中制備的載有過氧化苯甲酰(BPO)的空心介孔二氧化硅納米復(fù)合物(BPOOHMSNs)的傅里葉變換紅外光譜圖(FTIR)；
圖3為本發(fā)明的一個實施方式中制備的BP0@HMSNS-CS-2的釋放液的紫外/可見吸收光譜。
[0032]下面進一步例舉實施例以詳細說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。
[0033]實施例1
制備包覆殼聚糖(Cs)和裝載過氧化苯甲酰(BPO)的空心介孔二氧化硅納米粒子(ΒΡ00HMSNs-Cs-1)。
[0034]步驟A)制備空心介孔二氧化娃納米粒子(HMSNs)
首先，利用stober方法制備實心二氧化硅納米球。之后，將制備出來的實心二氧化硅納米球(200mg)分散到40mL去離子水中，并超聲15分鐘以分散其中的納米粒子。在此期間，將300mg十六烷基三甲基溴化銨(C16TAB)分散到60mL去離子水，60mL乙醇和1.3mL氨水中，室溫下混勻。之后，將上述超聲后的實心二氧化硅納米球懸浮液加入到C16TAB混合液中并超聲I小時。之后，向上述混合物中快速加入0.53mL正硅酸乙酯(TEOS)并繼續(xù)攪拌7小時。反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的白色沉淀物離心。之后，將這些沉淀物重新分散到0.4M Na2CO3水溶液中，并在50°C條件下磁力攪拌13小時。最終獲得的白色沉淀物經(jīng)離心、醇洗后真空干燥。最后，通過離子交換法去除所制備的空心介孔二氧化硅孔道內(nèi)的表面活性劑C16TAB:將上述獲得的干燥后的樣品(0.5g)分散到含有95%的乙醇水溶液和0.2g硝酸銨的混合液中，將此混合物在60°C下磁力攪拌5小時，產(chǎn)物經(jīng)離心、醇洗后真空干燥，即可得空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)。
[0035]圖1為本實施例制備的空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)的透射電子顯微照片(TEM)。由圖1可見:所制備的空心介孔二氧化硅納米球呈規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，直徑約為350nm。所制備的球形二氧化娃為空心并具備清晰的介孔孔道,介孔壁厚約為80nm。
[0036]步驟B)將過氧化苯甲酰(BPO)裝入空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)采用簡單的物理浸潰方法裝載過氧化苯甲酰(ΒΡ0)。首先將由步驟A)獲得的HMSNs分散到BPO丙酮溶液中，將此懸濁液在黑暗環(huán)境下常溫攪拌12小時。之后，將獲得的懸浮液離心，用少量乙醇洗去表面吸附的BPO分子，之后真空室溫干燥，即可獲得裝載了 BPO的HMSNs，標(biāo)記為BPOiHMSNs0
[0037]圖2為本實施例制備的裝載BPO的空心介孔二氧化硅納米粒子(BPOOHMSNs)的傅里葉變換紅外光譜圖。與單純的HMSNs相比，在BPOOHMSNs中出現(xiàn)了位于1760，1228，1000和706CHT1處的BPO的特征峰，這些特征峰分別對應(yīng)于過氧化苯甲酰的vC = 0(1760cm_1)，vC = C (1600 ~1450cm-1)，δ C-H(706cm_1)和 v C_0 (1228 和 lOOOcnT1)，從而證明了 BPO 的
成功裝載。
[0038]步驟C)對BPOOHMSNs進行表面殼聚糖(Cs)包覆
將0.6g殼聚糖加入到IOOmLlO%的乙酸水溶液中常溫攪拌24小時，得到0.6%的殼聚糖溶膠，然后用氫氧化鈉將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.0。將步驟B)中制得的BPOOHMSNs分散到上述的殼聚糖溶膠中，緩慢攪拌24小時。之后，離心、水洗后，干燥即得到殼聚糖(Cs)包覆的載有BPO的介孔二氧化硅納米粒子，標(biāo)記為BP0@HMSNs-Cs-l。
[0039]用透射電子顯微鏡(TEM)觀察所制備的表面包覆有殼聚糖并裝載有BPO的介孔二氧化硅納米復(fù)合物(BPOOHMSNs-Cs-l)。TEM結(jié)果顯示，HMSNs的表面有一層有機物分子覆蓋，所形成的納米復(fù)合物相對于之前的HMSNs，顆粒尺寸因為殼聚糖的包覆而略有增加，TEM清楚的表面了殼聚糖在納米復(fù)合物表面的成功包覆。
[0040]實施例2
制備鍵接殼聚糖(Cs)和裝載過氧化苯甲酰(BPO)的空心介孔二氧化硅納米粒子(ΒΡ00HMSNs-Cs-2)以及pH響應(yīng)性的BPO釋放評價。
[0041]步驟A)制備空心介孔二氧化娃納米粒子(HMSNs)
按照實施例1的步驟A)制備得到HMSNs ；
步驟B)對空心介孔二氧化硅納米粒子(HMSNs)表面進行Y -GPTMS修飾利用HMSNs表面富含硅羥基的特點，將HMSNs與硅烷偶聯(lián)劑Y-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(Y -GPTMS)反應(yīng)，使HMSNs的表面修飾一層Y -GPTMS分子，成為以環(huán)氧烷基為端基的HMSNs (標(biāo)記為HMSNs-G)，以方便后續(xù)的殼聚糖修飾；
步驟C)將過氧化苯甲酰(BPO)裝入HMSNs-G
采用簡單的物理浸潰方法將過氧化苯甲酰(BPO)分子擴散進入HMSNs-G的介孔孔道。將步驟B)獲得的HMSNs-G分散到BPO丙酮溶液中，在黑暗環(huán)境下常溫攪拌12小時。之后，將獲得的懸浮液離心，用少量乙醇洗去表面吸附的BPO分子，之后真空室溫干燥，即可獲得裝載了 BPO 的 HMSNs-G，標(biāo)記為 BP0@HMSNs_G ；
步驟D)在BP0@HMSNs-G表面鍵接殼聚糖(Cs)BPOOHMSNs-G表面鍵接了大量的環(huán)氧烷基，利用環(huán)氧烷基與殼聚糖的氨基在酸性催化下的環(huán)氧烷基-氨基加成反應(yīng)，將Cs鍵接到BPOOHMSNs-G表面。將0.6g殼聚糖加入到IOOmLlO%的乙酸水溶液中常溫攪拌24小時，得到0.6%的殼聚糖溶膠，然后用氫氧化鈉將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0。將步驟C)獲得的BPOOHMSNs-G分散到上述的殼聚糖溶膠中，在黑暗條件下常溫攪拌12小時，靜置6小時，之后調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4。經(jīng)離心、水洗、干燥后即可得到表面鍵接殼聚糖(Cs)并裝載BPO的二氧化硅納米復(fù)合物，標(biāo)記為:BP0@HMSNS-CS-2 ；對獲得的BP0@HMSNs-Cs-2進行能量色散譜(EDS)分析發(fā)現(xiàn)，與HMSNs相比，在BPOOHMSNs-Cs-2中出現(xiàn)了明顯的C元素的吸收峰，說明了 Cs的成功鍵接；
步驟E)評價BP0@HMSNs-Cs-2的pH響應(yīng)性的BPO釋放
將BP0@HMSNs-Cs-2分散到不同pH的PBS溶液中以檢測所制備的BP0@HMSNs-Cs_2中BPO的釋放情況。選擇pH7.4和6.5的PBS溶液是為了分別模擬正常組織細胞環(huán)境(pH ^ 7.4)和發(fā)炎組織和癌細胞等病變組織環(huán)境(pH~6.5)。將混合液至于室溫下的搖床上輕輕搖晃。在特定的時間間隔，將混合液離心，并從上清液中取出3mL用于紫外/可見吸收光譜測定。于此同時，向離心后的混合液中加入3mL新鮮的釋放介質(zhì)，混合液經(jīng)混勻后，繼續(xù)至于搖床上，用于后續(xù)的藥物釋放分析。為了測定所獲得的溶液中BPO的含量，對所取出的釋放介質(zhì)經(jīng)乙醇稀釋后，將獲得的乙醇溶液進行紫外/可見吸收光譜測定分析。每份測試做三次，對三次的測試結(jié)果取平均值。
[0042]圖3是BP0@HMSNs-Cs-2的釋放液的紫外/可見吸收光譜。從圖中可以看出，釋放介質(zhì)中BPO在234nm處有一個明顯的吸收峰，這與BPO乙醇水溶液的吸收峰(λ max =234nm)是一致的，這就說明所釋放出來的BPO保持了良好的穩(wěn)定性。
[0043]根據(jù)紫外/可見吸收光譜分析所獲得的BPO的累積釋放曲線發(fā)現(xiàn)BP0@HMSNS-CS-2中BPO的釋放具有明顯的pH響應(yīng)性。在pH7.4的PBS環(huán)境中的釋放量要明顯低于在pH6.5的PBS環(huán)境中的藥物釋放量。這種巨大的釋放差異主要是由以下原因引起的:殼聚糖中的氨基的離子化狀態(tài)和PH有很大的關(guān)系，當(dāng)處于pH = 7.4的釋放介質(zhì)中，殼聚糖分子呈現(xiàn)有序的團聚態(tài)，殼聚糖塌陷的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有效的阻止了 BPO從BP0@HMSNS-CS-2中釋放出來。與PH7.4條件下的受限的釋放相比，在pH6.5的PBS溶液中，BPO的釋放速率有所增加，這主要是由于HMSNs表面的殼聚糖分子在不同pH環(huán)境中的柔性和膨脹行為引起的。當(dāng)處于酸性的微環(huán)境(PH6.5)下，殼聚糖的氨基發(fā)生質(zhì)子化，進一步的，PBS溶液中的抗衡離子會在殼聚糖聚電解質(zhì)表面聚集以補充多余的電荷，這種富集會引起溶液滲透壓的增加，這種增加的滲透壓使得更多的水分子從溶液中進入殼聚糖聚電解質(zhì)層，結(jié)果，殼聚糖層膨脹成為一種疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并從之前的有序團聚態(tài)變?yōu)橐环N雜亂的柔性團聚態(tài)，這就使得HMSNs表面部分的介孔孔道被釋放，進而導(dǎo)致后續(xù)的加速的BPO釋放?；谝陨系姆治觯覀兛梢酝茢?，殼聚糖賦予了 HMSNs載體一種pH響應(yīng)的可控性釋放特性，也就是說，在病變組織附近，BPO加速釋放。但是，在正常組織的微環(huán)境下基本不會產(chǎn)生BPO的泄露。這種pH響應(yīng)下的BPO釋放特性增加了 BPO的治療效率并降低了它對正常組織的毒副作用。
[0044]實施例3
制備過氧化氫修飾的介孔二氧化硅納米粒子(MSNs-OOH)
步驟A)制備介孔二氧化娃納米粒子(MSNs)
將0.28g氫氧化鈉(NaOH)和1.0g十六烷基三甲基溴化銨(C16TAB)分散到480mL去離子水中，并在80°C下劇烈攪拌I個小時。之后將5.0mL正硅酸乙酯(TEOS)加入上述混合液中，并繼續(xù)在80°C攪拌2小時。反應(yīng)結(jié)束后將獲得的白色沉淀物離心，用大量乙醇洗，之后真空冷凍干燥。最后，通過離子交換法去除所制備的介孔二氧化硅孔道內(nèi)的表面活性劑C16TAB:將上述獲得的干燥后的樣品(0.5g)分散到含有95%的乙醇水溶液和0.2g硝酸銨的混合液中，將混合物在60°C下磁力攪拌5小時，產(chǎn)物經(jīng)離心、醇洗、真空干燥，即可得介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)；
步驟B)制備過氧化氫修飾的介孔二氧化硅納米粒子(MSNs-OOH)
利用硫酸和過氧化氫混合物的強氧化性，使介孔硅表面發(fā)生過氧化反應(yīng)從而獲得過氧化氫修飾的介孔二氧化硅 納米粒子。在0°C的冰浴中，將由步驟A)制得的MSNs分散到65 %的硫酸和30%的雙氧水混合液中。將獲得的懸濁液超聲30分鐘后，繼續(xù)磁力攪拌4小時。將所獲得的懸濁液離心，并用大量的水洗，直到溶液的PH達到7左右，最后將獲得的白色沉淀物室溫真空干燥，即可得到過氧化氫修飾的介孔二氧化硅納米粒子，標(biāo)記為MSNs-OOH。
[0045]實施例4
制備叔丁基過氧化的介孔二氧化硅納米粒子(MSNs-OO(CH3)3)及自由基產(chǎn)生評價 A)制備介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)
按照實施例3的步驟A)制備得到MSNs ；
步驟B)制備表面氯化的介孔二氧化娃納米粒子(MSNs-Cl)
介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)表面存在大量的硅羥基，氯化亞砜(SOCl2)是有機合成中常用的硅羥基等基團的氯化劑。先用SOCljt MSNs進行氯化。將步驟A)制得的干燥的MSNs (2.0g)分散到90mL SOCl2和IOOmL氯仿混合液中，經(jīng)超聲30分鐘后，在磁力攪拌下回流24小時。反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的產(chǎn)物抽濾，用氯仿和丙酮洗一遍以除去多余的SOCl2,之后真空干燥，即可得到表面氯化的介孔二氧化硅納米粒子(標(biāo)記為MSNs-Cl)。將所得的MSNs-Cl轉(zhuǎn)移至手套箱中充氮氣保護，以用于后續(xù)的過氧化修飾；
步驟C)制備表面叔丁基過氧化的介孔二氧化娃納米粒子(MSNs-OO(CH3)3)
將步驟B)制得的MSNs-Cl分散到90mL 二氧六環(huán)和12mL叔丁基過氧化氫(TBHP)混合液中，并向其中加入0.3g NaHCO3，反應(yīng)混合物在20°C下干燥的氮氣氛圍中攪拌反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，懸濁液經(jīng)抽濾、甲醇洗、之后在室溫真空干燥，即可獲得表面叔丁基過氧化的介孔二氧化硅納米粒子，標(biāo)記為MSNs-OO(CH3)3 ；
步驟D)評價MSNs-OO (CH3) 3產(chǎn)生自由基的特性
使用熒光實驗檢測MSNs-OO (CH3) 3產(chǎn)生出來的自由基。為了檢測MSNs-OO (CH3) 3產(chǎn)生自由基的特性，細胞在給予MSNs-OO(CH3)3培養(yǎng)4小時后，我們向細胞培養(yǎng)基中加入了一種非熒光的探針2' I' -二乙酰二氯熒光素(DCFH-DA)，進一步培養(yǎng)30分鐘之后，進行熒光顯微鏡觀察。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞在給予MSNs-OO (CH3) 3培養(yǎng)后，出現(xiàn)了明顯的綠色DCF熒光，這就說明在培養(yǎng)過程中有氧自由基的產(chǎn)生。相比之下，空白組細胞內(nèi)基本上看不到熒光。說明了所構(gòu)建的MSNs-OO(CH3)3可以有效的實現(xiàn)自由基的釋放。
[0046]實施例5
制備包覆殼聚糖(Cs)和裝載青蒿素(ART)的空心介孔二氧化硅納米粒子(ART0HMSNs-Cs-1)
步驟A)制備空心介孔二氧化娃納米粒子(HMSNs)按照實施案例I的步驟A)制備得到HMSNs ；
步驟B)將青蒿素(ART)裝入空心介孔二氧化硅納米粒子
采用簡單的物理浸潰方法裝載青蒿素(ART)。首先將步驟A)獲得的HMSNs分散到ART乙醇溶液中，在黑暗環(huán)境下常溫攪拌12小時。之后，將獲得的懸浮液離心，用少量水洗去表面吸附的ART分子，之后真空室溫干燥，即可獲得裝載了 ART的HMSNs，標(biāo)記為ARTOHMSNs ；步驟C)對ARTOHMSNs進行表面殼聚糖(Cs)包覆
將0.6g殼聚糖加入到IOOmLlO%的乙酸水溶液中常溫攪拌24小時，得到0.6%的殼聚糖溶膠，然后用氫氧化鈉將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.0。然后將步驟B)中制得的ARIWMSNs分散到上述的殼聚糖溶膠中，緩慢攪拌24小時。之后，離心、水洗、干燥即得到殼聚糖(Cs)包覆的載有ART的介孔二氧化硅納米粒子(標(biāo)記為ART@HMSNs-Cs-l)。
[0047]對制得的HMSNs和ART@HMSNs-Cs-l進行氮氣洗脫附等溫線分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純的HMSNs呈現(xiàn)出典型的Langmuir IV型等溫線，在相對壓(P/PJ位于0.3-0.4之間有一個明顯的毛細管收縮。相比之下，經(jīng)ART裝載和進一步的殼聚糖包覆之后，ARTiHMSNs-Cs-1樣品中基本已檢測不到相對壓的變化。我們推斷，殼聚糖分子可能吸附于介孔二氧化硅的孔道表面，使得介孔孔道被阻塞。這也間接的證明了 Cs在介孔硅納米粒子表面的成功包覆。
[0048]實施例6
制備鍵接殼聚糖(Cs)和裝載青蒿素(ART)的空心介孔二氧化硅納米粒子(ART0HMSNs-Cs-2)以及所產(chǎn)生的自由基的細胞毒性評價
步驟A)和步驟B)同實施例2的步驟A)和步驟B)；
步驟C)將青蒿素(ART)裝入HMSNs-G
采用簡單的物理浸潰方法將青蒿素(ART)分子擴散進入HMSNs-G的介孔孔道。將步驟B)獲得的HMSNs-G分散到ART乙醇溶液中，在黑暗環(huán)境下常溫攪拌12小時。之后，將獲得的懸浮液離心，用 少量水洗去表面吸附的ART分子，之后真空室溫干燥，即可獲得裝載了ART 的 HMSNs-G，標(biāo)記為 ART@HMSNs_G ；
步驟D)在ART@HMSNs-G表面鍵接殼聚糖(Cs)
ARTiHMSNs-G表面鍵接了大量的環(huán)氧烷基，利用環(huán)氧烷基與殼聚糖的氨基在酸性催化下的環(huán)氧烷基-氨基加成反應(yīng)，將Cs鍵接到ARIWMSNs-G表面。將0.6g殼聚糖加入到IOOmLlO%的乙酸水溶液中常溫攪拌24小時，得到0.6%的殼聚糖溶膠，然后用氫氧化鈉將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0。將步驟C)獲得的ARTOHMSNs-G分散到上述的殼聚糖溶膠中，在黑暗條件下常溫攪拌12小時，靜置6小時，之后調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4。經(jīng)離心、水洗、干燥后即可得到表面鍵接殼聚糖(Cs)并裝載ART的二氧化硅納米復(fù)合物，標(biāo)記為:ART@HMSNS-CS-2。
[0049]步驟E)觀察ART@HMSNs-Cs-2的細胞毒性作用
1.細胞培養(yǎng):
人類乳腺癌細胞ZR75-30來自于中科院細胞庫，并培養(yǎng)在pH7.4的RPM1-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時向培養(yǎng)基中加入10%熱滅活的胎牛血清(FBS)和I %的青-鏈霉素混合液，并放置在含有5.0% CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有的細胞實驗都是在細胞生長對數(shù)期進行的；
2.對細胞給予ART@HMSNs-Cs-2培養(yǎng)ZR75-30細胞經(jīng)0.25%的胰酶溶液消化收集后，鋪板在96孔板中，并在含有5.0% CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時之后,倒掉最初的培養(yǎng)基,并換成新的含有一定濃度ARTiHMSNs-Cs-2的培養(yǎng)基，并繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)指定的時間。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去含有粉體的培養(yǎng)基，用PBS輕輕的洗2遍細胞，使用倒置顯微鏡觀察ART@HMSNS-CS-2用藥前后細胞形態(tài)的變化；
對細胞給予ART@HMSNs-Cs-2培養(yǎng)后的細胞形態(tài)電子照片結(jié)果顯示:空白組的ZR75-30細胞經(jīng)24小時培養(yǎng)之后，呈現(xiàn)良好的梭形形貌并且具有良好的貼壁性。相比之下，當(dāng)給予ARTiHMSNs-Cs-224小時培養(yǎng)之后，細胞呈現(xiàn)出明顯的多核化現(xiàn)象，并且細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的液泡，大部分細胞呈現(xiàn)圓形，細胞吸附性降低。說明了我們所制備的納米復(fù)合物可以成功的被細胞吞噬，并表現(xiàn)出對腫瘤細胞的損傷作用。
[0050]本發(fā)明所述的pH響應(yīng)性自由基釋放體系可以響應(yīng)性地在腫瘤組織附近(pH = 6.5)產(chǎn)生自由基，而在正常組織處(pH = 7.4)不釋藥，從而避免了自由基對正常組織的損傷作用。因此，具有重大的醫(yī)藥業(yè)應(yīng)用前景和價值。
【權(quán)利要求】
1.一種殼聚糖修飾的介孔二氧化硅基緩控釋材料，其特征在于，所述材料由介孔孔道可負載能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的介孔二氧化硅納米粒子、負載在介孔二氧化硅納米粒子介孔孔道中的自由基的化合物或基團，以及包覆所述介孔二氧化硅納米粒子的殼聚糖聚合電解質(zhì)膜組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于，產(chǎn)生自由基的化合物或基團包括含有過氧鍵的過氧化物或基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的材料，其特征在于，產(chǎn)生自由基的化合物或基團被裝載入或者被鍵接在介孔二氧化硅基材料的介孔孔道內(nèi)和/或者介孔表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的材料，其特征在于，自由基是指過氧化物、內(nèi)氧化物在反應(yīng)過程中的一系列中間產(chǎn)物，包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的材料，其特征在于，中間產(chǎn)物包含過氧自由基、烷氧基自由基、烷基自由基、有機過氧化氫物中的至少一種。
6.一種權(quán)利要求1-5任一所述材料的應(yīng)用，其特征在于，所述材料響應(yīng)pH值控制材料負載的能夠產(chǎn)生自由基的化合物或基團的釋放速率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述材料負載的產(chǎn)生自由基的化合物或基團在pH=6.5條件下的 釋放率大于在pH=7.4條件下的釋放率。
【文檔編號】A61K47/04GK103961713SQ201410188283
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】祝迎春, 符靜珂 申請人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所