中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備及應用，該納米反應器是以正硅酸乙酯作為硅源，以P123為模板劑，以正癸烷和1,3,5?三甲基苯的復合物為添加劑，先利用水熱合成法制備成中空球缺形介孔二氧化硅，然后以其為固定化載體固載氯過氧化物酶得到。本發(fā)明制備方法簡單，反應條件溫和，所得介孔二氧化硅為中空球缺形，比表面積較大，介孔孔徑范圍在14～18nm左右，能實現(xiàn)氯過氧化物酶的單分子固定，并且為氯過氧化物酶留有一定的翻轉(zhuǎn)空間。本發(fā)明中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器對茜素紅表現(xiàn)出很好的降解能力，使用8次后降解率仍然可達到100％，且其耐高溫性提高至50℃左右，酸堿耐受性也有所改善。
【專利說明】
中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備 及應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于酶的固定化技術領域，具體涉及一種中空球缺形介孔二氧化硅載體材 料單分子固定氯過氧化物酶的方法，以及該方法制備的納米反應器在降解茜素紅中的應 用。
【背景技術】
[0002] 氯過氧化物酶(CP0)是從海洋真菌Caldariomyces fumago中分離出來的一種血紅 素過氧化物酶(42kDa)<XP0具有極為廣泛的氧化活性，兼具血紅素過氧化物酶(單電子及兩 電子過氧化、有機鹵化）、過氧化氫酶(過氧化氫歧化、一元醇氧化）以及細胞色素 P-450(脫 烷基化、烯鍵環(huán)氧化、磺化氧化等)等多種酶的催化特征，目前被認為是過氧化物酶家族中 應用最廣泛的酶。但游離的CP0對強酸強堿、高溫、有機溶劑等耐受性極差，所以通常需要實 現(xiàn)酶固定化。酶在固相載體上的固定化可以有效改善酶對強酸強堿、高溫、有機溶劑等的耐 受性，提高其在反應環(huán)境中的穩(wěn)定性，并通過實現(xiàn)重復使用來降低使用成本，從而提升酶試 劑的產(chǎn)業(yè)化應用潛能。固相載體對固定化酶的性能有重要影響。介孔材料因其具有較大的 比表面積、高的孔隙率等優(yōu)勢，被廣泛用于酶的固定化，但其在酶的固定化方面存在介孔材 料與酶分子尺寸不匹配等問題。酶的固定化要求介孔材料的孔徑既要大于一定范圍使酶分 子能夠進去，并提供一定的空間滿足酶分子在催化過程中翻轉(zhuǎn)的需要，同時介孔材料的孔 徑又不能太大，以免使進去的酶分子較多而產(chǎn)生聚集從而造成底物在其中的傳質(zhì)阻力增 大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種比表面積大、空隙率高、孔徑與氯過氧 化物酶分子尺寸匹配的中空球缺形介孔二氧化硅實現(xiàn)單分子固定氯過氧化物酶的方法，并 為該方法制備的納米反應器提供一種新的應用。
[0004] 解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成：
[0005] 1、制備中空球缺形介孔二氧化硅
[0006] 將P123加入濃鹽酸與去離子水的體積比為1:8~10的混合液中，然后加入1，3,5_ 三甲基苯和正癸烷，攪拌至P123完全溶解，再加入正硅酸乙酯，在40~50 °C下攪拌反應16~ 20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中，在80~120°C下水熱反應24~36小時，冷卻至室溫，抽濾、洗 滌、真空干燥，所得產(chǎn)物在500~600°C下煅燒3~5小時，得到中空球缺形介孔二氧化硅，其 中1，3，5_三甲基苯與正癸烷、P123的質(zhì)量比為1:(1.5~4) :(0.3~1)，正硅酸乙酯與P123的 質(zhì)量比為1.5~3:1。
[0007] 2、固定化氯過氧化物酶
[0008] 將中空球缺形介孔二氧化硅加入pH值為2.75~5.0的磷酸緩沖液中，超聲分散均 勻，再加入氯過氧化物酶水溶液，室溫震蕩溫育2~4小時，離心分離，真空干燥，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器。
[0009] 上述步驟1中，優(yōu)選1，3,5-三甲基苯與正癸烷、P123的質(zhì)量比為1:2:0.4,優(yōu)選正硅 酸乙酯與P123的質(zhì)量比為2:1。
[0010] 上述步驟1中，進一步優(yōu)選在1〇〇 °C下水熱反應30小時，所得產(chǎn)物進一步優(yōu)選在550 °C下煅燒4小時。
[0011] 上述步驟2中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃與氯過氧化物酶的質(zhì)量比為1: 0.01~0.05，進一步優(yōu)選中空球缺形介孔二氧化娃與氯過氧化物酶的質(zhì)量比為1:0.02~ 0.03，所述磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選為3~3.5。
[0012] 上述的P123為聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物，其數(shù)均分子量 為5800,由Sigma-Aldrich公司提供。
[0013] 上述方法制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器在催化降解 茜素紅中的應用，具體方法為：向pH值為2~4的磷酸緩沖液中加入中空球缺形介孔二氧化 硅/氯過氧化物酶納米反應器、待降解的茜素紅樣品和H 202水溶液，混合均勻，其中空球缺形 介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器中固載的氯過氧化物酶與H 2〇2、茜素紅的摩爾比為 1: (60~70): (100~300)，在20°C下恒溫震蕩反應10~20分鐘。
[0014]本發(fā)明以正硅酸乙酯作為硅源，以P123為模板劑，以正癸烷和1，3,5_三甲基苯的 復合物為添加劑，利用水熱合成法制備成球缺形介孔二氧化硅，然后以其為固定化載體用 于氯過氧化物酶的固定化。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：
[0015] 1、本發(fā)明采用水熱法制備球缺形介孔二氧化硅，制備方法簡單，反應條件溫和，所 得介孔二氧化硅為空心球缺形，比表面積較大，介孔孔徑范圍在14~18nm左右，而氯過氧化 物酶分子的直徑為7nm左右，該介孔材料的尺寸恰好能實現(xiàn)氯過氧化物酶的單分子固定，并 且為氯過氧化物酶留有一定的翻轉(zhuǎn)空間。
[0016] 2、本發(fā)明采用空心球缺形介孔二氧化硅固定氯過氧化物酶后，氯過氧化物酶對茜 素紅表現(xiàn)出很好的降解能力，使用8次后降解率仍然可達到100%，且耐高溫性提高至50°C 左右，酸堿耐受性也有所改善。
【附圖說明】
[0017]圖1是實施例1制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的掃描電鏡圖。
[0018] 圖2是實施例1制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的透射電鏡圖。
[0019] 圖3是實施例1制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的氮氣吸附-脫附 等溫線圖。
[0020] 圖4是實施例1制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的孔徑分布圖。
[0021 ]圖5是實施例2制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的掃描電鏡圖。
[0022] 圖6是實施例2制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的透射電鏡圖。
[0023] 圖7是實施例2制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的氮氣吸附-脫附 等溫線圖。
[0024] 圖8是實施例2制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的孔徑分布圖。
[0025] 圖9是實施例1~4制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的熱穩(wěn)定性柱 狀圖。
[0026] 圖10是實施例1~4制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶的pH耐受性柱 狀圖。
[0027] 圖11是實施例1制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶降解茜素紅的循 環(huán)使用效果圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于 這些實施例。
[0029] 實施例1
[0030] 1、制備中空球缺形介孔二氧化硅
[0031] 向100mL燒杯中加入lg數(shù)均分子量為5800的P123、3.7mL濃HC1 (質(zhì)量分數(shù)為37%)、 30mL去離子水，再加入2.5g 1，3，5-三甲基苯和5.0g正癸烷，攪拌使P123完全溶解，再加入 2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力攪拌反應20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中，在100°C下水熱反應 30小時，冷卻至室溫，抽濾，分別用去離子水和無水乙醇充分過濾洗滌，然后在80°C下真空 干燥10小時，所得產(chǎn)物置于馬弗爐中在550°C下煅燒4小時，除去模板劑P123,冷卻到室溫， 得到中空球缺形介孔二氧化硅。
[0032] 2、固定化氯過氧化物酶
[0033] 將5mg中空球缺形介孔二氧化硅加入到2mL的離心管中，向其中加入1480μ L0 · lmol/L pH值為3的磷酸緩沖液，超聲分散均勻，再加入20yL 0· 15mmol/L的氯過氧化物 酶水溶液，將離心管放置在冷凍恒溫水浴振蕩器中，室溫震蕩溫育3小時，震蕩完后，將離心 管放在冷凍離心機中12000轉(zhuǎn)/分子離心4分鐘，得到中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物 酶納米反應器。
[0034] 采用Quanta200型環(huán)境掃描電子顯微鏡(FEI公司）、JEM-2100型透射電子顯微鏡 (日本電子有限公司）、ASAP2020HD88型物理吸附儀(麥克默瑞提克(上海)儀器有限公司）分 別對所得納米反應器進行形貌和氮氣吸附-脫附和孔徑分布測試，結(jié)果見圖1~3。由圖1可 見，所得產(chǎn)品呈規(guī)則的中空球缺形，即每個球體上面都具有一個開口，表面粗糙。由圖2可 見，所得產(chǎn)品為介孔材料，且孔道結(jié)構(gòu)有序，其表面積為731.8059m 2 · g<、孔容約為 1.758597cm3 · g-\孔徑為2.9523nm(見圖3和4)，酶的固載量在 13.0mg · g-、
[0035] 實施例2
[0036] 在實施例1的步驟1中，向100mL燒杯中加入lg數(shù)均分子量為5800的P123、3.7mL濃 HC1 (質(zhì)量分數(shù)為37 % )、30mL去離子水，再加入1.5g 1，3，5-三甲基苯和6g正癸烷，攪拌使 P123完全溶解，再加入2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力攪拌反應20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜 中，在100°C下水熱反應30小時，冷卻至室溫，抽濾，分別用去離子水和無水乙醇充分過濾洗 滌，然后在80°C下真空干燥10小時，所得產(chǎn)物置于馬弗爐中在550°C下煅燒4小時，除去模板 劑P123,冷卻到室溫，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步驟與實施例1相同，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器。由圖5可見，所得產(chǎn)品呈規(guī)則的中空球缺形， 即每個球體上面都具有一個開口，表面光滑。由圖6可見，所得產(chǎn)品為介孔材料，且孔道結(jié)構(gòu) 有序，其表面積為535.8029m 2 · g-1、孔容約為1.325893cm3 · g-1、孔徑為14.7676nm(見圖7和 8)，酶的固載量在12.3mg · g一、
[0037] 實施例3
[0038] 在實施例1的步驟1中，向100mL燒杯中加入1.5g數(shù)均分子量為5800的P123、3.7mL 濃HC1 (質(zhì)量分數(shù)為37 % )、30mL去離子水，再加入3g 1，3，5-三甲基苯和4.5g正癸烷，攪拌使 P123完全溶解，再加入2.5g正硅酸乙酯，在40°C下磁力攪拌反應20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應 釜中，在100°C下水熱反應30小時，冷卻至室溫，抽濾，分別用去離子水和無水乙醇充分過濾 洗滌，然后在80°C下真空干燥10小時，所得產(chǎn)物置于馬弗爐中在550°C下煅燒4小時，除去模 板劑P123,冷卻到室溫，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步驟與實施例1相同，得到中空 球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器，其表面積為731.8059m 2 · g<、孔容約為 1.758597cm3 · g-1、孔徑為22.9523nm，酶的固載量在12.6mg · g-1。
[0039] 實施例4
[0040] 在實施例1的步驟1中，向100mL燒杯中加入lg數(shù)均分子量為5800的P123、3.7mL濃 HC1 (質(zhì)量分數(shù)為37 % )、30mL去離子水，再加入2g 1，3，5-三甲基苯和5.5g正癸烷，攪拌使 P123完全溶解，再加入2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力攪拌反應20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜 中，在100°C下水熱反應30小時，冷卻至室溫，抽濾，分別用去離子水和無水乙醇充分過濾洗 滌，然后在80°C下真空干燥10小時，所得產(chǎn)物置于馬弗爐中在550°C下煅燒4小時，除去模板 劑P123,冷卻到室溫，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步驟與實施例1相同，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器。
[0041 ] 實施例5
[0042]實施例1~4制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器在降解茜 素紅中的應用，具體方法和試驗結(jié)果如下：
[0043]向2mL離心管中加入30yL 10mmol/L的茜素紅染料、5mg中空球缺形介孔二氧化硅/ 氯過氧化物酶納米反應器，并加入1370yL 0.1mol/L pH值為3的磷酸緩沖液、lOOyL lmmol/ L H2〇2水溶液，混合均勻，然后將離心管置于冷凍恒溫水浴振蕩器中，在20°C下恒溫震蕩反 應15分鐘，其降解率達到100%。
[0044] 為了確定本發(fā)明中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器（以下簡稱 固定化酶)的各項性能，發(fā)明人進行了如下實驗：
[0045] 1、熱穩(wěn)定性實驗
[0046]向2mL離心管中加入30yL 10mm〇l/L的茜素紅染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游離CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值為3的磷酸緩沖液、100yLlmmol/L H2〇2水溶液， 然后將離心管置于冷凍恒溫水浴振蕩器中，分別在20、30、40、50、60、70°(：下恒溫震蕩反應 15分鐘。利用降解率的大小可以表現(xiàn)出酶活性的相對大小，在同等條件下，降解率越大，酶 所具有的活性越大，催化性能越好。染料降解率即脫色率根據(jù)下式計算：
[0047]
[0048] 其中：Ao為染科降觶前在421nm處的吸光度值;At為染料降解后在421nm處的吸光度 值。測試結(jié)果見圖9。
[0049]由圖9可見，在50°C時，游離CP0對茜素紅的脫色率不到40%，酶活性明顯降低，而 本發(fā)明實施例1~4制備的固定化酶在50°C時仍表現(xiàn)出較好的酶活性，茜素紅的脫色率近 100%，說明其耐尚溫性明顯提尚。
[0050] 2、pH耐受性實驗
[00511向2mL離心管中加入30yL 10mm0l/L的茜素紅染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游離CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5的磷酸緩沖液， 再加入100此lmmol/L H202水溶液，然后將離心管置于冷凍恒溫水浴振蕩器中，在20°C下恒 溫震蕩反應15分鐘。測試茜素紅的脫色率，結(jié)果見圖10。
[0052]由圖10可見，在pH值為3.0時，固定化酶的降解率幾乎都達到了 100 %，而游離CP0 只達到40% ;繼續(xù)增大pH，在pH值為4.0時，游離CP0幾乎不再具有催化效果，但是本發(fā)明實 施例1~4制備的固定化酶對茜素紅的降解率仍可達到40%以上，其中實施例1制備的固定 化酶對茜素紅的降解率可達到80 %以上，說明其更耐酸性。
[0053] 3、重復使用實驗
[0054]向2mL離心管中加入30yL 10mm〇l/L的茜素紅染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游離CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值為3的磷酸緩沖液，再加入100yL 0.1mmol/L H2〇2水溶液，然后將離心管置于冷凍恒溫水浴振蕩器中，在20°C下恒溫震蕩反應15分鐘，然 后離心分離重復使用。測試重復使用次數(shù)對茜素紅脫色率的影響，結(jié)果見11。
[0055]由圖11可見，實施例1制備的固定化酶循環(huán)使用8次，其對茜素紅的降解率仍接近 100 %，說明其催化活性高、穩(wěn)定性好。
【主權項】
1. 一種中空球缺形介孔二氧化娃/氯過氧化物酶納米反應器的制備方法，其特征在于 它由下述步驟組成： (1) 制備中空球缺形介孔二氧化硅 將數(shù)均分子量為5800的P123加入濃鹽酸與去離子水的體積比為1:8~10的混合液中， 然后加入1，3,5-三甲基苯和正癸烷，攪拌至P123完全溶解，再加入正硅酸乙酯，在40~50°C 下攪拌反應16~20小時后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中，在80~120°C下水熱反應24~36小時，冷卻 至室溫，抽濾、洗滌、真空干燥，所得產(chǎn)物在500~600°C下煅燒3~5小時，得到中空球缺形介 孔二氧化硅，其中1，3，5_三甲基苯與正癸烷、P123的質(zhì)量比為1:(1.5~4) :(0.3~1)，正硅 酸乙酯與P123的質(zhì)量比為1.5~3:1; (2) 固定化氯過氧化物酶 將中空球缺形介孔二氧化硅加入pH值為2.75~5.0的磷酸緩沖液中，超聲分散均勻，再 加入氯過氧化物酶水溶液，室溫震蕩溫育2~4小時，離心分離，真空干燥，得到中空球缺形 介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器。2. 根據(jù)權利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備 方法，其特征在于:在步驟(1)中，所述1，3，5-三甲基苯與正癸烷、P123的質(zhì)量比為1:2:0.4。3. 根據(jù)權利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備 方法，其特征在于:在步驟(1)中，所述正硅酸乙酯與P123的質(zhì)量比為2:1。4. 根據(jù)權利要求1~3任意一項所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反 應器的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中，在100 °C下水熱反應30小時。5. 根據(jù)權利要求1~3任意一項所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反 應器的制備方法，其特征在于:在步驟(1)中，所得產(chǎn)物在550°C下煅燒4小時。6. 根據(jù)權利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制備 方法，其特征在于:在步驟(2)中，所述磷酸緩沖液的pH值為3~3.5。7. 根據(jù)權利要求1或6所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制 備方法，其特征在于:在步驟(2)中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃與氯過氧化物酶的質(zhì) 量比為1:0.01~0.05。8. 根據(jù)權利要求1或6所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器的制 備方法，其特征在于:在步驟(2)中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃與氯過氧化物酶的質(zhì) 量比為1:0.02~0.03。9. 權利要求1的方法制備的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器在催 化降解茜素紅中的應用。10. 根據(jù)權利要求9所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器在催化 降解茜素紅中的應用，其特征在于：向PH值為2~4的磷酸緩沖液中加入中空球缺形介孔二 氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器、待降解的茜素紅樣品和H 2O2水溶液，混合均勻，其中空球 缺形介孔二氧化硅/氯過氧化物酶納米反應器中固載的氯過氧化物酶與H 2〇2、茜素紅的摩爾 比為1: (60~70): (100~300)，在20°C下恒溫震蕩反應10~20分鐘。
【文檔編號】C02F3/34GK105907743SQ201610466484
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】蔣育澄, 程涵萍, 胡滿成, 李淑妮, 翟全國
【申請人】陜西師范大學