急性高尿酸血癥樹鼩模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及急性高尿酸血癥樹鼩模型的構(gòu)建方法，它包括如下步驟：步驟（1）：選取體重為110~150g，年齡為1~3歲成年健康樹鼩；步驟（2）：分別測定步驟（1）所述的樹鼩中雄性與雌性的空腹血清尿酸值；步驟（3）：對步驟（1）所述的樹鼩進(jìn)行常規(guī)性飼養(yǎng)，并對其施以用手抓放的預(yù)處理；步驟（4）：對步驟（3）處理后的樹鼩腹腔注射給予氧嗪酸鉀混懸液，所述氧嗪酸鉀混懸液的用量按樹鼩體重為40mg/kg~100mg/kg，即得到急性高尿酸血癥樹鼩模型。該模型具有典型的疾病表征，數(shù)量指標(biāo)具有統(tǒng)計學(xué)意義，同時血清尿素氮、血清肌酐值及組織病理學(xué)證實(shí)該造模劑量區(qū)間較為安全，不造成肝腎影響。
【專利說明】急性高尿酸血癥樹齣模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物模型的建立方法，具體涉及一種急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來隨著人民生活水平的提高，高尿酸血癥發(fā)病率逐年升高，且常與高血壓、高脂血癥及糖尿病等伴隨出現(xiàn)。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道,高尿酸血癥與冠心病、高血壓、糖尿病、腦卒中等明顯相關(guān)，為其獨(dú)立危險因子和重要的預(yù)后預(yù)測因子，所以痛風(fēng)及高尿酸血癥的研究正成為醫(yī)藥界的熱點(diǎn)。無論是藥物的篩選，還是致病機(jī)制的研究，都迫切需要一種公認(rèn)的科學(xué)、合理的動物模型。
[0003]現(xiàn)用于高尿酸血癥動物模型造模的動物主要是3類，靈長類、嚙齒類和禽類，最佳動物無疑是靈長類動物，由于其無論尿酸代謝途徑還是其他特點(diǎn)都與人類相似，但因價格昂貴，較少用于高尿酸血癥研究。禽類與人類的嘌呤核苷酸代謝途徑相似，缺乏尿酸酶，尿酸是其嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。Fayoum i品系雞在出生后兩周左右給高蛋白飼料，4~5個月內(nèi)即可在關(guān)節(jié)處出現(xiàn)痛風(fēng)結(jié)節(jié)。 選用鵪鶉復(fù)制高尿酸血癥模型也獲成功，并且不造成動物腎臟損傷，較為安全，但禽類屬于鳥類，種屬上與人類差距較大。而對于現(xiàn)多數(shù)使用的大鼠、小鼠高尿酸血癥模型來說，一方面，大小鼠對藥物敏感性低；另一方面，盡管與人類同屬于哺乳動物，但分類地位相差較遠(yuǎn)，屬于低等的嚙齒類動物，解剖和生理與人相差甚遠(yuǎn)，其動物模型得到的數(shù)據(jù)參考性有限，因此建立和開發(fā)與人體尿酸代謝異常相似的動物模型，深入開展痛風(fēng)和高尿酸血癥動物模型的研究，仍然是當(dāng)前高尿酸血癥及痛風(fēng)研究中急需加強(qiáng)的工作。
[0004]此外，由于人體尿酸代謝的復(fù)雜性與實(shí)驗(yàn)動物種族差異性、動物年齡的選擇、給藥方法、造模時間及模型判定尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同一造模劑，不同的給藥途徑、給藥劑量及動物來源對高尿酸血癥影響較大，現(xiàn)有文獻(xiàn)資料對不同誘導(dǎo)劑及相同給藥途徑的用量也有不同，若盲目參考文獻(xiàn)報道的用量，劑量過大，死亡率增高，如果劑量不足，成模率較低。因此，應(yīng)摸索出合適的劑量選擇區(qū)間，不同公司生產(chǎn)的試劑、藥品含結(jié)晶水多少、以及藥品放置時間，對劑量的選擇均有影響，因此使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑，通過藥物量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)摸索最佳造模劑量尤為重要，同時利用與人類遺傳關(guān)系更接近的實(shí)驗(yàn)動物建立高尿酸血癥動物模型更能反映人類尿酸代謝的本質(zhì)。
[0005]樹斷I (Tupaia belangeri, tree shrews)在分類學(xué)上屬哺乳綱,有胎盤類,是一個獨(dú)立的目，稱為攀駒目(Scandentia)，介于靈長目與食蟲目之間。樹駒具有體型小，易飼養(yǎng)和操作，管理方便，廉價經(jīng)濟(jì)，且其進(jìn)化程度高，新陳代謝和大體解剖比犬、大小鼠等動物與人更為接近，解剖結(jié)構(gòu)也更近似于人，因此其作為較理想的實(shí)驗(yàn)動物，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的研究中。
[0006]在本申請?zhí)岢鲋埃形匆娪欣脴漶x建立急性高尿酸血癥模型的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)在對高尿酸血癥新型實(shí)驗(yàn)動物模型開發(fā)的需求，本發(fā)明利用新型實(shí)驗(yàn)動物一樹駒，提供了一種急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法。
[0008]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0009]急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0010]步驟(1):選取 體重為110~150g，年齡為I~3歲成年健康樹駒，雌雄均可；
[0011]步驟(2):分別測定步驟(1)所述的樹駒中雄性與雌性的空腹血清尿酸值，這是由于樹駒作為一種新型實(shí)驗(yàn)動物，健康樹駒空腹血清尿酸值需進(jìn)行測定以確定其范圍；
[0012]步驟(3):對步驟(1)所述的樹駒進(jìn)行常規(guī)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于安靜及光照節(jié)律如常的環(huán)境中，并對其施以用手抓放的預(yù)處理，以去除樹駒應(yīng)激反應(yīng)對血液各項生化值的影響；
[0013]步驟⑷:對步驟⑶處理后的樹駒腹腔注射給予氧嗪酸鉀混懸液，所述氧嗪酸鉀混懸液的用量按樹斷I體重為40mg/kg~100mg/kg,即得到急性高尿酸血癥樹斷I模型。
[0014]所述的步驟(3)中常規(guī)性飼養(yǎng)采用蒸糕飼料飼喂。
[0015]所述的氧嗪酸鉀混懸液是以1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為溶劑。
[0016]所述的氧嗪酸鉀混懸液按照給藥容積/樹駒體重為10mL/kg配制，以達(dá)到每次每只樹駒腹腔注射體積為l_2ml，便于動物較好地吸收混懸劑的配制，濃度要均勻，現(xiàn)配現(xiàn)，使用時要搖勻。給藥2小時后樹駒血清尿酸值均大大高于尿酸產(chǎn)生結(jié)晶的飽和濃度417 μ mo I/L以上，升高至601.45 ±77.80 μ mol/L,與給藥前的動物血清尿酸值有顯著性差異，且血清尿素氮和血清肌酐值與給予按體重計算10mL/kg體積的1% CMC-Na的陰性對照組無顯著性差異，顯示該模型的建立劑量區(qū)間40mg/kg~100mg/kg較為安全，不造成肝腎影響，易于獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的急性高尿酸血癥樹駒模型。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用前景:
[0018]本發(fā)明首次利用親源關(guān)系更為接近人類的新型實(shí)驗(yàn)動物一樹駒建立了急性高尿酸血癥動物模型，該模型具有典型的疾病表征，數(shù)量指標(biāo)具有統(tǒng)計學(xué)意義，同時血清尿素氮、血清肌酐值及組織病理學(xué)證實(shí)該造模劑量區(qū)間較為安全，不造成肝腎影響，是一種簡單易行、可靠實(shí)用的技術(shù)，并且提供了一種更為反映人類高尿酸血癥本質(zhì)的模型。本發(fā)明對于開展相關(guān)疾病的研究意義重大。
[0019]首先，本發(fā)明樹駒高尿酸血癥的建立方法安全可靠，操作簡單，有效、靈敏，簡便、重復(fù)性好。40mg/kg劑量就能有效升高樹關(guān)血清尿酸值,相對于較大鼠400mg/kg和小鼠250mg/kg的用藥劑量，劑量相對較低，較為安全，對肝腎功能無影響，說明樹駒的藥物敏感性較大小鼠高，具有良好的應(yīng)用前景；其次，通過建立樹駒高尿酸血癥，可用于篩選和研制抗痛風(fēng)藥物，對評價相關(guān)抗高尿酸藥物對該病的藥效及作用機(jī)理具有十分重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1及圖2為不同劑量的氧嗪酸鉀+別嘌醇對樹駒肝組織中XDH/X0 mRNA表達(dá)水平的影響電泳圖，其中1-正常組；2-CMC-Na組；3_0A組；4_ALL0組；5_0A+ALL01組；6-0A+ALL02組；與正常組比較，OA組P < 0.05 ；
[0021]圖3為氧嗪酸鉀混懸液1000mg/kg劑量組動物腎臟病理切片圖，圖中出現(xiàn)腎淤血，腎曲管濁腫?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施方式及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0023]下述實(shí)施方式中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024]下述實(shí)施方式中所使用的材料試劑等，如無特殊說明，均為商業(yè)途徑得到。
[0025]1、實(shí)驗(yàn)動物
[0026]中緬樹駒滇西亞種，200只，本所設(shè)施內(nèi)常規(guī)性飼養(yǎng)，體重為122.69 土 14.4g,1-3歲齡，其中雌性114只，雄性86只。實(shí)驗(yàn)前空腹血清尿酸值為雌性動物平均值為168.98±53.31umol/L，雄性動物平均值為185.81 ±50.44umol/L,以上空腹血清尿酸值數(shù)值的獲得見實(shí)施例1正常樹駒血清尿酸值測定所述方法得到。實(shí)驗(yàn)前樹駒一直飼養(yǎng)于安靜及光照節(jié)律如常的環(huán)境中，在實(shí)驗(yàn)前對樹駒施以用手抓放的預(yù)處理，以去除樹駒應(yīng)激反應(yīng)對血液各項生化值的影響。常規(guī)統(tǒng)一的蒸糕飼料飼喂。
[0027]2、各種溶液配制
[0028]I % CMC-Na的配制:稱取3g CMC-Na (昆明誠悅科技公司生產(chǎn))放入500mL的錐形瓶中，緩慢加入IOOmL煮沸的滅菌蒸餾水膨脹，再緩慢加IOOmL滅菌蒸餾水于電爐上煮沸溶解，最后加煮沸的滅菌蒸餾水至300mL溶解定容即可，常溫保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0029]不同濃度氧嗪酸鉀溶液、不同濃度的別嘌醇(縮寫為ALL0)的配制，按10mL/kg體積，以達(dá)到每次每只動物腹腔注射體積控制在l_2mL左右，便于動物較好地吸收。 [0030]按照100mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、0.5mg/mL 不同濃度分別進(jìn)行氧嗪酸鉀(Oxonic acid potassium salt, Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品，Lot#STBC64180,純度^ 97% )配制，配制方法:電子天平準(zhǔn)確稱取氧嗪酸鉀1500mg、150mg、120mg、60mg、30mg、
7.25mg于單獨(dú)的15mL離心管內(nèi)，均加入15mLl%羧甲基纖維素鈉溶液溶液，用玻璃棒攪拌，配成100mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL的氧嗪酸鉀混懸溶液即可,現(xiàn)配現(xiàn)用。使用時分別按動物的公斤體重計算選擇相應(yīng)濃度混懸液計算所需濃度體積，如樹駒重量為100g，注射劑量為100mg/kg，則選擇相應(yīng)濃度lOmg/mL混懸液ImL腹腔注射。
[0031]按照16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL 和 0.4mg/mL 不同濃度分別進(jìn)行別嘌醇(南京都萊生物有限公司產(chǎn)品，純度> 98% )的配制，配制方法:電子天平準(zhǔn)確稱取別嘌醇240mg、120mg、60mg、45mg、30mg和6mg分別于單獨(dú)的15mL離心管內(nèi)，均加入
羧甲基纖維素鈉溶液，用玻璃棒攪拌，配成16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和0.4mg/mL的別嘌醇混懸溶液即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用時分別按動物的公斤體重計算選擇相應(yīng)濃度混懸液計算所需濃度體積，如樹駒重量為100g，注射劑量為30mg/kg，則選擇相應(yīng)濃度3mg/mL混懸液ImL腹腔注射。
[0032]3、試劑盒及病理切片診斷
[0033]血清尿酸檢測試劑盒:南京建成物工程研究所尿酸(UA)測定試劑盒。
[0034]血清尿素氮檢測試劑盒:南京建成物工程研究所尿素氮檢測試劑盒。
[0035]血清肌酐值檢測試劑盒:南京建成物工程研究所尿素氮檢測試劑盒。
[0036]腎臟病理切片取材:將動物一側(cè)腎臟沿矢狀面切開，經(jīng)4%甲醛溶液固定，交由昆明金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所公司進(jìn)行病理切片，出具病理診斷報告書。
[0037]樹駒飼養(yǎng)籠具:蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司生產(chǎn)。[0038]4、儀器設(shè)備
[0039]美國Bio-tck連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀MQX200R，Sigma高速冷凍離心機(jī)，Sartoyius公司精密電子天平ME235S ;日本Tomy公司SS-325高壓蒸氣滅菌箱；德國葛萊娜Greiner70507196 孔酶標(biāo)板。
[0040]下列實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean土SD)表示，組間兩兩比較選用t-test等方法，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P〈0.01時為極顯著性差異，P〈0.05時為顯著性差異，P>0.05為無顯著性差異。
[0041]實(shí)施例1:正常樹駒血清尿酸值測定
[0042]選取健康樹駒200只，中緬 樹駒滇西亞種，SCXK (滇)K2013-0001，SYXK (滇)K2013-0001，體重為122.69±14.4g，年齡2~3歲，其中雌性114只，雄性平均值86只。采空腹血，在2h之內(nèi)分離血清(4000rpm，4°C，15min)，使用南京建成生物工程研究所尿酸(UA)檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。
[0043]結(jié)果表明，測得200只成年樹駒血尿酸的給藥前正常值平均值為175.76±53.14umol/L，其中雌性動物平均值為168.98±53.31umol/L，雄性動物平均值為185.81 ±50.44umol/L。
[0044]實(shí)施例2:0A致樹駒急性高尿酸血癥的有效性實(shí)驗(yàn)
[0045]挑選18只健康樹駒，其中早10只，? 8只，體重120.6 ± 11.2g,隨機(jī)分為3組，每組動物6只(η = 6)，3組分別為1000mg/kg劑量組、100mg/kg劑量組、I % CMC-Na對照組，腹腔給藥，給藥后Oh，2h、4h、12h、24h、36h靜脈采血，于采血后2h內(nèi)血液樣本經(jīng)過4000rpm，4°C,15min離心分離得到血清，隨后按照試劑盒說明書的方法檢測血清尿酸值、血清尿素氮和血清肌酐值。
[0046]結(jié)果表明，腹腔注射0A1000mg/kg及100mg/kg均可在2h明顯升高樹鼠句血尿酸血值，其中1000mg/kg劑量組血尿酸值由133.54±26.39 μ mol/L升高到453.01 ±96.94 μ mol/L,高尿酸濃度可持續(xù)升高到 4h 的 480.57 ±60.76 μ mol/L。100mg/kg劑量組在2h血尿酸值可由141.89±39ymol/L升高到431.24±18.36 μ mol/L，均高于尿酸產(chǎn)生結(jié)晶的飽和濃度417 μ mol/L以上，給藥組與對照組相比差異有顯著性差異，見表1。
[0047]表1:腹腔注射氧嗪酸鉀不同時間點(diǎn)血清尿酸值，濃度單位:μ mol/L
[0048]
【權(quán)利要求】
1.急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟(1):選取體重為ll(Tl50g，年齡為廣3歲成年健康樹鼠句； 步驟(2):分別測定步驟(1)所述的樹駒中雄性與雌性的空腹血清尿酸值； 步驟(3):對步驟(1)所述的樹駒進(jìn)行常規(guī)性飼養(yǎng)，并對其施以用手抓放的預(yù)處理，以去除樹駒應(yīng)激反應(yīng)對血液各項生化值的影響； 步驟(4):對步驟(3)處理后的樹駒腹腔注射給予氧嗪酸鉀混懸液，所述氧嗪酸鉀混懸液的用量按樹斷I體重為40mg/kg"100mg/kg,即得到急性高尿酸血癥樹斷I模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中常規(guī)性飼養(yǎng)采用蒸糕飼料飼喂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的氧嗪酸鉀混懸液是以1%羧甲基纖維素鈉為溶劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的氧嗪酸鉀混懸液按照給藥容積/樹駒體重為10mL/kg配制，以達(dá)到每次每只樹駒腹腔注射體積控制為l_2mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性高尿酸血癥樹駒模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述的樹鼠句為I歲齡的中緬樹鼠句。
【文檔編號】A61K31/53GK103977007SQ201410188582
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】唐東紅, 葉尤松, 罕園園, 李桂珍, 楊光蕊, 賈學(xué)云, 李潤平, 念昕 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所