一種疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬支原體肺炎疫苗組合物，所述疫苗組合物包括P46蛋白、NrdF蛋白和/或獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑；所述疫苗組合物還可包括豬肺炎支原體全菌抗原。本發(fā)明還公開了含所述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬支原體肺炎的藥物中的應(yīng)用。所述疫苗組合物中的多免疫原性蛋白可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)，并且多免疫原性蛋白片段的組合可誘導(dǎo)產(chǎn)生協(xié)同的免疫效果；當所述疫苗組合物含多免疫原性蛋白及豬肺炎支原體全菌抗原時，比單獨使用全菌疫苗免疫時，豬肺炎支原體全菌抗原的含量顯著降低。
【專利說明】一種疫苗組合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬支原體肺炎疫苗組合物及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體肺炎又稱豬氣喘病或豬地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，普遍存在于世界 各地?；疾∝i主要表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，生長遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率低，嚴重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
[0003] 近幾年的研究發(fā)現(xiàn)：豬肺炎支原體感染病例日益增多，許多規(guī)模化養(yǎng)豬場受到豬 氣喘病的嚴重威脅。抗生素應(yīng)用在治療氣喘病雖然有一定效果，但是國家對于抗生濫用日 益重視，管理日益嚴格，因此，疫苗免疫將是未來有效預(yù)防該病的一種有效方法。而目前國 內(nèi)應(yīng)用的疫苗主要以弱毒疫苗和滅活疫苗為主，國產(chǎn)弱毒疫苗由于需要胸腔注射而不易推 廣；滅活疫苗雖然可通過肌肉注射，操作便易，但主要被以輝瑞、海博萊、勃林格為首的國外 公司壟斷，而且疫苗價格昂貴致使防疫成本變高。
[0004] 近年來，人們開始嘗試利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段從研究Mhp的致病機理和主要 抗原蛋白入手，利用外源表達載體獲得大量Mhp相關(guān)抗原蛋白，同時與其他相關(guān)刺激因子 重組表達而制備成新型豬支原體肺炎亞單位疫苗。這種新型的豬支原體肺炎亞單位疫苗 不含全菌疫苗的核酸，不僅不存在滅活不徹底造成的安全隱患，而且由于其不含全菌的 所有抗原，有利于疾病的凈化。但目前豬支原體肺炎亞單位疫苗免疫效果不佳，不能給 豬提供完全的保護（Fagan PK, Djordievic SP. Chin J, et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen (NrdF) · Infection and immunity, 1997, 65:2502-2507) 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了豬支原體肺炎疫苗組合物及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬支原體肺炎疫苗組合物，所述疫苗組合物包含 P46蛋白、NrdF蛋白和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
[0007] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬支原體肺炎"在臨床上的癥狀包括（但不限于）：呼吸癥狀 (嚴重急性臨床肺炎、咳嗽、呼吸困難、呼吸速迫）、發(fā)熱、高度傳染性、高發(fā)病率、低死亡率、 壞死性細胞支氣管炎及繼發(fā)性細菌性呼吸道感染增加。
[0008] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬支原體肺炎疫苗組合物"是指能夠用于預(yù)防和/或治療由豬 肺炎支原體感染所知病癥或疾病的疫苗，該疫苗組合物可包括任何能夠有效預(yù)防和/或治 療豬受豬肺炎支原體感染的疫苗，能夠用于豬支原體肺炎疫苗組合物包括（但不限于）完 全或部分豬支原體肺炎細胞制劑、滅活或改良活體疫苗、亞單位疫苗。
[0009] 本發(fā)明所述的豬支原體肺炎疫苗組合物優(yōu)選為亞單位疫苗，所述"亞單位疫苗"包 含一個或多個豬肺炎支原體衍生的多肽或蛋白質(zhì)，或所述多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性片段， 或編碼所述一個或多個豬肺炎支原體衍生多肽或蛋白質(zhì)，或所述多肽或蛋白質(zhì)免疫原性片 段的一個或多個豬肺炎支原體基因或核酸，且所述基因或核酸能在豬體內(nèi)進行表達。豬肺 炎支原體多肽、蛋白質(zhì)、所述多肽和蛋白質(zhì)的免疫原性片段、或豬肺炎支原體基因或核酸可 用于本領(lǐng)域公知技術(shù)合成或重組制備。
[0010] 本發(fā)明所用術(shù)語"預(yù)防和/或治療"在涉及豬肺炎支原體感染時是指抑制豬肺炎 支原體細菌的復(fù)制、抑制豬肺炎支原體的傳播或防止豬肺炎支原體在其宿主體內(nèi)定居，以 及減輕豬肺炎支原體感染所之疾病或病癥的癥狀。若細菌荷載量減少、肺部感染減輕和/ 或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效果。
[0011] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0012] 本發(fā)明所用術(shù)語"P46蛋白"屬于Mhp的細胞膜表面抗原蛋白，引起早期免疫反 應(yīng)；該蛋白分子量達46kD，為含1257bp (編碼419AA)的ORFs (Open reading frames,即 開放閱讀框）；該蛋白種內(nèi)高度保守，且其基因序列中有3個編碼色氨酸（Trp)的密碼 -f· TGA(Futo S, Seto Y, Mitsuse S, et al. Molecular cloning of a46-kilodalton surface antigen (p46) gene from mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of egg codon usage for arginine, J Bacteriol, 1995, 177 (7) : 1915-1917) 〇
[0013] 優(yōu)選地，所述P46蛋白為SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4編碼的一種或兩種蛋白混合 物。
[0014] 所述P46蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3。
[0015] 本發(fā)明所用術(shù)語"NrdF蛋白"為NrdF全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段， 即 NrdF 全蛋白的 R2 亞基 C 端（Fagan PK, Djordjevic SP, Eamens GJ, et al. Molecular characterization of a ribonucleotide reductase(NrdF)gene fragment of Mycoplasma hyopneumoniae and assessment of the recombinant product as an experimental vaccine for enzootic pneumonia. Infection and immunity, 1996, 64:1060-1064) 〇
[0016] 優(yōu)選地，所述NrdF蛋白為SEQ ID No. 6編碼的蛋白。
[0017] 所述NrdF蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No. 5。
[0018] 本發(fā)明所用術(shù)語"佐劑"可包括鋁膠佐劑；皂苷（saponin)，如Quil A、 QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI_0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水 乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物 選出的化合物。
[0019] 本發(fā)明所用術(shù)語"乳劑"可尤其基于輕液體石錯油（^European Pharmacopea類 型）；因烯經(jīng)寡聚產(chǎn)生的類異戊二烯油（isoprenoidoil)，如角S燒（squalane)或角S烯 油（squalene oil),尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性燒基的酯，更尤其植物油、油酸乙 酯、丙二醇二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈 脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離 子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無水甘露醇油酸酯）、 脂肪族二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異 硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙 烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產(chǎn)品，特別是L121。參見Hunter等編寫的《The theory and practical application of adjuvants)) (Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell Μ 和 Newman Μ 編寫的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147頁描述的SPT乳劑及第183頁描述的MF59乳劑。
[0020] 本發(fā)明所用術(shù)語"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優(yōu)選為交聯(lián)的丙烯酸或甲基 丙烯酸聚合物，尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)，這些化合物已知被稱為 卡波姆（Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa, 1996, 8(2))。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可 參見美國專利US2909462,其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所 述化合物具有至少3個羥基，優(yōu)選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2 個碳原子的不飽和脂烴基（aliphatic radical)取代。優(yōu)選的基團是那些含有2-4個碳 原子的基團，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出 售，（BF Goodrich, Ohio, USA)特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯(lián)。這其中可提及卡波普974P、934P和971P，最優(yōu)選使用卡波普971P。
[0021] 本發(fā)明所用術(shù)語"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸 酐與乙烯的共聚物EMA (Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中 和至生理pH，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0022] 本發(fā)明所用術(shù)語"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、單憐醜脂質(zhì) A(monophosphoryl lipidA)、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0023] 優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐 劑系統(tǒng)、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱 腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選為Gel佐劑。
[0024] 更優(yōu)選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %。
[0025] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述疫苗組合物中的P46蛋白、NrdF蛋白串聯(lián)表達。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述疫苗組合物由P46蛋白、NrdF蛋白和獸醫(yī)學(xué)上 可接受的佐劑組成。
[0027] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還含有豬肺炎支原體全菌抗原。
[0028] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬肺炎支原體全菌抗原"是指包含至少一種對豬接種后誘導(dǎo)、刺 激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答的全菌抗原的任何組合物。所述豬肺炎支原體 全菌抗原是完整的豬肺炎支原體，不僅包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，還 包括滅活的、改良的活的或減毒的豬肺炎支原體，優(yōu)選為滅活形式，更優(yōu)選為豬肺炎支原體 HN0603株或J株。豬肺炎支原體全菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原，如：豬肺 炎支原體如勃林格殷格翰公司的[ngelvac? M. hyo、哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和 RespisureOne、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend MH、梅里亞動物保 健公司的豬克喘、國內(nèi)生產(chǎn)的168株活疫苗。
[0029] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述疫苗組合物由P46蛋白、NrdF蛋白、豬肺炎支原 體全菌抗原和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑組成。
[0030] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬肺炎支原體"與"Mhp"在本發(fā)明中可互換使用。
[0031] 本發(fā)明所用術(shù)語"開放閱讀框"或"0RF"是指編碼不含插入的終止密碼子的特定 Mhp蛋白質(zhì)所需的最小核苷酸序列。
[0032] 本發(fā)明所用縮略語為：AA，氨基酸；bp，堿基對；kD，千道爾頓。
[0033] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬圓環(huán)病毒抗原、豬 繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗 原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒 抗原中的一種或多種。優(yōu)選地，所述其他抗原為豬圓環(huán)病毒抗原。
[0034] 本發(fā)明又一目的在于提供所述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬支原體肺炎 的藥物中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0036] (1)所述疫苗組合物可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表 達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；
[0037] (2)所述疫苗組合物中多免疫原性蛋白片段的組合可誘導(dǎo)產(chǎn)生協(xié)同的免疫效果；
[0038] (3)所述疫苗組合物含多免疫原性蛋白及豬肺炎支原體全菌抗原時，比單獨使用 全菌疫苗免疫時，豬肺炎支原體全菌抗原的含量顯著降低。
[0039] 序列表中：
[0040] 序列1為P46蛋白的核苷酸序列；
[0041] 序列2為P46蛋白的氨基酸序列；
[0042] 序列3為P46蛋白的核苷酸序列；
[0043] 序列4為P46蛋白的氨基酸序列；
[0044] 序列5為NrdF蛋白的核苷酸序列；
[0045] 序列6為NrdF蛋白的氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0047] 本發(fā)明實施例中所用的豬肺炎支原體P46蛋白、NrdF蛋白的序列，來源于已報道 的國際標準株J株，在NCBI中的登錄號為AE017243. 1。
[0048] 本發(fā)明實施例中，以大腸桿菌表達載體為例進行表達，通過基因工程手段獲得豬 肺炎支原體P46蛋白、NrdF蛋白，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限 定。
[0049] 本發(fā)明實施例以Montanide?Gel01 (法國SEPPIC公司）作為佐劑，并以體積比為 10 %的佐劑，制備豬支原體肺炎疫苗組合物為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情況 下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0050] 本發(fā)明實施例中所采用豬肺炎支原體HN0613株，保藏號為CCTCCNO.M2012230,保 藏日期為2012年6月13日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該毒株已經(jīng)在專利申請 CN103083655A 中公開。
[0051] 本發(fā)明實施例中所采用的攻毒毒株為豬肺炎支原體CVCC354株，該毒株的保藏號 為CVCC354,保藏單位為國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
[0052] 本發(fā)明實施例中肺病變指數(shù)采用28分法進行評判。所述28分法是根據(jù)豬支原體 肺炎的典型肺部眼觀病變，對發(fā)病程度進行量化判定，包括肺尖葉、心葉、膈葉、中間葉出現(xiàn) 的實質(zhì)樣病變，如"肉樣變"、"胰樣變"。肺炎病變評分標準為：2個尖葉、2個心葉、2個膈 葉、1個中間葉共計7個肺葉，每個肺葉滿分為4分，共計28分。根據(jù)發(fā)生實質(zhì)病變的肺葉 面積所占該葉的比例，分別對每個肺葉進行打分。無肺炎病變記為〇分；病變面積比例為 1% -25%，記為1分；病變面積比例26% -50%，記為2分；病變面積比例為51% -75%，記 為3分；病變面積比例為76% -100%，記為4分。如肺葉正反兩面均有病變，以病變面積大 的一面進行記分。各個肺葉打分總和即為該發(fā)病株的肺炎病變得分。分別對免疫組豬和對 照組豬進行記分后，按照以下公式計算免疫組豬的肺葉病變減少率：
[0053] b*.炎病奪a轉(zhuǎn)....攻毐對照組_炎病變τ均得分-免疫豬肺炎病變τ均得分H 攻毒對照組_炎病變f均得分
[0054] 本發(fā)明實施例統(tǒng)計分析方法為：統(tǒng)計7個肺葉的肺病變指數(shù)，確定病變程度。用 SPSS計算機軟件進行AN0VA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。
[0055] 本發(fā)明中所用的pH7. 2PBS液配方為：1000mL蒸餾水中加入NaC19g、 Na2HP04 · 12H206g、NaH2P04 · 2H200. 4g，本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集 團。
[0056] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的實驗方法，若無特殊說 明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0057] 實施例1豬肺炎支原體蛋白的表達、鑒定與純化
[0058] 1. 1P46重組載體的構(gòu)建及蛋白的表達、鑒定與純化
[0059] 根據(jù)NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的豬肺炎支原體J株（登 錄號：AE017243. 1)中的 P46 蛋白核苷酸序列（見 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3)，用 Primer Premier5軟件設(shè)計P46蛋白的引物及定點突變用引物序列，詳情見表1。
[0060] 表1P46蛋白引物序列表
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬支原體肺炎疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物含有P46蛋白、NrdF蛋 白和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述P46蛋白為SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4編碼的一種或兩種蛋白混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述NrdF蛋白為SEQ ID No. 6編 碼的蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物中的P46 蛋白、NrdF蛋白串聯(lián)表達。
5. -種豬支原體肺炎疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物由P46蛋白、NrdF蛋白 和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還含有 豬肺炎支原體全菌抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂 苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸 酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰 脂質(zhì)A、AVridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或 Gel佐劑中的一種或幾種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑為Gel佐劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括其 他抗原，所述其他抗原包括豬圓環(huán)病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌 抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽 狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗 原為豬圓環(huán)病毒抗原。
10. 權(quán)利要求1-9任一項所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬支原體肺炎的藥 物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/00GK104248753SQ201410204020
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 夏力亮, 廖永洪, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司