Loc401296基因及其在調(diào)控細胞周期和細胞生長中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開LOC401296基因及其在調(diào)控細胞周期和細胞生長中的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)假想基因LOC401296基因在多種細胞系廣泛表達。下調(diào)該基因表達后細胞生長受到明顯抑制、凋亡增加、出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯，進一步研究證明LOC401296基因參與細胞有絲分裂進程和紡錘體的形成，是一種新的細胞周期調(diào)控分子。本發(fā)明成果為后續(xù)功能研究提供奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】L0C401296基因及其在調(diào)控細胞周期和細胞生長中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種L0C401296基因及相應(yīng)的蛋白在調(diào)節(jié)細胞周期、控制細胞生長等方面的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]細胞周期是進行連續(xù)分裂的細胞完成一次分裂開始至下一次分裂完成時為止的一段時期，被認為是細胞完整的生命過程，是維持細胞生長、增殖的基本生物學事件。細胞周期是一個連續(xù)變化過程，根據(jù)研究的需要被人為劃分為間期和分裂期，間期包括Gl期、S期、G2期，分裂期指M期，另外，停止分裂的細胞被視為處于周期靜止的GO期。其中，M期指染色體開始凝集濃縮、核膜崩解、遺傳物質(zhì)重新分配、一個母細胞分裂形成兩個子細胞的一段時間，是細胞的“分娩”階段。細胞周期過程，尤其是有絲分裂期在細胞生長、凋亡發(fā)生、腫瘤生長等生物學過程發(fā)揮重要作用，這些生物學過程受到多種基因的調(diào)控。
[0003]L0C401296是大規(guī)?；蚪M測序中發(fā)現(xiàn)的一個假想基因，該基因編碼全長194個氨基酸的假想蛋白，目前對該基因未有任何功能報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，L0C401296基因在多種細胞系中廣泛表達，采用siRNA方法下調(diào)L0C401296表達可以促使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，引起細胞發(fā)生有絲分裂異常，誘導細胞凋亡。進一步分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)L0C401296基因表達可以引起紡錘體形成異常，抑制HeLa、A549、MCF-7等多種細胞生長。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種調(diào)控細胞周期的基因:L0C401296基因。L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白可用于調(diào)控細胞增殖和凋亡的速度、調(diào)節(jié)細胞周期、制備抗癌藥物、篩選鑒定抗癌藥物。
[0005]本發(fā)明中的L0C401296基因?qū)?yīng)的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。所述L0C401296基因編碼的蛋白質(zhì)的氣基酸序列如SEQ ID N0.6所不。
[0006]本發(fā)明中的“抑制劑”可以是蛋白、RNA或小分子化合物等。優(yōu)選地，抑制劑是一種蛋白，更優(yōu)選地，抑制劑是一種抗體，該抗體能夠結(jié)合L0C401296基因編碼蛋白質(zhì)，從而抑制L0C401296基因和/或它對應(yīng)的mRNA和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，抑制劑是一種RNA，可以是干擾性RNA分子，所述干擾性RNA分子可以是雙鏈RNA，例如siRNA (shortinterfering RNA)、miRNA (microinterfering RNA)等，或者單鏈 RNA,例如 shRNA (shorthairpinRNA)，它們能通過RNA干擾作用引起L0C401296靶基因mRNA的降解(例如siRNA或miRNA的情形)或者能夠形成具有這種功能的分子(例如shRNA的情形)。更優(yōu)選地，抑制劑是一種siRNA，所述siRNA的兩條鏈的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
[0007]本發(fā)明中的癌癥為包括但不限于卵巢癌、胰腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、黑素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、子宮頸癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織瘤、Wilm氏瘤、星細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、骨肉瘤、腎癌、或頭頸癌。優(yōu)選地，所述癌癥是子宮頸癌、乳腺癌、肺癌。
[0008]本發(fā)明提供了一種調(diào)控細胞周期的方法，是通過調(diào)控L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
[0009]本發(fā)明還提供一種調(diào)控細胞增殖的方法，是通過調(diào)控L0C401296基因的表達或調(diào)控L0C401296基因?qū)?yīng)mRNA的表達或調(diào)控L0C401296編碼的蛋白的表達量和活性，從而調(diào)控細胞增殖。進一步，本發(fā)明提供了一種抑制細胞增殖的方法，其特征在于，是通過抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性，從而抑制細胞增殖。
[0010]本發(fā)明還提供一種抑制細胞凋亡的方法，是通過表達或上調(diào)L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白活性，從而抑制細胞凋亡。
[0011]本發(fā)明還提供了一種誘導細胞凋亡的方法，是通過抑制劑抑制L0C401296基因的表達或抑制L0C401296基因?qū)?yīng)mRNA的表達或抑制L0C401296編碼的蛋白的表達量和活性。
[0012]本發(fā)明還提供了一種鑒定、篩選抗癌藥物的方法，是利用L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白篩選能夠抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白活性的物質(zhì)。優(yōu)選地，將將待測試劑與細胞接觸，進一步檢測L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白，與對照細胞相比，L0C401296基因表達水平降低或其編碼的蛋白活性降低時，指示待測試劑為抗癌或抗腫瘤藥物。
[0013]本發(fā)明還提供了一種制備抗癌藥物的方法，是采用抑制劑來制備抗癌或抗腫瘤藥物，該抑制劑抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白。
[0014]本發(fā)明還提供了一種L0C401296基因和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在抑制細胞凋亡中的應(yīng)用，優(yōu)選地，通過上調(diào)L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白活性，從而抑制細胞凋亡。
[0015]本發(fā)明還提供了一種L0C401296基因和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在鑒定和/或篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，是利用L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白篩選能夠抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白活性的物質(zhì)。優(yōu)選地，將將待測試劑與細胞接觸，進一步檢測L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白，與對照細胞相比，L0C401296基因表達水平降低或其編碼的蛋白活性降低時，指示待測試劑為抗癌或抗腫瘤藥物。
[0016]本發(fā)明還提供了一種L0C401296基因和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在調(diào)節(jié)細胞周期中的應(yīng)用，是通過調(diào)控L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
[0017]本發(fā)明還提供了一種抑制劑在促進細胞凋亡中的應(yīng)用，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
[0018]本發(fā)明還提供了一種抑制劑在抑制細胞增殖中的應(yīng)用，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
[0019]本發(fā)明還提供了一種抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
[0020]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物可以用于治療癌癥或腫瘤，該藥物組合物可以用于促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，所述的藥物組合物包含一種抑制劑，該抑制劑抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白。該藥物組合物還可以進一步包含其他物質(zhì)，優(yōu)選地，可以包含藥學上可接受的載體、賦形劑，可以包含其他抗腫瘤藥物、具有腫瘤靶向功能的配體等。
[0021]本發(fā)明又提供了一種預防、治療或緩解L0C401296基因相關(guān)疾病或病癥、例如腫瘤的方法，其包括對有此需要的個體施用一種抑制劑，該抑制劑抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白。優(yōu)選地，向有此需要的個體施用本發(fā)明的一種或多種干擾性RNA、藥物組合物。
[0022]本發(fā)明對功能未知基因L0C401296進行研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)L0C401296基因在多種細胞系(HEK293、U937、Hela、Lo2、!fepG2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7 等細胞)廣泛表達。抑制L0C401296基因表達可引起HeLa、A549、MCF-7腫瘤細胞生長抑制，這意味著能夠抑制L0C401296基因表達的物質(zhì)均有可能具有抑制腫瘤細胞生長的作用，L0C401296基因可作為篩選抗腫瘤藥物的靶點分子。下調(diào)該基因表達后細胞生長受到明顯抑制、凋亡增加、出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯，進一步研究證明L0C401296基因細胞有絲分裂進程和紡錘體形成過程，是一種新的細胞周期調(diào)控分子。本發(fā)明成果為后續(xù)功能研究提供奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為L0C401296mRNA在不同細胞系中的表達情況。
[0024]圖2為靶向L0C401296的siRNA對L0C401296mRNA和蛋白表達的抑制作用。
[0025]圖3為下調(diào)L0C401296對HEK293細胞形態(tài)影響。
[0026]圖4為回轉(zhuǎn)L0C401296表達挽救細胞形態(tài)改變。
[0027]圖5為下調(diào)L0C401296表達對多種細胞生長的影響。(siRNA_NC代表轉(zhuǎn)染siRNA-NC 對照組；siRNA-L0C401296 代表轉(zhuǎn)染 siRNA_2# 的 L0C401296 表達下調(diào)組)。
[0028]圖6為下調(diào)L0C401296表達對細胞凋亡的影響。(A: siRNA_2#轉(zhuǎn)染HEK293細胞后2天、3天，檢測細胞凋亡及統(tǒng)計分析；B:siRNA-2#轉(zhuǎn)染Hela細胞后2天、3天，檢測細胞凋亡及統(tǒng)計分析)。
[0029]圖7為下調(diào)L0C401296對HEK293和HeLa細胞周期分布影響。
[0030]圖8為下調(diào)L0C401296對HeLa細胞有絲分裂阻滯的影響。
[0031]圖9為回轉(zhuǎn)L0C401296表達挽救HeLa細胞有絲分裂阻滯。
[0032]圖10為下調(diào)L0C401296對HeLa細胞有絲分裂進程的影響。
[0033]圖11為下調(diào)L0C401296對HeLa細胞紡錘體形成的影響。

【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。如果無特殊說明，本發(fā)明所用儀器、試劑和材料均可通過常規(guī)途徑或手段獲取。
[0035] 實施例1L0C401296基因的獲得
[0036]提取人外周血總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取外周血cDNA。根據(jù)NCBI提供的L0C401296基因(GenBank:BC132760.1)對應(yīng)的cDNA全長序列設(shè)計引物(上游引物5 ‘a(chǎn)tggactggggaggagg3’和下游引物 5 ‘tcagaaagtgcccgattccaag3’)。采用此引物對，以外周血cDNA為模板進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物連接到T載體，經(jīng)測序后與NCBI提供的序列進行比對，結(jié)果表明我們獲取L0C401296基因的全長cDNA序列。
[0037]實施例2L0C401296基因在多種細胞中表達
[0038]采用常規(guī)方法培養(yǎng)HEK293、U937、Hela、Lo2、HepG2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7細胞。待細胞處于指數(shù)生長期分別收集細胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取上述細胞的cDNA。以上述 cDNA 為模板,米用 L0C401296 的引物對(上游:5‘a(chǎn)cctgctctggggttgccat3’，下游:5 ‘a(chǎn)cgtagccttgctgggtgtg3’ )進行 PCR 擴增，分析 L0C401296 基因的 mRNA 在上述細胞中的表達情況。結(jié)果表明在 HEK293、U937、Hela、Lo2、H印G2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7細胞中均檢測到L0C401296基因的mRNA表達，表明L0C401296是一個廣泛表達的基因(圖1)。
[0039]實施例3L0C401296特異性siRNA抑制L0C401296的mRNA和蛋白表達
[0040]L0C401296特異性siRNA序列(siRNA-1#和siRNA-2#)和用于對照組的隨機siRNA序列(siRNA-NC)如表1所示。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將siRNA分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，siRNA終濃度為ΙΟΟηΜ。轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞，分別提取總RNA和總蛋白質(zhì)，進行RT-PCR和western檢測，分析siRNA序列對L0C401296表達的抑制作用。如圖2所示，與siRNA-NC相比，siRNA_l#和siRNA_2#均能有效抑制L0C401296的mRNA和蛋白的表達。
[0041]表1siRNA 序列

【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控細胞周期的基因，其特征在于，為L0C401296基因，所述L0C401296基因?qū)?yīng)的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種調(diào)控細胞周期的方法，其特征在于，是通過調(diào)控L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性，從而調(diào)控細胞周期。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，通過抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性，從而引起細胞周期阻滯。
4.一種抑制細胞凋亡的方法，其特征在于，是通過提高L0C401296基因編碼的蛋白的表達量和活性，抑制細胞凋亡。
5.一種誘導細胞凋亡的方法，其特征在于，是通過抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性，從而誘導細胞凋亡。
6.一種抑制細胞增殖的方法，其特征在于，是通過抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性，從而抑制細胞增殖。
7.一種制備治療癌癥藥物的方法，其特征在于，是采用抑制劑制備治療癌癥藥物，所述抑制劑抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的癌癥為包括選自卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤 、視網(wǎng)膜母細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、子宮頸癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織瘤、Wilm氏瘤、星細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、骨肉瘤、腎癌、或頭頸癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求3、5-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是蛋白質(zhì)或RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是抗體，抑制L0C401296基因和/或它對應(yīng)的mRNA和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述RNA是siRNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述siRNA的兩條鏈的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制劑與其他藥學上可接受的載體
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制劑與其他抗癌或抗腫瘤藥物聯(lián)合施用。
15.一種核酸分子和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在抑制細胞凋亡中的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸分子是L0C401296基因。
16.一種核酸分子和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在鑒定和/或篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸分子是L0C401296基因。
17.一種核酸分子和/或它對應(yīng)的mRNA序列和/或它對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在調(diào)節(jié)細胞周期中的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸分子是L0C401296基因。
18.—種抑制劑在促進細胞凋亡中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
19.一種抑制劑在抑制細胞增殖中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
20.一種抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制劑抑制L0C401296基因的表達或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑是蛋白質(zhì)或RNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的 應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是抗體，與L0C401296蛋白質(zhì)結(jié)合，并抑制其活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，所述RNA是siRNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述siRNA的兩條鏈的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
25.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑與其他藥學上可接受的載體結(jié)合。
26.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑與其他抗癌或抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
27.一種預防或治療癌癥的藥物，其特征在于，包含一種抑制劑，所述的抑制劑能夠抑制L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA的表達或其編碼的蛋白的表達量和活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物，其特征在于，所述抑制劑是蛋白質(zhì)或RNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是抗體，與L0C401296蛋白質(zhì)結(jié)合，并抑制其活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物，其特征在于，所述RNA是siRNA。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物，其特征在于，所述siRNA的兩條鏈的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包括其他藥學上可接受的載體。
33.一種鑒定篩選治療癌癥藥物的方法，其特征在于，是將待測試劑與細胞接觸，進一步檢測L0C401296基因或其對應(yīng)mRNA或其編碼的蛋白，與對照細胞相比，L0C401296基因表達水平降低或其編碼的蛋白活性降低時，指示待測試劑為抗癌或抗腫瘤藥物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的癌癥為包括選自卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、子宮頸癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織瘤、WiIm氏瘤、星細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、骨肉瘤、腎癌、或頭頸癌。
35.一種siRNA，其特征在于，siRNA的兩條鏈的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQID N0.3 所示，或如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 所示。
【文檔編號】A61K45/00GK104164438SQ201410211150
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】王治東, 沈麗萍, 陳虹, 張學清, 周平坤, 陳英 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所