Ⅱ型抑瘤素m受體（osmr）在腦卒中疾病中的功能和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Ⅱ型抑瘤素M受體（OSMR）在腦卒中疾病中的功能和應用，屬于基因的功能與應用領域。本發(fā)明以OSMR基因敲除小鼠和神經(jīng)特異性OSMR轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過大腦中動脈缺血再灌注損傷模擬腦卒中疾病模型，結果表明OSMR敲除小鼠腦梗死體積明顯增大，神經(jīng)功能明顯惡化，凋亡的神經(jīng)元細胞也較多，JAK2/STAT3信號通路明顯下調(diào)；而OSMR轉(zhuǎn)基因小鼠的梗死體積顯著減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，凋亡的神經(jīng)元細胞也減少，JAK2/STAT3信號通路明顯上調(diào)。因此，OSMR基因可作為藥物靶標，用于在篩選預防、緩解和/治療腦卒中的藥物；OSMR基因可作為基因治療中的靶基因，用于在設計和制備在預防、緩解和/治療腦卒中的藥物和/或生物學試劑，為腦卒中的治療提供了一條有效的新途徑。
【專利說明】II型抑瘤素 Μ受體（OSMR)在腦卒中疾病中的功能和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種II型抑瘤素 Μ受體（0SMR)在治 療腦卒中疾病中的應用，具體是在預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中應用。
【背景技術】
[0002] 腦卒中大體可分成兩大類：缺血性腦卒中，約占（70?80)% ;出血性腦卒中，約占 (20?30)%。缺血性腦卒中是由于血栓或栓子阻塞了腦大血管或其分支，導致的永久性或 暫時性腦組織缺血缺氧損傷，目前是全球第四大致死因素及第二大致殘因素，其發(fā)后數(shù)分 鐘至數(shù)小時內(nèi)即出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，對患者的生命和健康造成嚴重危害。
[0003] 腦卒中導致腦組織血供和能量供應降低，誘導一系列相互重疊的分子機制最終導 致腦細胞死亡：包括興奮性中毒、Ca 2+離子超載、氧化應激、炎癥、凋亡和梗死周邊區(qū)去極 化。這些事件在腦缺血再灌注后持續(xù)數(shù)分鐘、數(shù)小時或者數(shù)天不等，對神經(jīng)元細胞、膠質(zhì)細 胞和血管組份等產(chǎn)生不同程度的損傷。神經(jīng)元細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分，但其 高代謝率降低了對缺血缺氧環(huán)境耐受能力，因此較其他神經(jīng)血管元件組分更易受到損傷。 研究表明，神經(jīng)元保護策略可以在腦缺血損傷后較長時間內(nèi)改善大腦功能，減少神經(jīng)元細 胞損失。
[0004] 多數(shù)研究認為，恢復腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。盡管1996年起組 織纖溶酶原激活劑（tPA)即批準用于缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國藥監(jiān)局 (FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。自20世紀90年代以來，研究保護神經(jīng)和腦組織的治療策 略一直是腦卒中治療的熱點，這些策略不僅可以延長tPA的治療時間窗，也可以減輕缺血 再灌注誘導的腦組織損傷。多種神經(jīng)保護藥物已在動物實驗中取得了令人振奮的結果，但 是進入腦卒中3期臨床實驗后，絕大部分藥物均未取得預期效果，其首要失敗的原因之一 是大部分已知神經(jīng)保護機制作用于在卒中后4-6小時以內(nèi)，而臨床實踐中很難在如此短暫 的時間窗內(nèi)實施治療，因此進一步闡明卒中發(fā)生后較長一段時間內(nèi)促進或保護腦組織損傷 的分子機制對于研究有效的卒中治療靶點或者策略具有重要意義。
[0005] 0SMR是抑瘤素 M(OSM)的受體，是一種具有多種生物學活性的細胞因子。0SM屬于 白細胞介素 IL-6家族，能夠抑制腫瘤細胞。0SM作為一種多功能的細胞調(diào)節(jié)因子，可作用于 多種細胞，具有多種生物學活性，能調(diào)節(jié)基因活性、細胞存活、增殖和分化的潛在功能，在炎 癥反應、造血作用、肝臟發(fā)育以及免疫系統(tǒng)等方面展示出獨特的生物學活性，具有重要的生 物學作用；已有研究證實0SM是一種能夠在體內(nèi)、外抑制興奮性神經(jīng)損傷的神經(jīng)保護因子 (Oncostatin M is a neuroprotective cytokine that inhibits excitotoxic injury in vitro and in vivo，2006，Weiss TW et al.)，在神經(jīng)系統(tǒng)中起保護作用（Oncostatin M: foe or friend?，2003，Pelletier JP et al. )。0SM有兩種類型的受體，分別為 I 型 和II型0SM受體（0SMR)，I型0SMR與白血病抑制因子（LIF)受體（LIFR)相同，由gpl30 和一個LIF的結合亞單位構成的異源二聚體；II型0SMR由1個gpl30與1個OSMR0亞 單位（OSMRP)構成的異源二聚體(抑瘤素 Μ的研究進展，2008,胡志清)，OSMR0亞單位在 神經(jīng)元平滑肌上有表達。腦缺血再灌注腦損傷能釋放大量的炎性細胞因子，如白細胞介 素1 ( interleuk in_l, IL-1)、白細胞介素-6 ( interleuk in_6, IL-6 )、腫瘤壞死因 子-a ( tumor necrosis factor-, TNF-α)等，它們在缺血再灌注神經(jīng)細胞損傷中起著 重要的作用（Determental and beneficial effects of injury-induced in flammation and cytokine expression in the nervous system, 2002, Stroll G et al)〇 各種釋放 的細胞因子均須通過細胞因子受體超家族的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮效因，因此，OSMR很可 能在腦缺血損傷后改善大腦功能，減少神經(jīng)元細胞損失中扮演著重要角色。鑒于大腦和人 類的生命密切相關，缺血性腦卒中又是威脅人類健康，威脅人類生命的原因之一，研究0SMR 在缺血性腦卒中疾病中如何改善大腦功能，減少神經(jīng)元細胞損失，對于充分開發(fā)其在腦卒 中方面的臨床應用具有更加重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術的缺陷和不足，本發(fā)明的首要目的在于確定II型抑瘤素 Μ受 體（0SMR)的表達和缺血性腦卒中所致疾病的相互關系，提供一種II型0SMR用于預防、緩解 和/或治療缺血性腦卒中所致疾病的藥物中的新用途。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)： 本發(fā)明以0SMR基因敲除小鼠和神經(jīng)特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過大腦中 動脈缺血再灌注損傷模型，結果表明與野生型對照小鼠對比，0SMR基因敲除小鼠腦梗死體 積明顯增大，神經(jīng)功能明顯惡化，凋亡的神經(jīng)元細胞也較多，JAK2/STAT3信號通路的激活明 顯下調(diào)；而神經(jīng)特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠梗死體積明顯減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，凋亡的神 經(jīng)元細胞數(shù)量則顯著減少，JAK2/STAT3信號通路的激活明顯上調(diào)。這提示0SMR具有可顯 著改善腦卒中疾病的作用。針對0SMR的上述功能，0SMR可用于制備預防、緩解和/治療腦 卒中疾病的藥物。
[0008] 本發(fā)明人的研究證明了 ：在腦卒中模型中，0SMR促進激活JAK2/STAT3信號通路從 而保護神經(jīng)系統(tǒng)，特別是改善腦卒中疾病的作用。
[0009] 針對0SMR的上述功能，提供一種0SMR的應用，主要體現(xiàn)為0SMR在制備預防、緩解 和/或治療腦卒中疾病的藥物中應用。
[0010] 一種預防、緩解和/治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，包含0SMR。
[0011] 一種預防、緩解和/治療腦卒中疾病的藥物，包含0SMR。
[0012] 作為一種預防、緩解和/治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腦卒中疾病的藥物，0SMR蛋白可以 從兩個方面應用于臨床。一個方面是通過對0SMR蛋白添加某些能夠使其進入細胞的標簽 (如ΤΑΤ)，或者構建能夠過表達0SMR蛋白的載體(如缺陷型腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒)，然后利用 常規(guī)的藥物制備方法，采用藥用的賦型劑或載體將其制成針劑，而后注射到腦血管中，可以 提高腦部神經(jīng)細胞內(nèi)0SMR的水平，促進激活JAK2/STAT3信號通路，對腦部缺血產(chǎn)生保護作 用。另一個方面是根據(jù)本發(fā)明所證實的0SMR蛋白具有的新功能，對新型化合物進行篩選， 選擇能夠誘導細胞內(nèi)0SMR表達的化合物作為藥物，也可以起到保護腦缺血的作用。
[0013] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)0SMR基因的新功能，即0SMR能夠改善腦卒中疾病的作用。
[0014] (2)本發(fā)明針對0SMR在改善腦卒中疾病的作用，為制備治療腦卒中的藥物提供基 礎，可用于制備預防、緩解和/或治療腦卒中的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1是0SMR神經(jīng)特異性轉(zhuǎn)基因小鼠構建示意圖。
[0016] 圖2是WT和0SMR-K0小鼠 I/R術后的TTC染色、梗死體積統(tǒng)計及神經(jīng)功能評分統(tǒng) 計圖，結果顯示0SMR敲除顯著惡化腦梗死和神經(jīng)功能（* :p < 0. 05vs WT I/R組）。
[0017] A為I/R術后TTC染色結果圖； B為I/R術后大腦梗體積統(tǒng)計柱狀圖； C為I/R術后神經(jīng)功能評分統(tǒng)計柱狀圖。
[0018] 圖3是NTG和0SMR-TG小鼠 I/R術后的TTC染色、梗死體積統(tǒng)計及神經(jīng)功能評分統(tǒng) 計結果圖，結果顯示0SMR過表達顯著抑制腦梗死，保護神經(jīng)功能（*:p < 0. 05vs NTG I/R 組）。
[0019] A為I/R術后TTC染色結果圖； B為I/R術后大腦梗體積統(tǒng)計柱狀圖； C為I/R術后神經(jīng)功能評分統(tǒng)計柱狀圖。
[0020] 圖4是TUNEL染色檢測WT和0SMR-K0小鼠 I/R術后的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元 細胞凋亡情況，結果顯示0SMR敲除顯著促進神經(jīng)元細胞的凋亡。
[0021] 圖5是TUNEL染色檢測NTG和0SMR-TG小鼠 I/R術后的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元 細胞凋亡情況，結果顯示0SMR過表達顯著抑制神經(jīng)元細胞的凋亡。
[0022] 圖6是蛋白質(zhì)印跡法檢測WT和0SMR-K0小鼠 I/R術后的JAK2/STAT3信號通路蛋 白表達圖及定量統(tǒng)計柱狀圖，結果顯示0SMR敲除會抑制JAK2和STAT3的磷酸化激活水平； 其中"P-"代表磷酸化的激酶（JAK2和STAT3)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激 酶（JAK2 和 STAT3)，GAPDH 用作內(nèi)參（*:p < 0.05vs WT Sham 組，#:p < 0.05vs WT I/R 組）。
[0023] 圖7是蛋白質(zhì)印跡法檢測NTG和0SMR-TG小鼠 I/R術后的JAK2/STAT3信號通路 蛋白表達圖及定量統(tǒng)計柱狀圖，結果顯示0SMR過表達會促進JAK2和STAT3的磷酸化激活 水平；其中"P-"代表磷酸化的激酶（JAK2和STAT3)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化 的）激酶（JAK2 和 STAT3)，GAPDH 用作內(nèi)參（* :p < 0· 05vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05vs NTG I/R 組）。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0025] 實驗用動物及飼養(yǎng) 實驗動物：選用11-12周齡，雄性，體重在25-30g小鼠，背景C57BL/6的野生型小 鼠（WT，購自北京華阜康生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號：949431)、0SMR基因敲除小 鼠（0SMR-K0, C57BL/6J 背景，購買自 RIKEN BRC 公司（BRC 貨號：RBRC02711))、神經(jīng)特 異性 0SMR 轉(zhuǎn)基因小鼠（0SMR-TG，由 OSMR-flox 小鼠和 CaMKII a -Cre (購自 Jackson Laboratory，Stock No. 005359)小鼠雜交得到，OSMR-flox小鼠由武漢大學心血管病研 究所李紅良教授實驗室構建，OSMR-flox小鼠的構建過程如下文中所述）及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (NTG，同窩對照非轉(zhuǎn)基因小鼠)。
[0026] 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中 心。小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。飼養(yǎng)條件：室溫在22_24°C之間， 濕度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0027] 【實施例1】神經(jīng)特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠的構建 轉(zhuǎn)基因載體構建信息：用上游引物，即5 ' -GTGATTAATTAAGCCACCATGGCTTTCTCTGTGGT CCT-3 ' ；下游引物，5 ' -GTGATTAATTAATTACTGTTCACCTTGGCCTA-3 '，擴增小鼠 0SMR 全長基 因（NCBI, Gene ID: 18414，ΧΜ_006519974·1)，把 cDNA 插入 pCAG-CAT-LacZ 載體，這個 載體包含一個CMV增強子和一個雞的β-actin基因（CAG，chicken β-actin gene)的啟 動子，并且連接到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT, chloramphenicol acetyltransferase)， ΙοχΡ位點位于CAT兩側(cè)，神經(jīng)細胞0SMR的表達由CAG啟動子驅(qū)動得到（圖1)。將構建 的pCAG-OSMR-CAT-LacZ載體通過顯微注射構造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到0SMR -floxed小鼠。神經(jīng)特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠通過0SMR -flox小鼠和CaMKII a -Cre小鼠雜 交繁殖得到。
[0028] 【實施例2】小鼠腦梗死模型（I/R)獲得 1.實驗動物分組：野生型小鼠、0SMR基因敲除小鼠、神經(jīng)特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠及非 轉(zhuǎn)基因小鼠，通過大腦中動脈缺血再灌注建立腦梗死模型（I/R)及假手術組（Sham)。隨機 分為8組：野生型小鼠假手術組（WT Sham)、0SMR基因敲除小鼠假手術組（K0 Sham)、野生 型小鼠 I/R手術組（WT I/R)、0SMR基因敲除小鼠 I/R手術組（K0 I/R)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手 術組（NTG Sham)及I/R手術組（NTG I/R)、神經(jīng)細胞特異性0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠假手術組（TG Sham)及 I/R 手術組（TG I/R)。
[0029] 2.腦梗死模型（I/R)手術米用 MCA0 (middle cerebral artery occlusion，大腦 中動脈閉塞）模型操作流程： (1) 抓取小鼠，使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術 剪迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘1次； (2) 在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結締組織。將 激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前?后方2_，左側(cè)5_的部位； (3) 將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸 總動脈（CCA)、頸外動脈（ECA)和頸內(nèi)動脈（ICA)。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA，在ECA遠 心端結扎和剪一小口，將線栓由剪口送入ICA，當線栓進入深度在9-llmm左右至血流下降 遇阻力停，整個過程必須維持小鼠的肛溫在37±0. 5°C ; (4) 從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時開始計時，45min后將線栓拔出，并將ECA 近心端結扎，迅速松開CCA處動脈夾（Sham組在從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時抽 出線栓)。注意觀察血流恢復情況，選擇血流下降75%以上，血流恢復達70%以上的小鼠納 入實驗； (5) 縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術結束后，將小鼠放在溫箱 中，箱溫維持在28°C，給水和飼料，分別在6小時、24h、72h取材。
[0030] 【實施例3】腦梗死模型（I/R)小鼠腦梗死體積測定 (1)分別在手術后24h，72h取材前進行神經(jīng)功能及行為學評分； 基于Berderson神經(jīng)功能評分改進方法（9分制）： 0分：無神經(jīng)受損的癥狀； 1分：提尾時對側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達患側(cè)前肢； 2分：提尾時對側(cè)肩膀內(nèi)收； 3分：平推：向?qū)?cè)推動時阻力下降； 4分：可自發(fā)的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎； 5分：自發(fā)運動時轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)； 6分：無自主運動，只在刺激時運動； 7分：無自主運動，刺激時也無運動； 8分：與腦缺血有關的死亡。
[0031 ] (2)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取腦； (3) 將取下的腦組織放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中潤洗，用紗布吸干PBS，將腦組織放入 1mm小鼠腦模，置于-20°C冰箱凍存； (4) 腦組織 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑（2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloricej, TTC)染色：從-20°C冰箱取出腦組織，立即切成1mm厚的切片，共切7片。將切片立即置于 10ml 2% TTC溶液中，37°C恒溫孵育lOmin。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白 色； (5) 用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片，大體拍照； (6) 腦梗體積計算（Image-Pro Plus 6.0軟件):梗死體積％ =(對側(cè)大腦半球體積-梗 死側(cè)未梗死體積）/(對側(cè)大腦半球體積X2) X 100% ; 總梗死體積為各自7張腦片結果數(shù)據(jù)之和。
[0032] TTC是脂溶性光敏感復合物，它是呼吸鏈中吡啶一核苷結構酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與 正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應，故不會產(chǎn)生 變化呈蒼白色。
[0033] 腦缺血再灌注損傷嚴重程度的評估指標主要包括大腦梗死體積和神經(jīng)功能評分， 這些指標均與缺血再灌注損傷嚴重程度正相關。0SMR基因敲除小鼠的TTC染色結果如圖 2A所示，經(jīng)過I/R缺血45min再灌注24小時后0SMR-K0小鼠梗死體積（圖2B)比野生型小 鼠明顯嚴重；且這種惡化作用在I/R術后72小時仍然持續(xù)，而神經(jīng)功能評分（圖2C)在I/R 術后24小時、72小時均增加，說明神經(jīng)功能惡化嚴重，表明0SMR基因的缺失可惡化缺血再 灌注損傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死和神經(jīng)系統(tǒng)。通過0SMR過表達小鼠的TTC染色結 果（圖3 )，我們發(fā)現(xiàn)0SMR過表達小鼠的梗死體積明顯減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，說明0SMR可 顯著改善大腦缺血再灌注損傷引起的腦卒中的梗死和神經(jīng)系統(tǒng)。
[0034] 【實施例4】腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡情況測定 1.腦組織冰凍切片制備 1) 實驗小鼠在術后24小時按50mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉； 2) 開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺入左心室，剪開右心耳； 3) 用0. lmol/L PBS(pH7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變蒼白后，用4%多聚甲醛灌流 15分鐘； 4 )開顱迅速取出小鼠大腦，室溫4%多聚甲醛后固定6-8小時； 5) 切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先后兩個部分，用先前的固定液 再固定15min ; 6) 隨后浸沒于含30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中，4°C冰箱沉底過夜； 7) 30%蔗糖與OCT按1:1混合后，倒適量到包埋框中，將前一步的組織取出，在紗布 上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會兒，再將其轉(zhuǎn)入到先已加入2滴OCT的另一個包埋框 中，調(diào)整組織的位置，使其正好位于包埋框的正中； 8) 將盛組織的包埋框，移入干冰中，盡量使其處于水平位，稍待一會兒后，繼續(xù)加入 OCT，浸沒組織一定的高度，待OCT凝固后，將其儲存于-80°C的冰箱中； 9) 用冰凍切片機切5um的冰凍切片備用。
[0035] 2. TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。
[0036] 用TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。（TUNEL試劑盒：ApopTag? Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)): 1) 將冰切組織切片置于（pH 7. 4) 1%的多聚甲醛中，室溫固定水解10分鐘； 2) PBS洗兩次，每次5分鐘； 3) 置于預冷的乙醇：乙酸（2 :1)溶液中，-20°C浸泡5分鐘，去除多余液體，但注意不要 干燥； 4) PBS洗兩次，每次5分鐘； 5) 濾紙吸去多余液體，立即在切片上按75 μ L/5cm2直接加入平衡緩沖液，室溫孵育 1-5 min ； 6) 濾紙吸去多余液體，立即在切片上按55 μ L/5cm2直接加入TdT酶反應液，置于避光 保濕盒中作用1小時（陰性對照加入不含TdT酶的反應液）； 7) 將切片置于終止/洗滌緩沖液中，輕輕搖動15秒，室溫孵育10分鐘；此時準備適量 抗地高辛抗體，預熱至室溫，注意避光； 8) PBS洗三次，每次1分鐘； 9) 濾紙小心吸去多余液體，直接在切片上按65 μ L/5cm2加入抗地高辛抗體，室溫下 于避光保溫濕盒中作用1小時； 10) PBS洗四次，每次2分鐘； 11) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen，S36939)封片； 12) 在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)凋亡神經(jīng)元細胞。
[0037] 通過檢測0SMR-K0小鼠和野生型小鼠 I/R術后24小時腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元 細胞凋亡情況(見圖4)，發(fā)現(xiàn)0SMR-K0組小鼠的神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量明顯比WT組小鼠多，這 表明0SMR基因缺失使得神經(jīng)元細胞的凋亡數(shù)量增多。而0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織梗死周 邊區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量則顯著減少(見圖5)，這表明0SMR過表達可以保護神經(jīng)元細胞。
[0038] 【實施例5】蛋白質(zhì)印跡法（Western blot)檢測JAK2/STAT3信號通路。
[0039] 1.腦組織樣本制備 實驗小鼠在術后6小時按50mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉； 開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺如左心室，在右心耳上做一小切口，以便引流； 用〇. 55號頭皮針，連一次性輸液器，插入左心室，灌注冰PBS緩沖液(約20mL)，直到右 心耳中流出清澈的灌流液，停止灌流； 開顱迅速取出小鼠大腦，將取下的腦組織先用冰PBS涮洗，再放入冰的培養(yǎng)皿中，迅速 用刀片取出嗅球和小腦，再將左右腦分開，將左腦前后各去除1mm (整個操作要在冰盒上進 行)，將剩下的組織裝入做好標記的EP管，置于液氮罐中，最后置于-80°C冰箱保存。
[0040] 2.蛋白提取 按配方（lmL 裂解液 720yLRIPA, 20yLPMSF, lOOyLComplete, lOOyLPhosstop， 50 μ LNaF, 10uLNa3V04)配制好裂解液。
[0041] 于_80°C取出所需樣本，放入干冰中。每個EP管放入3-4顆鋼珠，放入干冰中預 冷。用眼科剪剪下所需樣本放入對應的EP管，稱重并記錄每個樣本的重量，加入裂解液到 樣品中。
[0042] -80°C預冷研磨罐5_8min后將樣品對稱放置于研磨罐中，放入研磨儀。研磨參數(shù) 設置為 30Hz/S，90s。
[0043] 研磨結束后，取出鋼珠置于無水乙醇中，樣品于冰上放置10min，。
[0044] 超聲裂解儀裂解樣本5KHz/次，每次ls，間隔ls，重復10-15次。為防止產(chǎn)生氣泡， 裂解時探頭深入液面下2/3。超聲完成后冰上放置10min。
[0045] 樣本放入4°C預冷的離心機中離心。參數(shù)設置為4°C，12000rpm，30min。
[0046] 準確吸取上清液并定量，記錄每個樣本的裂解體積。
[0047] 3.蛋白定量（BCA Protein Assay Kit 定量） 準備工作液：按A液：B液=50:1配制工作液，所需A液的體積為（N+6) *400 μ L。B液 的體積為A液1/50。N為被檢測樣品數(shù)目。A液和B混勻，低溫放置備用。
[0048] 準備被檢測樣品：將提取的樣品取出4 μ L加入到116 μ L的ddH20中震蕩混勻。
[0049] 準備標準品，在500 μ LEP管中，對標準品進行稀釋 吸取稀釋好的標準品或被測樣品25 μ L加入到96孔板中，每份樣品垂直做2個復孔。 加入200 μ L的工作液。
[0050] 于37°C溫箱中孵育30min。
[0051] 取出96孔板置于酶標儀中檢測吸光度(波長562nm)，并根據(jù)標準曲線計算出樣品 濃度(酶標儀自帶程序)。
[0052] 根據(jù)所測濃度加入相應量的10XDTT，裂解液和4XLB將總蛋白校準到同一濃度。
[0053] 將蛋白樣品混合均勻后于12000rpm/min瞬離，分裝樣品，72°C水浴10min變性(每 2-3min翻動一次)，置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0054] 4.蛋白檢測 將蛋白樣品按50ug/樣品的上樣量依次上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，點樣完成后開始 恒壓120V電泳。
[0055] 將夾板左右攤開，負極向右。黑色的一邊為負極，白色為正極。兩邊各鋪上預先用 轉(zhuǎn)膜緩沖液（3. 03g Trisbase，14. 4g甘氨酸，200mL甲醇，800mL雙蒸水)浸濕1-2張海綿和 4_5張濾紙。
[0056] 待電泳完成后，取出凝膠板中的凝膠，用轉(zhuǎn)膜液潤濕凝膠，將PVDF膜覆蓋其上，剪 缺口的地方應與大分子量Marker的一角對齊，夾上夾板。
[0057] 將夾板放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜槽的負極(黑色面）應與夾板的負極(黑色面）放在一 起，灌滿轉(zhuǎn)膜液以淹沒凝膠。
[0058] 轉(zhuǎn)膜槽接通電源，恒流約0. 2A，開始電泳轉(zhuǎn)移，起始電壓應在10(Tl30V為宜，轉(zhuǎn)移 1. 5h。
[0059] 轉(zhuǎn)移結束后，將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放置到預先準備好的TBS中，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜 液后置于5%的脫脂奶粉封閉液（5g脫脂奶粉溶解于100mL的TBS中）中封閉，在脫色搖床 上緩慢搖動，室溫封閉2-4h。
[0060] 封閉結束后用TBST洗滌PVDF膜3次，每次5min，封口機將PVDF膜封入雜交袋中， 加上適量一抗，趕盡起泡后封口，將雜交袋放入4°C搖床上緩慢搖動，過夜。
[0061] 將PVDF膜取出用TBST洗滌3次，每次5分鐘?；厥找豢?。
[0062] 將膜放入對應的加有二抗的二抗稀釋液（5%的脫脂奶粉：5g脫脂奶粉溶于 lOOmLTBST)中，避光孵育lh。8ml二抗稀釋液中加入0. 6uL的二抗。
[0063] 二抗孵育結束后用TBST洗滌3次，每次5min。將膜置于Odyssey熒光檢測儀中， 檢測目的條帶。保存并分析結果。
[0064] 利用蛋白質(zhì)印跡法檢測JAK2/STAT3信號通路的變化，結果見圖6。蛋白表達及定 量分析結果表明，磷酸化JAK2 (p-JAK2)和磷酸化STAT3 (P-STAT3)在I/R術后6小時的 蛋白表達量要高于Sham組，說明在I/R模型后，JAK2/STAT3信號通路被激活；0SMR-K0組小 鼠的P-JAK2和P-STAT3的蛋白表達量要低于WT組，而各組總的JAK2和STAT3蛋白表達量 則無顯著差異。這表明0SMR基因敲除后，小鼠腦組織中JAK2/STAT3信號通路下調(diào)。0SMR 轉(zhuǎn)基因小鼠在I/R后，P-JAK2和P-STAT3的蛋白表達量要高于NTG組(見圖7)，說明0SMR 可通過上調(diào)P-JAK2和P-STAT3的蛋白表達水平，從而減少腦梗死，保護神經(jīng)功能。
[0065] 我們的研究成果表明，在大腦中動脈缺血再灌注損傷引起的腦卒中疾病模型中， 0SMR基因敲除后的小鼠的梗死體積顯著增加，神經(jīng)功能明顯惡化，凋亡的神經(jīng)元細胞也較 多，JAK2/STAT3信號通路的激活明顯被抑制；而0SMR轉(zhuǎn)基因小鼠的梗死體積顯著減少，神 經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，凋亡的神經(jīng)元細胞也減少，JAK2/STAT3信號通路的激活更顯著。這些結 果說明0SMR能通過促進JAK2/STAT3信號通路的激活改善腦卒中，保護神經(jīng)系統(tǒng)，0SMR在 腦卒中疾病模型中有著重要的保護作用。
[〇〇66] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。 SEQUENCE LISTING 〈110>武漢大學 <120> II型抑瘤素 M受體（OSMR)在腦卒中疾病中的功能和應用 <130> 1 <160> 2 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> 〈223> 0SMR上游引物 <400> 1 gtgattaatt aagccaccat ggctttctct gtggtcct 38 <210> 2 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉Artificial 〈220〉 〈223〉OSMR下游引物 〈400> 2 gtgattaatt aattactgtt caccttggcc ta 32
【權利要求】
1. II型抑瘤素 Μ受體（OSMR)在制備預防、緩解和/或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中應 用。
2. -種預防、緩解和/或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，其特征在于：包含II型抑瘤素 Μ受 體（0SMR)。 3. II型抑瘤素 Μ受體（0SMR)在制備預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中應用。
4. 一種預防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物，其特征在于：包含II型抑瘤素 Μ受體 (0SMR)。
【文檔編號】A61K38/19GK104083754SQ201410322444
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權日:2014年7月8日
【發(fā)明者】李紅良, 郭森, 盧燕云, 鄭安康, 李明昌 申請人:武漢大學