表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的鴨瘟病毒重組疫苗株rDEVTK-EGFP及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株rDEVTK-EGFP及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，其中所述疫苗株rDEVTK-EGFP的微生物保藏號(hào)是：CGMCC No.9456。本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和sCMV啟動(dòng)子序列的基因片段sCMV-EGFP插入到鴨瘟病毒的TK基因區(qū)中，構(gòu)建獲得在TK基因相應(yīng)位置插入sCMV-EGFP表達(dá)盒的重組EGFP鴨瘟病毒，該重組病毒穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因。本發(fā)明還涉及構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)其他禽類病原外源基因的重組鴨瘟病毒疫苗株的方法，以及重組鴨瘟病毒疫苗株在制備預(yù)防鴨瘟和其他禽類傳染病的疫苗中的應(yīng)用。
CGMCC No.9456
2014.07.08
【專利說明】表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的鴨瘟病毒重組疫苗株 rDEVTK-EGFP及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組病毒疫苗株，尤其涉及一種能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因的重組鴨瘟病 毒株rDEV TK-EGFP及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨瘟又稱鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE)，是由鴨瘟病毒（又稱鴨腸 炎病毒（Duck enteritis virus, DEV)引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類感染的一種急性、熱 性、接觸性傳染病。其主要特點(diǎn)是流行廣泛,傳播迅速,發(fā)病率及死亡率高,不同日齡的鴨均 易感，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病之一。
[0003] 鴨瘟病毒的自然感染僅限于雁形目的鴨科成員（鴨、鵝、天鵝等）。傳染源主要是 病鴨、病鵝、帶毒的家禽及野生水禽。水是本病的自然傳播媒介，吸血昆蟲可能是本病潛在 的傳播媒介。感染該病的康復(fù)禽有可能成為帶毒者，并周期性排毒。鴨瘟病毒與其它皰疹病 毒一樣，DEV的潛伏和激活都可以引起該病在家養(yǎng)和遷徙水禽中爆發(fā)。病毒的感染與品種、 年齡和性別無關(guān)，成年鴨感染率較幼鴨高。但近年來發(fā)現(xiàn)DEV的感染朝低齡化方向發(fā)展，且 鵝的感染率不斷增高，發(fā)病率和死亡率多在80 %以上。鴨瘟病毒只有一個(gè)血清型。免疫接種 是防治該病的最有效手段。目前國內(nèi)外預(yù)防鴨瘟使用較廣泛的是弱毒疫苗，此類疫苗具有 免疫效果好、免疫保護(hù)力產(chǎn)生快的特點(diǎn)，在高發(fā)季節(jié)來臨前給鴨群進(jìn)行免疫注射能有效預(yù) 防該病。當(dāng)疫情發(fā)生時(shí)，在開始初期應(yīng)當(dāng)立即對(duì)于鴨群中未出現(xiàn)癥狀的鴨進(jìn)行緊急免疫接 種，可以防止疫病的進(jìn)一步擴(kuò)散，對(duì)于控制疫情、降低經(jīng)濟(jì)損失具有顯著效果。然而，隨著畜 禽集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，單價(jià)疫苗已顯示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 多價(jià)聯(lián)合疫苗便成為養(yǎng)殖業(yè)最受歡迎的疫病防控產(chǎn)品，因而開展禽病多價(jià)聯(lián)合疫苗成為必 然選擇。
[0004] DEV為皰疹病毒，其基因組為雙股線性DNA，大小約為168Kb，由共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)區(qū) 域組成，包括長獨(dú)特區(qū)（UL)和短獨(dú)特區(qū)（US)。2009年Li等首次報(bào)道DEV VAC株的全基因 組序列，同年，Liu等報(bào)道了由DEV VAC株致弱株DEV Clone-03大多數(shù)ORF序列（Liu et al.，2009)。序列分析表明DEV VAC基因組的構(gòu)型為D型基因組（Li et al.，2009)，基因 組結(jié)構(gòu)為：UL-IRS-US-TRS。共包括78個(gè)開放讀碼框（ORF)，其中有65個(gè)ORF位于UL區(qū)， 11個(gè)ORF位于US區(qū)，另外2個(gè)ORF (ICP4和IE180)則分別位于IRS區(qū)和TRS區(qū)（Wu et al.，2012)。
[0005] 皰疹病毒基因組包含大量的復(fù)制非必需基因，包括TK、gC、gG、gK、USl、US2、US10、 UL41、UL42、US7和US8等。在相關(guān)研究中將外源基因插入或替代皰疹病毒的非必須基因， 構(gòu)建重組病毒疫苗，這被認(rèn)為是一種良好的重組活疫苗病毒載體，目前有關(guān)皰疹病毒作為 載體的報(bào)道包括偽狂犬病載體、傳染性喉氣管炎病毒載體、馬力克氏病毒載體以及火雞皰 疹病毒載體等。隨著鴨瘟病毒研究的不斷加深，以DEV為病毒活載體受到更加廣泛的關(guān)注， DEV作為載體的優(yōu)勢(shì)在于該病毒宿主范圍較窄，對(duì)雞、火雞、鴿和哺乳動(dòng)物均無致病性，不會(huì) 對(duì)非宿主動(dòng)物和人的健康安全造成影響。鴨瘟病毒可在非自然宿主如雞體內(nèi)一過性復(fù)制而 帶動(dòng)外源基因的表達(dá)，因此利用鴨瘟病毒作為載體表達(dá)雞源病原的保護(hù)性抗原，是開發(fā)DEV 病毒活載體疫苗的新思路，具有重要的應(yīng)用前景。目前，針對(duì)DEV病毒載體研究進(jìn)展順利， Wang利用BAC技術(shù)將H5N1亞型禽流感病毒HA基因插入至鴨瘟病毒gC基因中，成功構(gòu)建表 達(dá)表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒（Wang et al.，2011)。Liu等將H5N1 亞型禽流感病毒HA基因插入鴨瘟病毒UL41基因中以及US7與US8基因之間，構(gòu)建兩株表 達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒，免疫鴨群后均可以對(duì)DEV和H5N1亞型禽 流感病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)（Liu et al.，2011)。但是，目前利用DEV非必須基因 TK位點(diǎn)開展 外源基因的重組病毒構(gòu)建和應(yīng)用均未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株的方法；
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種有所述方法制備得到的表達(dá)增強(qiáng)型 綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株；
[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供所述鴨瘟病毒重組疫苗株在制備預(yù)防鴨 瘟的重組鴨瘟疫苗中的應(yīng)用。以及所述的鴨瘟重組病毒株在制備預(yù)防鴨瘟以及其它禽類傳 染病的重組疫苗中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明的一種構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的方 法，其特征在于在TK基因3'端HpaI位點(diǎn)插入了包含SCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)基因序列的基因片段sCMV-EGFP，構(gòu)建獲得在TK基因相應(yīng)位置插入sCMV-EGFP表達(dá) 盒的鴨瘟重組病毒株。
[0011] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒 株的方法包括以下步驟：
[0012] (I)PCR擴(kuò)增獲得鴨瘟病毒基因組TK及其兩側(cè)的側(cè)翼序列，并將可供病毒識(shí)別的 真核啟動(dòng)子sCMV啟動(dòng)子以及EGFP基因插入TK基因的3'端HpaI位點(diǎn)，構(gòu)建獲得含有EGFP 表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)移載體，命名為pTK-EGFP。
[0013] (2)提取鴨瘟病毒的完整基因組DNA ;
[0014] (3)利用步驟⑴中獲得的重組轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP與步驟⑵中獲得的鴨瘟病毒 基因組DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，通過熒光顯微鏡篩選表達(dá)綠色熒光蛋白的病 毒，再經(jīng)過病毒蝕斑純化，獲得單一的穩(wěn)定表達(dá)EGFP的鴨瘟重組病毒株rDEV TK-EGFP。
[0015] 其中，優(yōu)選的，步驟（1)中重組轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP是通過以下方法構(gòu)建得到的：
[0016] (1)根據(jù)DEV病毒基因組TK基因序列及其側(cè)翼序列，應(yīng)用Oligo 6. 0軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，引物序列如下：
[0017] Tl (上游）：5，-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3，
[0018] T4 (下游）：5，-AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3，
[0019] (2)應(yīng)用所述引物擴(kuò)增DEV TK基因及其側(cè)翼序列，并將其克隆至pMD18-T Simple 載體中，構(gòu)建質(zhì)粒pTK;將包含sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因序列的基因 片段sCMV-EGFP插入載體pTK中的Hpa I位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP，優(yōu)選的，所述sCMV 啟動(dòng)子來源于PCS2+質(zhì)粒，優(yōu)選的，在EGFP基因兩端加入了 Hind III和Stu I限制性內(nèi)切 酶位點(diǎn),可通過該位點(diǎn)將EGFP替換為其他外源基因。
[0020] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的包含sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因 序列的基因片段sCMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示（圖2)，擴(kuò)增獲得的DEV TK 基因及其側(cè)翼序列的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示（圖1)。
[0021] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了按照所述的方法制備得到的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，一種穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因 的鴨瘟重組病毒株，命名為rDEVTK-EGFP株，分類命名為Duck Anatid Herpesvirus，保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中 科院微生物研究所，保藏日期為2014年7月8日，其微生物保藏號(hào)是：CGMCC No. 9456。
[0023] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的鴨瘟重組病毒株在制備預(yù)防鴨瘟或在制備預(yù) 防鴨瘟及其它禽類傳染病的重組鴨瘟疫苗中的應(yīng)用，包括將所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋 白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為導(dǎo)致其他禽類 傳染病的病毒的基因，優(yōu)選的，所述的其它禽類傳染病包括能夠引起包括鴨、鵝在內(nèi)的雁形 目禽類以及雞的病毒性傳染病。
[0024] 優(yōu)選的，所述的導(dǎo)致其他禽類傳染病的病毒的基因包括禽流感病毒HA基因、新城 疫病毒HN基因。
[0025] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體將EGFP基因替換為其他 基因如禽流感病毒HA基因或新城疫病毒HN基因等，與TK基因缺失表達(dá)EGFP重組鴨瘟病 毒基因組共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，獲得穩(wěn)定表達(dá)其他外源基因（禽流感病毒HA基因或 新城疫病毒HN基因等）的鴨瘟重組病毒株。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，公開了一種用于預(yù)防鴨瘟以及禽流感的二價(jià)疫 苗，其特征在于含有穩(wěn)定表達(dá)禽流感病毒HA基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩(wěn)定表達(dá) 禽流感病毒HA基因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構(gòu)建得到：將所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色 熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為禽流感 病毒HA基因，即得。
[0027] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施例中，公開了一種用于預(yù)防鴨瘟以及新城疫的二價(jià)疫 苗，其特征在于含有穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒HN基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩(wěn)定表達(dá) 新城疫病毒HN基因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構(gòu)建得到：將所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色 熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為新城疫 病毒HN基因，即得。
[0028] 本發(fā)明弱毒株應(yīng)用范圍較寬，例如，可應(yīng)用于制備成預(yù)防鴨瘟或其他禽類病原的 多價(jià)聯(lián)合疫苗（活苗或滅活疫苗）等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明重組鴨瘟病毒株基因組TK基因插入位點(diǎn)及缺失的TK核苷酸序列；
[0030] 圖2為本發(fā)明重組鴨瘟病毒株基因組TK基因內(nèi)部插入的sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠 色熒光蛋白（EGFP)的基因序列；
[0031] 其中下劃線序列為SCMV啟動(dòng)子的基因序列，灰色字體所示的序列為增強(qiáng)型綠色 熒光蛋白（EGFP)的基因序列。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0033] 實(shí)施例1轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0034] 根據(jù)DEV病毒基因組TK基因序列及其側(cè)翼序列（GenBank登陸號(hào)為AY963569)，應(yīng) 用Olig 0 6. 0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物序列如下：
[0035] T1 (上游）：5，-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3，
[0036] T4 (下游）：5，-AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3，
[0037] 首先應(yīng)用引物Tl (上游）和T4(下游）擴(kuò)增DEV TK基因及其側(cè)翼序列（SEQ ID NO: 1所示），并將其克隆至pMD18-T Simple載體中，構(gòu)建質(zhì)粒ρΤΚ ;將帶有sCMV啟動(dòng)子的 EGFP表達(dá)盒（SEQ ID NO: 2所示）插入載體ρΤΚ中的Hpa I位點(diǎn)（圖1所示），構(gòu)建轉(zhuǎn)移載 體pTK-EGFP。其中，所述sCMV啟動(dòng)子來源于pCS2+質(zhì)粒，并且在擴(kuò)增時(shí)在EGFP基因兩端加 入了 Hind III和Stu I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可通過該位點(diǎn)將EGFP替換為其他外源基因。
[0038] 實(shí)施例2鴨瘟病毒基因組的提取
[0039] 將DEV Clone-03細(xì)胞毒以0. 001個(gè)MOI接種于鋪滿CEF單層的5mL細(xì)胞瓶中（雞 胚成纖維細(xì)胞的制備參照《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》操作（薛慶善，2001) )，37°C吸附2h， 棄掉病毒液，換DMEM細(xì)胞維持液（含2 % FBS)，待細(xì)胞病變達(dá)到80 %?90 %后，棄掉細(xì)胞 維持液，加入細(xì)胞消化液（1860μLSTE;100μL10%SDS;40μL蛋白酶K20mg/mL)，37°C 消化過夜，加入等體積酚抽提一次，等體積酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等體積氯仿抽提一 次；加入1/10體積NaAC(3M，pH5. 2)，2. 5倍體積無水乙醇，置于-20°C沉淀過夜，4°C離心 15min，風(fēng)干后加入適量去離子水溶解病毒基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組的完整 性，儲(chǔ)存于_2〇°C備用。
[0040] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)染
[0041] Day 1 :準(zhǔn)備細(xì)胞
[0042] 預(yù)先將CEF細(xì)胞傳代并鋪于5mL細(xì)胞瓶中，37°C 2%恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0043] Day 2 :轉(zhuǎn)染
[0044] (1) ·于轉(zhuǎn)染前3_4h更換細(xì)胞培養(yǎng)液
[0045] (2).轉(zhuǎn)染體系：A液：18 μ L 2M CaC12, IOyg DNA (轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組比例為 3:1)，加去離子水補(bǔ)足體積至 150 μ L。B 液：150 μ L 2XHepes Buffered Saline(HBS)
[0046] (3).用移液器將A液逐滴加入B液，在加 A液的同時(shí)利用另一個(gè)移液器向B液中 緩慢吹入空氣，此過程應(yīng)在l_2min之內(nèi)完成。
[0047] (4).將A B混合液置于室溫孵育30min。
[0048] (5).將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。
[0049] (6).將細(xì)胞置于37°C 2%恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0050] Day 3 :更換細(xì)胞培養(yǎng)液并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行休克
[0051] (1).更換細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0052] (2) ·用I X PBS輕洗細(xì)胞2次。
[0053] (3).利用DMSO對(duì)細(xì)胞進(jìn)行休克。
[0054] 1)用 IXPBS 配制 15% DMS0。
[0055] 2)將2mL DMSO休克液加入輕洗后的細(xì)胞中。
[0056] 3)室溫孵育 2. 5min。
[0057] 4)棄掉DMSO加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0058] (4).將細(xì)胞置于37°C 5% C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0059] 1)用 IXPBS 配制 15% DMSO 休克液。
[0060] 2)將2mL DMSO休克液加入輕洗后的細(xì)胞中。
[0061] 3)室溫孵育 2. 5min。
[0062] 4)棄掉DMSO休克液加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0063] 細(xì)胞置于37°C，5 % C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察至出現(xiàn)細(xì)胞病變 (CPE)，熒光顯微鏡下觀察是否有表達(dá)綠色熒光蛋白的CPE，待CPE達(dá)到80 %?90 %后收獲 病毒，反復(fù)凍融3次，作為蝕斑純化的種毒，儲(chǔ)存于-70°C備用。
[0064] 實(shí)施例4重組病毒的篩選及鑒定
[0065] 將收獲的含有重組病毒的病毒液用無血清DMEM做KT1?KT4稀釋，將生長良好的 CEF細(xì)胞單層用PBS輕洗3次，加入病毒稀釋液，37°C孵育a后，吸棄病毒液，加入DMEM培 養(yǎng)基（含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖，10% FBS)，室溫放置30min培養(yǎng)基凝固后，移入37°C 5% C02 恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待蝕斑出現(xiàn)后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)進(jìn)行重組病 毒蝕斑的篩選，待蝕斑增長至合適大小，挑取表達(dá)熒光蛋白的蝕斑于無血清DMEM中，反復(fù) 凍融三次后，再次接種于CEF細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行蝕斑純化。重復(fù)以上步驟，經(jīng)過3輪蝕斑純化， 獲得純凈的重組病毒。將純化的重組病毒反復(fù)凍融三次，取200 μ L病毒液提取重組病毒基 因組，方法如下：取200yL病毒液，加入5yL蛋白酶K(20mg/mL)和20yL 10% SDS，置于 56°C水浴消化2h;等體積酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等體積氯仿抽提一次；加入1/10體 積NaAC(3M，pH5. 2)和2. 5倍體積無水乙醇，置于-20°C 15min后，4°C，離心15min收集病毒 基因組，加入適量去離子水溶解后，以該重組病毒基因組為模板，利用引物T1+T2對(duì)重組病 毒進(jìn)行PCR初步鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 9 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收目的片段，將其克 隆至PMD18-T載體，經(jīng)篩選鑒定后陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與SEQ ID NO: 2所示序列一致， 說明構(gòu)建成功。
[0066] 實(shí)施例5重組病毒穩(wěn)定性的測(cè)定
[0067] 1、生長穩(wěn)定性（復(fù)制動(dòng)力學(xué)/ 一步生長曲線）
[0068] 將預(yù)先制備好的CEF細(xì)胞傳代并鋪于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。待細(xì) 胞長成單層后，將重組病毒以0. 001個(gè)MOI接種于生長良好的CEF單層，37°C孵育2h，棄掉 病毒液，加入DMEM細(xì)胞維持液（含2% FBS)置于37°C 5% C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于 12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后收獲病毒，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行重復(fù)，反復(fù)凍融三 次，-20°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0069] 將不同時(shí)間點(diǎn)收獲的病毒液做KT1?10_7倍稀釋。將病毒原液與無血清DMEM細(xì) 胞培養(yǎng)液以1 :1〇的比例充分混勻。吸取100 μ L病毒稀釋液加入至裝有900 μ L無血清 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的EP管中，重復(fù)以上步驟直至病毒稀釋至KT7倍，將病毒稀釋液接種于預(yù) 先鋪滿CEF單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，37 °C孵育2h，棄掉病毒液，每 孔加入IOOuL的DMEM細(xì)胞維持液（含2% FBS)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲的3個(gè)不同孔的病毒 液按照以上方法進(jìn)行平行測(cè)定。12h后開始觀察細(xì)胞病變情況，連續(xù)觀察，7d后判定結(jié)果。 按照Karber法計(jì)算病毒的TCID 5tl。統(tǒng)計(jì)所有時(shí)間點(diǎn)病毒液的TCID5tl，同時(shí)對(duì)親本病毒DEV Clone-03的生長規(guī)律進(jìn)行平行測(cè)定，以0. 001個(gè)MOI接種于生長良好的CEF單層，分別于 接種后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后收獲病毒，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做三個(gè)平行重復(fù)。經(jīng) 測(cè)定，rDEV TK-EGFP在7此收獲的重組病毒滴度最高，為106 8TCID5(l/mL，隨著感染時(shí)間的 增加，病毒的復(fù)制對(duì)細(xì)胞的損傷越來越大，活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，導(dǎo)致病毒的復(fù)制由于宿主 細(xì)胞的死亡而受到抑制，病毒滴度在72h達(dá)到最高后逐漸下降。親本病毒DEV Clone-03在 72h收獲的滴度達(dá)到最高，為107 9TCID5(l/mL，隨著感染時(shí)間的增加，其滴度逐漸下降。可見 rDEV TK-EGFP重組病毒增殖滴度較親本野毒稍有下降，但其滴度仍可達(dá)到106 8TCID5(l/mL。
[0070] 2、重組病毒遺傳穩(wěn)定性測(cè)定
[0071] 將重組病毒接種于CEF細(xì)胞連續(xù)傳代。將重組毒以0. 001M0I接種CEF細(xì)胞，37°C， 5 % C02孵育2h，棄掉病毒液，加入DMEM細(xì)胞生長維持液（含2 % FBS)。熒光顯微鏡下觀察 綠色熒光蛋白的表達(dá)，當(dāng)CPE達(dá)到80 %?90 %時(shí)收獲病毒。連續(xù)傳代至25代，每5代進(jìn)行 鑒定。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并提取病毒基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定和序 列測(cè)定，結(jié)果表明，重組病毒經(jīng)連續(xù)傳代均能保持遺傳穩(wěn)定性。
[0072] 本發(fā)明的一種穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株，命 名為rDEVTK-EGFP株，分類命名是Duck Anatid herpesvirus,保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所， 保藏日期為2014年7月8日，其微生物保藏號(hào)是：CGMCC No. 9456。
[0073] 本發(fā)明將外源基因插入鴨瘟病毒TK基因內(nèi)部，以EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因，在報(bào)告基 因插入的同時(shí)造成TK基因的缺失，構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白的TK缺失鴨瘟重組病毒。為了驗(yàn) 證本發(fā)明作為重組模式病毒在TK基因內(nèi)部插入其他外源基因的可能性與表達(dá)蛋白的有效 性，通過本發(fā)明構(gòu)建重組病毒的方法相繼構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)禽多種疫病病原免疫原基因，如 禽流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因，并將不同重組病毒作為抗原免疫上述病原宿主動(dòng) 物均激發(fā)產(chǎn)生相應(yīng)病原免疫原蛋白的抗體，說明利用本發(fā)明獲得的穩(wěn)定表達(dá)其他外源基因 的重組鴨瘟病毒株和構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)其他禽類病原外源基因的重組鴨瘟病毒疫苗株的方法， 能夠制備獲得預(yù)防鴨瘟和其他禽類傳染病的重組疫苗，具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。為印證本發(fā)明 獲得的重組病毒株和構(gòu)建方法在制備預(yù)防鴨瘟和其它禽類傳染病的重組鴨瘟疫苗中的應(yīng) 用，通過以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明的應(yīng)用，但應(yīng)該理解的是，以下實(shí)施例和 實(shí)驗(yàn)例只是舉例說明的目的，并不意味著限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0074] 實(shí)施例6穩(wěn)定表達(dá)禽流感病毒HA基因的重組病毒的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)
[0075] 1、穩(wěn)定表達(dá)禽流感病毒HA基因的重組病毒的構(gòu)建
[0076] 攜帶禽流感病毒HA基因的質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保 存，應(yīng)用01 igo 6. 0軟件設(shè)計(jì)HA基因引物，上游引物引入Hind III位點(diǎn)，下游引物引入Stu I位點(diǎn)。利用限制性內(nèi)切酶Hind III和Stu I處理pTK-EGFP轉(zhuǎn)移載體，敲除EGFP基因， 質(zhì)粒骨架仍帶有TK側(cè)翼序列和可供病毒識(shí)別的真核啟動(dòng)子sCMV啟動(dòng)子，將預(yù)先處理的帶 有Hind III和Stu I粘性末端的禽流感病毒HA基因插入pTK骨架中，構(gòu)建含有HA表達(dá)盒 的轉(zhuǎn)移載體ρΤΚ-ΗΑ。具體地，利用Hind III和Stu I對(duì)pTK-EGFP質(zhì)粒和HA片段進(jìn)行酶 切處理，反應(yīng)體系（30yL) :dH20:17yL，10XHBuffer:3yL，Xho I 和 Not I:各 lyL，質(zhì)粒 8 μ L，37°C水浴2h后，經(jīng)0. 9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 后，采用DNA凝膠回收試劑盒（Omega)純化回收目的DNA片段。將酶切后的載體和HA片段 鏈接，反應(yīng)體系為=IOXT 4DNA Ligase Bufferd μ L，T4DNA 連接酶：1 μ L，載體 1.5 μ L，目 的片段6.5 μ L，16°C連接過夜。鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG 1，鑒定并篩選陽性克隆，提取陽 性質(zhì)粒并經(jīng)克隆測(cè)序，保證序列無誤。
[0077] 將rDEV TK-EGFP重組病毒以0.001個(gè)MOI接種于鋪滿CEF單層的5mL細(xì)胞瓶 中，37°C孵育2h，棄掉病毒液，換DMEM細(xì)胞維持液（含2% FBS)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%? 90%后，棄掉細(xì)胞維持液，加入細(xì)胞消化液（1860yL STE ;100yL10% SDS ;40yL蛋白酶K 20mg/mL)，37°C消化過夜，加入等體積酚抽提一次，等體積酚氯仿（I: 1)抽提一次，加入等 體積氯仿抽提一次；加入1/10體積NaAC (3M，pH5. 2)，2. 5倍體積無水乙醇，置于-20°C沉淀 過夜，4°C離心15min，風(fēng)干后加入適量去離子水溶解rDEV TK-EGFP基因組DNA。
[0078] 采用轉(zhuǎn)染試劑，將轉(zhuǎn)移載體pTK-HA與rDEVTK-EGFP基因組DNA共轉(zhuǎn)染至CEF細(xì)胞， 方法同實(shí)施例3,獲得鴨瘟重組禽流感HA重組病毒rDEVTK-HA，重組病毒的篩選和純化方法 同實(shí)施例4,對(duì)重組病毒的鑒定則利用引物T1+T2進(jìn)行鑒定。同時(shí)將重組病毒接種生長良 好的CEF單層，在感染后6h、12h、24h、48h、72h分別收獲細(xì)胞，棄掉上清，PBS輕洗三次，力口 入RIPA，置于冰上裂解20min后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，加入1/4體積5 X SDS上樣緩沖液， 沸水浴煮沸IOmin,冰上放置5min，進(jìn)行蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳，完畢后按照常規(guī)Western blot方法將轉(zhuǎn)膜濾紙和硝酸纖維膜（NC膜）剪成與凝膠同樣大小，按照濾紙、NC膜、凝膠、 濾紙的順序依次疊放在一起，排凈氣泡，置于半干電轉(zhuǎn)儀中（NC膜側(cè)位于陽極、凝膠側(cè)位于 陰極），40mA、300V轉(zhuǎn)印90min，取出NC膜，經(jīng)麗春紅染色確定轉(zhuǎn)印效果，將轉(zhuǎn)印成功的NC膜 置于含5%脫脂乳的PBS中，37°C封閉lh，PBST洗滌3次，每次IOmin ;以雞抗禽流感HA抗 體（1:300)為一抗，37°C孵育2h后，PBST洗滌3次，每次IOmin ;以兔抗雞IgG-HRP (1:5000) 為二抗，37°C孵育2h后，PBST洗滌3次，每次lOmin，DAB顯色，待檢測(cè)的目的片段顯色后， 終止反應(yīng)。結(jié)果顯示，在重組病毒rDEVTK-HA感染CEF細(xì)胞48h后可檢測(cè)到禽流感病毒HA 基因的表達(dá)，72h后HA基因的表達(dá)量更多，而接種親本毒株的CEF細(xì)胞和CEF細(xì)胞未檢測(cè)到 相應(yīng)的蛋白。
[0079] 實(shí)施例還依照實(shí)施例5的方法對(duì)重組病毒rDEVTK-HA進(jìn)行了生長穩(wěn)定性和遺傳穩(wěn) 定性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組病毒rDEVTK-HA經(jīng)連續(xù)傳代能保持遺傳穩(wěn)定性，并持續(xù)表達(dá)禽流感 病毒HA蛋白。
[0080] 2、重組病毒rDEVTK-HA接種鴨后的免疫效力評(píng)價(jià)
[0081] 2.1試驗(yàn)材料
[0082] 2. I. IrDEVTK-HA株重組病毒由本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建并在CEF細(xì)胞增殖，野生鴨瘟強(qiáng)毒 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存鑒定。
[0083] 2. I. 2SPF試驗(yàn)鴨：來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0084] 2· 2試驗(yàn)方法
[0085] 將rDEVTK-HA株重組病毒以0. Iml肌肉注射接種15只4周齡SPF鴨，另外15只 作為對(duì)照，接種后7天其中10只免疫鴨和10只對(duì)照鴨分別肌肉注射途徑攻擊致死劑量的 DEV強(qiáng)毒株；剩余的5只免疫鴨和5只對(duì)照鴨分別采集血清測(cè)定流感病毒的血凝抑制價(jià)。
[0086] 2. 3、試驗(yàn)結(jié)果
[0087] 2. 3. IrDEVTK-HA株重組病毒對(duì)DEV強(qiáng)毒的免疫保護(hù)
[0088] 用重組病毒免疫鴨后7天，所有免疫組鴨均對(duì)強(qiáng)毒攻擊產(chǎn)生完全保護(hù)，而10只對(duì) 照組鴨在攻毒后6天之內(nèi)均死亡（詳見表1)。
[0089] 表I rDEVTK-HA株重組病毒免疫鴨對(duì)DEV的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
[0090]

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的方法，其特征 在于在TK基因3'端HpaI位點(diǎn)插入了包含sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基 因序列的基因片段sCMV-EGFP，構(gòu)建獲得在TK基因相應(yīng)位置插入sCMV-EGFP表達(dá)盒的鴨瘟 重組病毒株。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) PCR擴(kuò)增獲得鴨瘟病毒基因組TK及其兩側(cè)的側(cè)翼序列，并將可供病毒識(shí)別的真核 啟動(dòng)子sCMV啟動(dòng)子以及EGFP基因插入TK基因的3'端HpaI位點(diǎn)，構(gòu)建獲得含有EGFP表 達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)移載體，命名為PTK-EGFP ; (2) 提取鴨瘟病毒的完整基因組DNA ; (3) 利用步驟（1)中獲得的重組轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP與步驟（2)中獲得的鴨瘟病毒基因 組DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，通過熒光顯微鏡篩選表達(dá)綠色熒光蛋白的病毒，再 經(jīng)過病毒蝕斑純化，獲得單一的穩(wěn)定表達(dá)EGFP的鴨瘟重組病毒株rDEV TK-EGFP。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟（1)中重組轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP是通過以 下方法構(gòu)建得到的： (1) 根據(jù)DEV病毒基因組TK基因序列及其側(cè)翼序列，應(yīng)用Oligo 6. O軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引 物，引物序列如下： Tl (上游）：5' -GACGTGTTGGCATCGGTTC-3' T4(下游）：5' -AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3， (2) 應(yīng)用所述引物擴(kuò)增DEV TK基因及其側(cè)翼序列，并將其克隆至pMD18-T Simple載體 中，構(gòu)建質(zhì)粒pTK;將包含sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因序列的基因片段 sCMV-EGFP插入載體pTK中的Hpa I位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP，優(yōu)選的，所述sCMV啟動(dòng) 子來源于PCS2+質(zhì)粒，優(yōu)選的，在EGFP基因兩端加入了 Hind III和Stu I限制性內(nèi)切酶位 點(diǎn)，可通過該位點(diǎn)將EGFP替換為其他外源基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的包含sCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋 白（EGFP)基因序列的基因片段sCMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，擴(kuò)增獲得的 DEV TK基因及其側(cè)翼序列的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
5. 按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備得到的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP) 基因的鴨瘟重組病毒株。
6. -種穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株，其特征在于所 述的鴨瘟重組病毒株，命名為rDEVTK-EGFP株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，其微生物保藏號(hào)是：CGMCC No. 9456。
7. 權(quán)利要求5或6所述的鴨瘟重組病毒株在制備預(yù)防鴨瘟或在制備預(yù)防鴨瘟及其它禽 類傳染病的重組鴨瘟疫苗中的應(yīng)用，包括將權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋 白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為導(dǎo)致其他禽類 傳染病的病毒的基因，優(yōu)選的，所述的其它禽類傳染病包括能夠引起包括鴨、鵝在內(nèi)的雁形 目禽類以及雞的病毒性傳染病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的導(dǎo)致其他禽類傳染病的病毒的基因包括禽 流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因。
9. 一種用于預(yù)防鴨瘟以及禽流感的二價(jià)疫苗，其特征在于含有穩(wěn)定表達(dá)禽流感病毒 HA基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩(wěn)定表達(dá)禽流感病毒HA基因的鴨瘟重組病毒株通 過以下方法構(gòu)建得到：將權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨 瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為禽流感病毒HA基因，即得。
10. -種用于預(yù)防鴨瘟以及新城疫的二價(jià)疫苗，其特征在于含有穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒 HN基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒HN基因的鴨瘟重組病毒株通 過以下方法構(gòu)建得到：將權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因的鴨 瘟重組病毒株的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因替換為新城疫病毒HN基因，即得。
【文檔編號(hào)】A61P31/22GK104312982SQ201410474947
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】劉勝旺, 李慧昕, 韓宗璽, 孔憲剛 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所