藿香油的抗前列腺癌新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了藿香油在制備預(yù)防、治療或輔助治療前列腺癌的保健食品、食品、藥品中的用途中的用途；所述的藿香油來源于廣藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.或藿香Agastacherugosa(Fisch.EtMey.)0.Ktze.提取的揮發(fā)油。本發(fā)明藿香油具有抗腫瘤的作用，尤其是對前列腺癌的抑制作用顯著，可有效用于治療前列腺癌及其轉(zhuǎn)移病灶，且安全性明顯優(yōu)于化療藥物紫杉醇，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】藿香油的抗前列腺癌新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藿香油的新用途，特別涉及藿香油在制備抗前列腺癌保健食品、食品、 藥品中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男 性所有惡性腫瘤中位居第二。在美國，前列腺癌發(fā)病率在所有男性惡性腫瘤中居第一位，死 亡率居第二位。在我國，近年來其發(fā)病率亦已躍居泌尿生殖系惡性腫瘤的第三位。前列腺 癌的發(fā)病臨床早期癥狀少，大部分患者確診時已到晚期，失去手術(shù)根治時機。行前列腺癌根 治術(shù)的患者，有27%?53%在術(shù)后10年內(nèi)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。內(nèi)分泌治療是目前晚期 前列腺癌的主要治療方法，但經(jīng)過中位時間14?30個月后，幾乎所有前列腺癌患者最終均 轉(zhuǎn)為雄激素非依賴前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC)，進(jìn)而發(fā)展 為激素難治性前列腺癌（hormone-refractory prostate cancer, HRPC)。此類前列腺癌統(tǒng) 稱為去勢抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer, CRPC)。去勢抵抗性前 列腺癌患者生存質(zhì)量差，中位生存期12?20個月。隨著前列腺癌發(fā)病率、死亡率的上升， 如何有效治療去勢抵抗性前列腺癌患已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點。
[0003] 目前去勢抵抗性前列腺癌的治療手段主要是以多西紫杉醇、米托蒽醌、潑尼松等 藥物聯(lián)合化學(xué)治療，副作用明顯，且尚無最佳治療方案。新型抗腫瘤藥物目前處于不斷開發(fā) 研究階段。因此，尋找一種高效、安全、副作用少的抗腫瘤藥物的研究勢在必行。
[0004] 我國的中藥資源極為豐富，應(yīng)用歷史悠久，在長期的實踐中積累了很多資料和經(jīng) 驗。中藥防治腫瘤具有療效顯著、副作用小、費用少等優(yōu)勢，長期被廣大臨床工作者所沿用。 一些中藥可阻斷或抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而使癌細(xì)胞的增殖受到抑 制，并干擾腫瘤細(xì)胞能量代謝或具有直接抑殺癌細(xì)胞作用。如冬凌草、重樓、三七、山豆根、 天南星、天門冬、百合、莪術(shù)、瓜萎、薏苡仁、龍葵、郁金、女貞子等。一些中藥可通過影響癌基 因和抑癌基因的表達(dá)、誘生和促使機體細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，如黃芪、 當(dāng)歸、枸杞子等可通過誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、干擾素等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)LAK細(xì)胞凋亡或 增加 TNF誘導(dǎo)凋亡的能力。另外，銀杏外種皮多糖、白藜蘆醇、苦參堿、天花粉蛋白、靈芝醇 提取物、人參皂苷、當(dāng)歸的丙酮提取物均有調(diào)控凋亡基因 bcl-2和抑凋亡基因 Bax表達(dá)的作 用，從而實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，達(dá)到抑制腫瘤作用。黃芪、人參、黨參、麥冬、白術(shù)、甘 草、女貞子、枸杞子、生地、當(dāng)歸等能改善或恢復(fù)腫瘤患者紊亂的T細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，升高 ⑶3+、⑶4+以及⑶47⑶8+比值。還有不少中藥可以提高機體應(yīng)激能力，減輕化療、放療毒副 作用，如黃精、黃芪、雞血藤、地龍、五味子、何首烏、薏苡仁、仙茅、淫羊藿、天冬、麥冬、天花 粉、石斛、石韋等。因此中藥抗腫瘤有著潛在優(yōu)勢和廣闊的前景。
[0005] 廣藿香為唇形科（Labiatae)多年生刺蕊草本植物廣藿香（Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)，又名枝香，原產(chǎn)菲律賓等熱帶亞洲，現(xiàn)廣泛分布在中國、印度、日 本、印度尼西亞、馬來西亞、馬達(dá)加斯加、巴西、巴拉圭和俄羅斯等。目前廣蕾香在廣東的廣 州、肇慶、湛江以及海南、廣西、四川等?。▍^(qū)）均有栽培，是"十大南藥"之一，其藥材商品按 產(chǎn)地不同分為牌香（廣州產(chǎn)）、枝香（肇慶產(chǎn)）、湛香（湛江產(chǎn)）和南香（海南產(chǎn)）4種。其 味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，以全草入藥，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑之功效。常用 于濕濁中阻、脘痞嘔吐，暑濕倦怠、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛、外感風(fēng)寒。廣 藿香的揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗菌活性。
[0006] 藿香為唇形科植物藿香Agastache rugosa(Fisch. Et Mey. )0· Ktze.的干燥地上 部分，含有揮發(fā)油，功效同廣藿香。現(xiàn)代藥理表明，廣藿香具有抗病原微生物、抗炎、解熱、鎮(zhèn) 痛等作用，是藿香正氣水、抗病毒口服液等治療流感、感冒常用中成藥的主要成分，但其藥 效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確且未見有其體內(nèi)抗流感病毒作用報道。藿香的揮發(fā)油具有抗菌作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供藿香油的新用途，以及以藿香油為活性成分的保健食品、 食品、藥品。
[0008] 本發(fā)明實驗發(fā)現(xiàn)，廣藿香油對PC3和DU145細(xì)胞有良好的抑制/誘導(dǎo)凋亡作用，其 中，PC3為雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞、DU145是從前列腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的， 為雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞，具有強大的轉(zhuǎn)移潛能。由此可見，廣藿香油能夠有效對抗 前列腺癌細(xì)胞，并且，對雄激素非依賴性前列腺癌和前列腺癌腦轉(zhuǎn)移類腫瘤細(xì)胞有良好的 抑制活性。
[0009] 本發(fā)明提供了藿香油在制備預(yù)防、治療或輔助治療前列腺癌的保健食品、食品、藥 品中的用途中的用途；所述的藿香油來源于廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.或 藿香 Agastache rugosa(Fisch.Et Mey.) 0· Ktze.提取的揮發(fā)油。
[0010] 進(jìn)一步地，所述前列腺癌為雄激素非依賴性前列腺癌或去勢抵抗性前列腺癌。 [0011] 更進(jìn)一步地，所述保健食品、食品、藥品是預(yù)防、治療或輔助治療前列腺癌轉(zhuǎn)移至 骨、腦、肺或肝的保健食品、食品、藥品。
[0012] 優(yōu)選地，所述保健品、食品或藥品是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的保健品、食品或藥品。
[0013] 進(jìn)一步地，所述藿香油源于廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的揮發(fā)油， 百秋李醇含量不低于26% w/w。
[0014] 更進(jìn)一步地，所述藿香油源于廣藿香Pogostemon cablin (Blanco)Benth.的揮發(fā) 油，百秋李醇含量為26?40% w/w。
[0015] 本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，使用的廣藿香揮發(fā)油中，白秋李醇含量約為40% /w/w〇
[0016] 更進(jìn)一步地，所述的藿香油是按照如下方法制備：取廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.或藿香Agastache rugosa(Fisch.Et Mey. )0· Ktze.的全草，粉碎成 粗粉，加水，浸泡，采用水蒸氣蒸餾法提取，即得。
[0017] 本發(fā)明一個【具體實施方式】中，使用廣藿香全草制備的揮發(fā)油。
[0018] 其中，所述保健品、食品或藥品是以藿香油為活性成分，加上保健食品、食品、藥品 上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
[0019] 本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的輔料，是指除活性成分以外包含在劑型中的物質(zhì)，包 括但不僅限于填充劑（稀釋劑）、潤滑劑（助流劑或抗粘著劑）、分散劑、濕潤劑、粘合劑、調(diào) 節(jié)劑、增溶劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑、崩解劑等。粘合劑包含糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨 醇、黃芪膠、纖維素及其衍生物（如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素或羥丙甲基 纖維素等）、明膠漿、糖漿、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮等；填充劑包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉 及其衍生物、纖維素及其衍生物、無機鈣鹽（如硫酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣等）、 山梨醇或甘氨酸等；潤滑劑包含微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、硼酸、氫化植物油、 聚乙二醇等；崩解劑包含淀粉及其衍生物（如羧甲基淀粉鈉、淀粉乙醇酸鈉、預(yù)膠化淀粉、 改良淀粉、羥丙基淀粉、玉米淀粉等）、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素等；濕潤劑包含十二 烷基硫酸鈉、水或醇等；抗氧劑包含亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、二丁基苯酸等；抑 菌劑包含0. 5%苯酚、0. 3%甲酚、0. 5%三氯叔丁醇等；調(diào)節(jié)劑包含鹽酸、枸櫞酸、氫氧化鉀 (鈉）、枸櫞酸鈉及緩沖劑（包括磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉）等；乳化劑包含聚山梨酯-80、 脂肪酸山梨坦、普流羅尼克F-68,卵磷酯、豆磷脂等；增溶劑包含吐溫-80、膽汁、甘油等。
[0020] 所述藥學(xué)上可接受的輔助性成分，它具有一定生理活性，但該成分的加入不會改 變上述化合物或衍生物在疾病治療過程中的主導(dǎo)地位，而僅僅發(fā)揮輔助功效，這些輔助功 效僅僅是對該成分已知活性的利用，是醫(yī)藥領(lǐng)域慣用的輔助治療方式。若將上述輔助性成 分與本發(fā)明化合物配合使用，仍然應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021] 進(jìn)一步地，所述的制劑為液體制劑、氣體制劑、固體制劑、半固體制劑。
[0022] 更進(jìn)一步地，所述制劑中藿香油的含量為0. 1 %?100% (w/w)。
[0023] 廣藿香油具有抗腫瘤的作用，對抑制前列腺癌生長作用明確，可以治療雄激素非 依賴性前列腺癌及其各器官轉(zhuǎn)移病灶，且活性優(yōu)于白秋李醇單體化合物，成本更低廉，市場 應(yīng)用前景良好。
[0024] 另外，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香油對雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞（PC3)的抑制 活性明顯優(yōu)于單用白秋李醇；在廣藿香油中白秋李醇濃度明顯低于單用白秋李醇的情況下 (僅為單體濃度的43. 7 %?67. 2 % )，廣藿香油能夠達(dá)到單用白秋李醇對前列腺癌腦轉(zhuǎn)移 腫瘤（DU145)的抑制作用，在具體使用時，即可直接使用廣藿香油，而無需使用純度較高的 白秋李醇單體，明顯節(jié)省了用藥成本。
[0025] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0026] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1細(xì)胞凋亡形態(tài)變化（透射電鏡，X 5000)
[0028] 圖2不同濃度廣藿香油對PC3細(xì)胞周期的影響；A :對照組；B?F :廣藿香油濃度 為 40、60、80、100、120μ g/ml
[0029] 圖3不同濃度廣藿香油對DU145細(xì)胞周期的影響；A :對照組；B?F :廣藿香油濃 度為 40、60、80、100、120 μ g/ml
[0030] 圖4實驗各組裸鼠體重變化趨勢
[0031] 圖5實驗各組裸鼠腫瘤體積變化趨勢
[0032] 圖6實驗各組裸鼠腫瘤增值率T/C (% )變化趨勢
[0033] 圖7實驗各組腫瘤重量

【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明使用的廣藿香油可購買市售產(chǎn)品，亦可通過水蒸氣蒸餾法提取，其中，廣藿 香油的質(zhì)量必須符合《中國藥典》一部中的相關(guān)規(guī)定，百秋李醇含量不低于26% w/w。
[0035] 實施例1本發(fā)明藿香油的制備
[0036] 取廣蕾香 Pogostemon cablin(Blanco)Benth.全草，粉碎過 20-40 目篩，加入 10-14倍重量的蒸餾水，浸泡1-5小時后，采用水蒸氣蒸餾法提取2-6小時，即得本發(fā)明藿香 油，又稱廣藿香油。
[0037] 經(jīng)檢測，本發(fā)明方法制備的廣藿香油中，含百秋李醇（C15H260)約40% w/w。
[0038] 實施例2本發(fā)明藿香油的制備
[0039] 取藿香 Agastache rugosa (Fisch. Et Mey. ) 0· Ktze.全草，粉碎過 20-40 目篩，力口 入10-14倍重量的蒸餾水，浸泡1-5小時后，采用水蒸氣蒸餾法提取2-6小時，即得本發(fā)明 藿香油。
[0040] 本發(fā)明藿香油也可按照藥典（2005年版）附錄XD揮發(fā)油測定法提取，還可采用有 機溶劑提取、超臨界co 2萃取等現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行提取，或者通過購買市售產(chǎn)品獲得。
[0041] 實施例3本發(fā)明食品
[0042] 取實施例1或?qū)嵤├?制備的藿香油與楊梅，加適量橘皮粉、桂皮粉、砂糖、公丁香 粉、甘草粉、小茴香粉、食鹽及明礬，制備楊梅蜜餞。
[0043] 取楊梅備妥后先放一層約20cm厚的楊梅，再放一層混合的食鹽、明礬、百秋李醇， 馬上壓緊。以后同樣相間放楊梅和食鹽明礬百秋李醇混合物，經(jīng)壓緊腌制后即成楊梅坯。取 楊梅坯需加砂糖、香料粉、橘皮粉、桂皮粉、公丁香粉、甘草粉、小茴香粉后，再經(jīng)浸水、晾曬、 拌料、包裝，即得楊梅蜜餞。
[0044] 實施例4本發(fā)明保健食品
[0045] 取實施例1或?qū)嵤├?制備的藿香油，加適量羧甲基纖維素鈉，與適量經(jīng)萎凋槽萎 凋、雙鍋殺青機殺青、揉捻機揉捻后的茵陳、砂仁、枸杞、佛手、大青葉鮮茶、菊花、決明子、金 銀花、白術(shù)、山萸肉、白芍、桑葉、五味子、小茴香、山藥混合均勻，制備養(yǎng)肝茶。
[0046] 實施例5本發(fā)明藥品
[0047] 取實施例1或?qū)嵤├?制備的藿香油，加適量羧甲基纖維素鈉，與適量經(jīng)萎凋槽萎 凋、雙鍋殺青機殺青、揉捻機揉捻后的茵陳、砂仁、枸杞、佛手、大青葉鮮茶、菊花、決明子、金 銀花、白術(shù)、山萸肉、白芍、桑葉、五味子、小茴香、山藥混合均勻，制備養(yǎng)肝茶。
[0048] 以下通過藥理試驗證明本發(fā)明的有益效果：
[0049] 實驗例1本發(fā)明藿香油體外抗腫瘤實驗
[0050] 1、材料及儀器
[0051] 1.1細(xì)胞株
[0052] PC3細(xì)胞（人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞）、DU145細(xì)胞（人雄激素非依賴性前 列腺癌細(xì)胞），購自上海中科院細(xì)胞庫。
[0053] 1. 2藥物及對照藥物
[0054] 試驗藥物：發(fā)明藥物：實施例1制備的廣藿香油。
[0055] 陽性藥物：紫杉醇注射液：規(guī)格為6mg/ml，5ml/支。太極集團四川太極制藥有限公 司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19994040,生產(chǎn)批號：12060014。
[0056] 1. 3培養(yǎng)基、試劑及耗材
[0057] F-12培養(yǎng)基（Gibco?公司）；胎牛血清（蘭州民海生物工程有限公司，批號 20120510) ;0. 25% EDTA-胰酶（凱基生物公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT)系A(chǔ)merseo產(chǎn)品； 青霉素 G鈉、鏈霉素（華北制藥）；無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公 司）。200 μ 1、lml -次性槍頭（江蘇海門生物耗材公司）。二甲基亞砜（DMS0):購自美國 Sigma公司。吐溫-80:購自成都科龍化工試劑廠。戊二醛：購自天津市科密歐化學(xué)試劑有 限公司，批號：20130321。四氧化鋨：購自魯昌化工有限公司，批號：20130225。丙酮：購自成 都市科龍化工試劑廠，批號=20130719。醋酸鈾：購自西安市蓮湖區(qū)風(fēng)云化工產(chǎn)品經(jīng)銷部， 批號：20130305。枸櫞酸鉛：購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號：20130318。DAPI :購自 德國PARTEC公司。
[0058] 1. 4主要儀器
[0059] 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ_1F);
[0060] 隔水式恒溫C02培養(yǎng)箱（Thermo scientific公司，美國）；
[0061] OLYMPUS倒置顯微鏡（型號CKX41，日本奧林巴斯公司）；
[0062] 微量移液器（法國GILSON公司生產(chǎn)）；
[0063] 立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司，型號：MLS_3780);
[0064] 臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司，型號：L-600);
[0065] 電子天平（型號JA-2603,上海天平儀器廠）。
[0066] 酶標(biāo)儀 Thermo acientific varioskan flash (美國）。
[0067] 日立H-600IV透射電鏡。
[0068] 流式細(xì)胞儀，美國 Beckman Counter 公司，型號：C0ULTER EPICS ELITE-ESP。
[0069] 2、實驗方法
[0070] 2. 1藥物及陽性對照的前處理
[0071] 取發(fā)明藥物廣藿香油2ml，加入0. 2ml吐溫-80助溶、在加37. 8ml純水反復(fù)研磨為 乳白色液體制劑，其終濃度為5%(廣藿香油密度是1.0128/1111，濃度50.61^/1111) ;吐溫-80 終濃度為〇. 5 %，過濾除菌后備用。
[0072] 將用于抗腫瘤的陽性對照藥物紫杉醇注射液用無菌水做1/10稀釋（即600 μ g/ ml)以備用。
[0073] 2. 2廣藿香油抑制前列腺癌細(xì)胞增殖作用試驗
[0074] 選用對數(shù)生長期細(xì)胞，用0. 25% EDTA-胰酶將細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì) 胞懸液濃度為6X104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔反應(yīng)體積100μ 1。置37°C，5% C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁生長后，棄上清液，用PBS緩沖液洗細(xì)胞面1次并吸棄。
[0075] 移除培養(yǎng)液后分別加用含不同濃度廣藿香油的細(xì)胞培養(yǎng)液，廣藿香油從50. 6mg/ ml開始，先10倍次稀釋，確定大致抑瘤范圍后在該范圍內(nèi)做連續(xù)梯度稀釋，每孔反應(yīng)體積 100 μ 1，繼續(xù)置37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48, 72h，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)含細(xì) 胞不含藥物含〇. 5%吐溫-80的溶劑對照組、不含細(xì)胞和藥物的空白對照組。為比較藥物 效果，本實驗同時設(shè)不同濃度紫杉醇作為陽性藥物對照。采用MTT比色法測定積分光密度 (Integral optical density，IOD)值，計算細(xì)胞存活率，由此計算細(xì)胞增殖抑制率，再計算 藥物的IC5Q。
[0076] MTT法測定細(xì)胞活性：終止培養(yǎng)前96孔板棄去含藥維持液，每孔加入MTT (5mg/ml) 溶液20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去上清液，用PBS清洗1次，每孔加入150 μ 1 DMS0,置搖床上低速振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處測量各 孔的吸光值（I0D值）。按照下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率 ：
[0077] 細(xì)胞存活率（％ )=(藥物組平均I0D值一空白對照組平均I0D值/溶劑對照組 平均I0D值一空白對照組平均I0D值）X 100%
[0078] 細(xì)胞增殖抑制率（％ ) = 100%-細(xì)胞存活率（％ )
[0079] 半數(shù)抑制濃度IC50為是藥物組I0D值比溶劑對照組I0D值降低50%的藥物濃度。
[0080] IC5(I采用SPSS19. 0軟件計算。采用SPSS19. 0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗 數(shù)據(jù)以"平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)"表示，樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，組間差異采用單 因素方差分析檢驗，P < 〇. 05為差異有顯著性。
[0081] 2. 3電鏡觀察PC3、DU145細(xì)胞的形態(tài)變化
[0082] 2. 3. 1細(xì)胞藥物處理
[0083] 將PC3細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為0. 5X106/ml，培養(yǎng)體積為6ml。置 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)液后加用含80 μ g/ml廣藿香油的培養(yǎng)液，培養(yǎng)體 積為6ml，設(shè)不含藥物的溶劑對照組。
[0084] 2. 3. 2細(xì)胞收集固定
[0085] 細(xì)胞培養(yǎng)48h后，0. 25 %胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞制成懸液4ml，放于離心管中， 1500rpm，離心15分鐘，棄去上清液。沿管壁緩慢加入約0. 5%戊二醛固定液（原液用PBS1 : 6稀釋）4ml，4°C靜置lOmin。設(shè)置離心機lOOOOrpm，再次離心lOmin，棄去上清液，緩慢加入 3%戊二醛固定液2ml固定。
[0086] 2. 3. 3電鏡標(biāo)本制作觀察
[0087] 取3%戊二醛預(yù)固定標(biāo)本，1 %四氧化鋨固定，丙酮逐級脫水、Epon812包埋、半薄 切片光學(xué)定位后超薄切片、醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，置透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 并采圖。
[0088] 同法處理DU145細(xì)胞。
[0089] 2. 4流式細(xì)胞儀檢測廣藿香油對PC3、DU145細(xì)胞周期的影響
[0090] 2. 4. 1細(xì)胞藥物處理
[0091] 將PC3細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為0. 5X106/ml，每孔反應(yīng)體積為2ml。 置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h至貼壁，移除培養(yǎng)液后，以含廣藿香油40、60、80、100、 120 μ g/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞，同時設(shè)不含藥物的溶劑對照組，每孔反應(yīng)體積為2ml， 繼續(xù)置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0092] 2. 4. 2細(xì)胞收集固定
[0093] 細(xì)胞培養(yǎng)48h后，每孔加入0. 25%胰蛋白酶1ml消化使貼壁細(xì)胞脫落，2ml培養(yǎng)液 終止消化后收集細(xì)胞懸液到離心管，1500rpm離心5min棄上清，收集細(xì)胞，冷PBS液10ml洗 滌細(xì)胞2次，離心沉淀細(xì)胞，棄上清。0. 5ml冷PBS液重懸細(xì)胞，迅速加入3. 5ml70%預(yù)冷乙 醇（4°C )，吹打均勻固定30min。
[0094] 2· 4· 3細(xì)胞DAPI染色觀察
[0095] 離心乙醇固定的細(xì)胞，棄上清液，PBS 5ml洗滌細(xì)胞2次去除殘留乙醇。加入1ml DAPI染液染色，4°C避光30min后應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。
[0096] 2. 4. 4數(shù)據(jù)處理
[0097] 流式細(xì)胞儀檢測重復(fù)2次，得到的不同濃度廣藿香油作用后細(xì)胞周期數(shù)據(jù)，以G/ Gi、S、G2/M各期所占百分比（％)均數(shù)表示。
[0098] 同法處理DU145細(xì)胞。
[0099] 3.實驗結(jié)果
[0100] 3. 1廣藿香油抑制前列腺癌細(xì)胞增殖結(jié)果
[0101] 3. 1. 1廣藿香油抑制PC3細(xì)胞增殖作用
[0102] 在試驗過程中溶劑對照組細(xì)胞在光鏡下形態(tài)保持基本正常，廣藿香油實驗組細(xì)胞 形態(tài)出現(xiàn)不同程度的凝縮、核凝集、胞質(zhì)起泡、細(xì)胞脫落，細(xì)胞生長受到抑制。MTT檢測結(jié)果 進(jìn)一步證實廣藿香油對PC3細(xì)胞有生長抑制作用，且作用強度具有時間-劑量依賴性。廣 藿香油對PC3的24h、48h、72h的最大抑制濃度分別為170 μ g/ml、170 μ g/ml和140 μ g/ml， 抑制率分別為98. 61%、97. 83%和90. 45%。計算得出廣藿香油對PC3的24h、48h、72h IC5Q 分別為 89. 68 μ g/ml、79. 89 μ g/ml、66. 74 μ g/ml，均值 78. 77 μ g/ml，組間差異具有統(tǒng)計學(xué) 意義（P < 0.05)。結(jié)果見表1。
[0103] 陽性對照藥物紫杉醇對PC3的24h、48h、72h的最大抑制濃度分別為30 μ g/ml、 35 μ g/ml和35 μ g/ml，抑制率分別為93. 52%、93. 79%和92. 88%。計算得出紫杉醇對PC3 的 24h、48h、72h IC5(I 分別為 13. 56μ g/ml、15. 52μ g/ml、15. 09μ g/ml，均值 14. 72μ g/ml。 結(jié)果見表2。
[0104] 表1廣藿香油對PC3腫瘤細(xì)胞生長抑制試驗結(jié)果（X土 s，η = 3)
[0105]

【權(quán)利要求】
1. 藿香油在制備預(yù)防、治療或輔助治療前列腺癌的保健食品、食品、藥品中的用途中的 用途；所述的藿香油來源于廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.或藿香Agastache rugosa(Fisch.Et Mey.)0.Ktze.提取的揮發(fā)油。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述前列腺癌為雄激素非依賴性前列腺 癌或去勢抵抗性前列腺癌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述保健食品、食品、藥品是預(yù)防、治 療或輔助治療前列腺癌轉(zhuǎn)移至骨、腦、肺或肝的保健食品、食品、藥品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項所述的用途，其特征在于：所述保健品、食品或藥品是 誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的保健品、食品或藥品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述藿香油源于廣藿香Pogostemon cablin (Blanco)Benth.的揮發(fā)油，百秋李醇含量不低于26% w/w。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述藿香油源于廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的揮發(fā)油，百秋李醇含量為26?40% w/w。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6任意一項所述的用途，其特征在于：所述的藿香油是按 照如下方法制備：取廣藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.或藿香Agastache rugosa(Fisch. Et Mey. )0. Ktze.的全草，粉碎成粗粉，加水，浸泡，采用水蒸氣蒸饋法提取， 即得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述保健品、食品或藥品是以藿香油為活 性成分，加上保健食品、食品、藥品上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的保健食品、食品、藥品，其特征在于：所述的制劑為液體制劑、 氣體制劑、固體制劑、半固體制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的保健食品、食品、藥品，其特征在于：所述制劑中藿香油的含 量為 0· 1%?100% (w/w)。
【文檔編號】A61P35/04GK104208141SQ201410484675
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】彭成, 蔡劍, 萬峰 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué), 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院