專利名稱：與抗前列腺癌疫苗有關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主要涉及與疫苗有關(guān)的方法和組合物，更具體地，涉及與抗前 列腺癌的疫苗有關(guān)的方法和組合物。
背景技術(shù)：
在介紹背景技術(shù)之前，先聲明，下文的括號[]中的數(shù)字是指，說明書最 后的參考文獻(xiàn)章節(jié)所列的文獻(xiàn)的編號。
在美國，前列腺癌是男性最常見的癌癥，并且是癌癥致死的第二大原 因[2]。目前對局部癌癥釆用的療法包括外科手術(shù)和放療，它們一般都是成 功的。但對轉(zhuǎn)移性疾病的治療就不那么有效，因為現(xiàn)有的體液療法只在短 時間內(nèi)起作用[3]。因此需要有新的治療前列腺癌的方法。
基于CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的免疫療法是一種有前景的潛在新 療法，尤其是對于預(yù)防和輔助治療轉(zhuǎn)移性疾病而言[4, 5]。 CTL識別靶細(xì)胞 表面短肽(8-10個氨基酸)形式的、與I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)形成 復(fù)合物的抗原。CTL直接裂解這些細(xì)胞的能力使得它們在肺瘤免疫治療方 面很有吸引力。
有人認(rèn)為，前列腺特異性抗原(PSA)是CTL特異性破壞前列腺癌細(xì)胞時 用到的胂瘤抗原。PSA高度特異性地僅在前列腺表達(dá)，它可以被前列腺癌 細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，并且迄今已有大量關(guān)于PSA的生化、遺傳和細(xì)胞生物學(xué)信 息，所有這些都使PSA成為前列腺癌免疫療法的潛在標(biāo)靶的極佳候選物。
近期有一些臨床試驗評價了數(shù)種基于PSA的疫苗在晚期前列腺癌患者 體內(nèi)激發(fā)抗PSA的免疫應(yīng)答的效果。這些疫苗包括，表達(dá)PSA的重組痘苗 病毒(rV-PSA) [6-9],重組PSA蛋白的脂質(zhì)體制劑[IO],經(jīng)重組PSA蛋白脈 沖[ll]或已被編碼PSA的RNA轉(zhuǎn)染[12]的自體樹突細(xì)胞(DC)。
CD8+ T細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞的主要生物學(xué)功能是在機(jī)體中消滅被病原體感染的細(xì)胞。 T細(xì)胞識別受感染的細(xì)胞的機(jī)制目前已了解到分子水平，其有賴于T細(xì)胞 受體復(fù)合物(TCR)與結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合物I類分子(MHC I)上的抗 原肽之間的相互作用。由該細(xì)胞產(chǎn)生的所有蛋白抗原都最終被降解，所得 的肽由MHC I分子呈遞在細(xì)胞表面。
CD8+T細(xì)胞的生成(development)
T細(xì)胞在胸腺生成，在胸腺中，TCR的a和卩基因節(jié)段發(fā)生重排，導(dǎo) 致每一個T細(xì)胞克隆最終表達(dá)一種特有的TCR [13]。 一些發(fā)育中的胸腺細(xì) 胞產(chǎn)生表面TCR，它們表達(dá)CD4和CD8的共受體(co-receptor),并經(jīng)歷復(fù) 雜的成熟過程，該過程有賴于它們的TCR對自身肽-MHC配體的特異性和 親和力。當(dāng)胸腺細(xì)胞表達(dá)的TCR對自身肽-MHC分子無親和力時，這些胸 腺細(xì)胞通過程序性細(xì)胞死亡機(jī)制而死亡。當(dāng)胸腺細(xì)胞表達(dá)的TCR對胸腺中 多個細(xì)胞表面的自身肽-MHC分子有較強(qiáng)的親和力，致使這些胸腺細(xì)胞具有 潛在的危害時，它們經(jīng)由物理刪除(physical deletion) [14]、功能失活 (functional inactivation) [15]、或受體編輯(receptor editing) [16]等途徑而^皮消 滅。只有當(dāng)胸腺細(xì)胞表達(dá)的TCR對胸腺基質(zhì)細(xì)胞(thymic stromal cell)表面的 自身肽-MHC分子具有低水平但卻是顯著的親和力時，這樣的胸腺細(xì)胞才能 在胸腺選擇過程中幸存下來[17]。
CD8+原初T細(xì)胞的再循環(huán)和存活 "原初(naiVe)" T細(xì)胞是指，尚未遭遇外源肽-MHC配體、而其TCR 又對該復(fù)合體具有高親和力的那些T細(xì)胞，它們是健康年輕人(healthy young adult)的二級淋巴器官中的主要T細(xì)胞。原初T細(xì)胞通過多個二級淋巴器官 持續(xù)地再循環(huán)，這些淋巴器官包括脾臟、淋巴結(jié)、和粘膜淋巴器官(如腸內(nèi) 的派爾結(jié)(Peyer's patches)) [18， 19]。據(jù)估計，單個的原初T細(xì)胞通過二級淋 巴器官進(jìn)行循環(huán)的平均時間為數(shù)月[20, 21]。 CD8+原初T細(xì)胞在此正常生命 周期(lifespan)期間的存活，是通過低親和力TCR對自身肽-MHC復(fù)合物的 識別[22]、以及經(jīng)由IL-7受體進(jìn)行的信號傳遞[23, 24]來維持的。雖然經(jīng)由 TCR和IL-7受體進(jìn)行的信號傳遞需要有原初T細(xì)胞，但在含有正常數(shù)量的 T細(xì)胞的宿主中，這些信號不引起T細(xì)胞增殖。相反，原初T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 T細(xì)胞缺陷的宿主體內(nèi)之后發(fā)生增殖。這種"自我平衡性(homeostatic)"增 殖也依賴于IL-7 [23， 24]以及對自身肽-MHC復(fù)合物的低親和力TCR識別[25],但不依賴于IL-2或CD28協(xié)同刺激受體[26]。在年幼個體中，胸腺不 斷產(chǎn)生新的原初T細(xì)胞，它們被運送到二級淋巴器官，以替換衰老的 (senescent)原初T細(xì)胞。而在那些胸腺產(chǎn)生的原初T細(xì)胞減少或不產(chǎn)生原初 T細(xì)胞的年老個體中，衰老的細(xì)胞通過剩余的原初T細(xì)胞的增殖來更新。 CD8+T細(xì)胞的活化CD8+原初T細(xì)胞在移動通過二級淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)時，遭遇由大且 形狀不規(guī)則的樹突細(xì)胞(DC)組成的密集網(wǎng)絡(luò)，這些DC組成型地表達(dá)高水平 的、為該機(jī)體中任何細(xì)胞都有的MHC分子[27]。在無感染或組織損傷的情 況下，二級淋巴器官中的所有DC群體以靜息狀態(tài)存在，其特征是，CD80 和CD86等協(xié)同刺激分子低水平表達(dá)[28]。在這種狀態(tài)下，DC最有可能的 作用是，呈遞低親和力的自身肽-MHC配體，以維持原初T細(xì)胞的存活。在有感染的情況下，多種病毒產(chǎn)物或細(xì)菌產(chǎn)物被先天性免疫系統(tǒng)的細(xì) 胞(包括DC)表面的模式識別受體(pattern recognition receptor)識別[29]，所述 受體例如Toll-樣受體(TLR)。 TLR信號傳遞引起DC的活化，這導(dǎo)致表達(dá)高 水平的協(xié)同刺激分子(CD80和CD86)、和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[30]。然后，活 化的DC將病原體來源的肽-MHC I分子的復(fù)合物呈遞給CD8+原初T細(xì)胞。 除了通過TLR傳遞信號，CD8+原初T細(xì)胞還需要由協(xié)同刺激性CD28受體 和IL-12受體傳來的信號，才能最大水平地增殖，并分化成細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞 [31-33]。所有這些信號都可以由活化的DC傳遞給CD8+原初T細(xì)胞[34]。CD8+原初T細(xì)胞在體內(nèi)暴露于抗原后，僅過48小時，就顯示有DNA 復(fù)制和細(xì)胞分化的跡象[35-37]。之后數(shù)日內(nèi)，抗原特異性T細(xì)胞數(shù)呈指數(shù) 增加。根據(jù)刺激的不同，二級淋巴器官中的抗原特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)在經(jīng) 抗原活化后的7-15日即達(dá)到最大水平(圖2.3) [35， 38-43]。體外試驗顯示，受抗原刺激的原初T細(xì)胞的細(xì)胞分化由IL-2的自分泌 來啟動[44]。但意外的是，在體內(nèi)，由抗原驅(qū)動的原初T細(xì)胞增殖對IL-2 的依賴很小[45-49]。可見，除了IL-2以外，必有其它信號或生長因子也能 驅(qū)動T細(xì)胞的體內(nèi)增殖。體內(nèi)T細(xì)胞增殖受DC傳來的協(xié)同刺激信號的密切調(diào)節(jié)(tightly regulated)。當(dāng)小鼠中的CD28不能與其配體CD80和CD86相互作用時，這 種小鼠中受抗原刺激的CD8+ T細(xì)胞的增殖大大減少[37， 45， 50]。 CD40配 體缺陷對T細(xì)胞擴(kuò)增(expansion)也有類似的影響，這種擴(kuò)增可能涉及CD40信號傳遞對抗原呈遞細(xì)胞表面CD80和CD86的誘導(dǎo)[51]。協(xié)同刺激信號通 過促進(jìn)生長因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖。當(dāng)CD28信號傳遞消失時，由 抗原驅(qū)動的IL-2生成被大大削弱[45]。 CD8+效應(yīng)T細(xì)胞抗原特異性CD8+T細(xì)胞在免疫應(yīng)答高峰時發(fā)揮效應(yīng)物功能，因此它們 也稱"效應(yīng)細(xì)胞(effector cell)" [52]。效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)一組特有的粘附受體。 與原初細(xì)胞不同，效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)穿孔蛋白(perforin)和粒酶(granzyme),它們 使效應(yīng)細(xì)胞具有特定的對展示相應(yīng)肽-MHC I類分子復(fù)合物的靶細(xì)胞進(jìn)行直 接殺傷的能力[53]。這些效應(yīng)T細(xì)胞移出T細(xì)胞，進(jìn)入多種非淋巴組織，尤 其有抗原沉積的發(fā)炎部位。具有裂解細(xì)胞的潛能的CD8+效應(yīng)T細(xì)胞移動到 非淋巴的器官中，這是從機(jī)體各個部位消滅展示肽-MHC I類分子復(fù)合物的 細(xì)胞的一種有效方式。二級淋巴器官中效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量在增殖高峰之后大大下降[35， 38-43]。效應(yīng)T細(xì)胞死亡的分子基礎(chǔ)依抗原刺激的性質(zhì)不同而有不同。在單 次施用抗原后發(fā)生T細(xì)胞反應(yīng)的情況下，所述死亡不依賴Fas、但對Bcl-2 敏感[54],最有可能因生長因子損失(deprivation)而發(fā)生死亡[55]。在長期呈 遞抗原的情況下，有可能發(fā)生TCR介導(dǎo)的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD) [56]。 這種凋亡依賴Fas， 4艮少受Bcl-2抑制[55]。IL-2在AICD中的作用是，阻止FLICE抑制蛋白的活化，所述抑制蛋 白通常抑制Fas信號傳遞[57]。 CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的死亡受炎癥調(diào)節(jié)。在無 炎癥的情況下，二級淋巴器官和非淋巴的器官在增殖高峰之后，其抗原特 異性T細(xì)胞的徹底損失[58]。相反，將抗原與LPS或IL-1等佐劑一起注射 后，更多的細(xì)胞經(jīng)過該損失期之后幸存下來[35, 58， 59]。CD8+記憶T細(xì)胞大多數(shù)效應(yīng)細(xì)胞在增殖高峰之后死亡，但如果抗原最初是在炎癥中呈 遞的，則有一群接觸過該抗原的T細(xì)胞能存活較長時間[52]。在多數(shù)情況下， 可以將記憶細(xì)胞看作是回歸基礎(chǔ)活化狀態(tài)的效應(yīng)細(xì)胞。事實上，有多方面 證據(jù)提示，效應(yīng)細(xì)胞是記憶細(xì)胞的前體細(xì)胞[60, 61]。與CD8+原初T細(xì)胞不同，CD8+記憶T細(xì)胞的存活不依賴MHC I類分 子[62]。雖然大多數(shù)CD8+記憶T細(xì)胞不進(jìn)行循環(huán)，但任何時候都有一小部 分這樣的記憶細(xì)胞以MHC I類分子非依賴性方式進(jìn)行增殖[47, 62]。這種增殖與死亡之間是平衡的，因為在一段時間內(nèi)，抗原特異性CD8+記憶T細(xì)胞 總數(shù)維持不變。有證據(jù)提示，IL-15在此過程中起作用。CD8+記憶T細(xì)胞 的抗原非依賴性增殖因注射IL-15而加速[63]、因注射抗IL-15抗體而^^皮阻 斷[47]。此外，CD8+記憶T細(xì)胞數(shù)量在IL-15缺陷型小鼠中減少[64]。由于 IL-15由非T細(xì)胞在先天性免疫應(yīng)答期間產(chǎn)生，CD8+記憶T細(xì)胞的維持有 可能是響應(yīng)于其它感染而生成IL-15所引起的后果[63， 65]。 前列腺特異性抗原(PSA)前列腺特異性抗原(PSA)是僅由前列腺腺泡和導(dǎo)管內(nèi)壁(lining)的柱狀 上皮細(xì)胞產(chǎn)生的激肽釋放酶(kallikrein)樣絲氨酸蛋白酶[66-68]。 PSA被分泌 到前列腺導(dǎo)管腔中，其在精液(seminal plasma)中濃度非常高，為約0.5-5 mg/ml[69]。從生理學(xué)角度來說，PSA在精液中的作用是，對參與形成凝膠 的主要蛋白，即精膠蛋白(semenogelin) I和II、以及纖連蛋白(fibronectin), 進(jìn)行切割，乂人而增加精子的運動能力[67, 70， 71]。PSA ^皮翻i奪成261個氨基酸的無活性前原PSA (preproPSA)前體。前原 PSA有24個額外殘基，它們構(gòu)成前區(qū)(信號肽)和前肽。釋》文該前肽，則得 到237個氨基酸的成熟胞外形式，它具有酶活性。人的腺性激肽釋放酶2 (hKLK2)與PSA相似，優(yōu)先在前列腺組織中表達(dá)，負(fù)責(zé)前PSA (proPSA)的 活化[72]。 PSA已顯示含有與天冬酰胺-69相連的N連接型寡糖[73]。PSA也釋放到血液中，但濃度較低。在無前列腺癌臨床跡象的健康男 性中，測出的PSA血清濃度常常不到4ng/ml [74-76]。在血液中，酶活性PSA 通過與ar抗胰凝乳蛋白酶(antichymotrypsin,ACT)形成共價連接復(fù)合體而失 活[77, 78]。無酶活性的(內(nèi)部修剪的(internally clipped)) PSA不能與蛋白酶抑 制劑形成復(fù)合體，而是在血液中以游離的、非復(fù)合形式循環(huán)[79]。PSA具有器官特異性，因此它由良性前列腺增生(BPH)組織、原發(fā)性前 列腺癌組織、以及轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織的上皮細(xì)胞產(chǎn)生[66, 80]。事實上， 正常的前列腺上皮細(xì)胞和BPH組織比惡性前列腺組織產(chǎn)生更多的PSA蛋白 [81,82]。因此，PSA不是傳統(tǒng)意義上的在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)量高的腫瘤標(biāo)志物， 反而是，當(dāng)前列腺構(gòu)架因創(chuàng)傷或疾病而致異常時，可以使該酶經(jīng)由毛細(xì)血 管和淋巴管"滲漏，，到基質(zhì)、進(jìn)而"滲漏"到血流中的量增加。PSA在臨床(clinic)的最常見用途是監(jiān)控前列腺癌治療。如果患者接受了 前列腺根除術(shù)(radical prostatectomy), PSA的血清水平需降至測不到的水平，因為所有產(chǎn)生PSA的組織都被切除[83，84]。手術(shù)后PSA濃度升高，表示該 病有復(fù)發(fā)[83， 85, 86]。 PSA也反映前列腺癌患者中放療和抗雄激素(激素)療 法的成功[87-89]。質(zhì)粒DNA抗癌疫苗近年來開發(fā)出了多種腫瘤接種策略。它們中的大多數(shù)有賴于鑒定出可 被免疫系統(tǒng)識別的腫瘤抗原。DNA接種是其中的一種方法，用于誘導(dǎo)抗腫 瘤抗原的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。動物;漠型中的研究證實，用DNA 進(jìn)行接種確實可以激發(fā)抗腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答。但大多數(shù)由人的癌細(xì)胞 表達(dá)的腫瘤抗原免疫原性很弱，它們要求開發(fā)出在臨床應(yīng)用時增強(qiáng)DNA疫 苗效力的策略。下文介紹了一些最新進(jìn)展，它們涉及對DNA疫苗免疫學(xué)的 了解以及用于增加DNA疫苗在CTL活性方面的效力的策略。DNA疫苗的免疫學(xué)DNA疫苗通常是指筒單的質(zhì)粒表達(dá)載體。它包含插入在真核啟動子和 聚腺苷酸化序列之間、編碼目標(biāo)抗原的cDNA，細(xì)菌抗生素抗性基因和細(xì)菌 復(fù)制起點。所述真核啟動子和聚腺苷酸化序列是在哺乳動物細(xì)胞中正確表 達(dá)抗原所必需的，所述抗生素抗性基因和復(fù)制起點使得能夠在細(xì)菌中生成 該載體。在將棵露的質(zhì)粒DNA通過肌肉內(nèi)(i.m.)或皮內(nèi)(i.d.)接種方式施用后，宿 主細(xì)胞攝入所述DNA,產(chǎn)生所編碼的抗原，所述抗原然后成為免疫應(yīng)答的 目標(biāo)[90-93]。體內(nèi)表達(dá)抗原很常見，可用強(qiáng)效病毒啟動子實現(xiàn)，所述的病 毒啟動子具有普遍活性，可以在廣泛多種類型的細(xì)胞中驅(qū)動抗原表達(dá)。常 用的啟動子是人巨細(xì)胞病毒即早期增強(qiáng)子-啟動子(即CMV啟動子)[94]。 DNA接種導(dǎo)致產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptive immune response),這種應(yīng)答包 括調(diào)節(jié)成分，如誘導(dǎo)抗原特異性CD4+輔助T細(xì)胞；還包括效應(yīng)成分，如生 成識別天然抗原的抗體；還包括CD8+細(xì)胞毒效應(yīng)T淋巴細(xì)胞(CTL)。后者 被引導(dǎo)去對抗細(xì)胞表面由I類主要組織相容性分子(MHC I類分子)呈遞的抗 原肽。編碼蛋白抗原的DNA產(chǎn)生CTL應(yīng)答的潛力受到極大關(guān)注，因為用純 化的重組蛋白進(jìn)行免疫不能有效誘導(dǎo)CTL (綜述見[95， 96])。在小鼠中對該 機(jī)制的研究表明，由DNA分子誘導(dǎo)CD4+輔助T細(xì)胞、以及直接活化抗原呈遞細(xì)胞(APC)，是DNA疫苗引發(fā)成功的CTL的原因。有觀點認(rèn)為，后一 種要求在一定程度上是多余的(見下文)。我們在這里概述了一些主要的發(fā)現(xiàn)，它們開始闡明所觀察到的DNA疫 苗的免疫原性。有證據(jù)顯示，DNA接種之后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答由骨髓來源的APC如 樹突細(xì)胞(DC)發(fā)起[97-99]?？梢杂觅|(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染相關(guān)的APC，這導(dǎo)致 在這些細(xì)胞中生成抗原，或者這些細(xì)胞可以拾取由其它細(xì)胞表達(dá)并釋放的 抗原(后一種機(jī)制被稱為交叉呈遞/交叉引發(fā))[100-102]。在上述兩種情況中， 抗原在APC內(nèi)部通過蛋白水解消化而被加工，所得的肽由MHC I類分子呈 遞在所述細(xì)胞表面，用于引發(fā)CD8+原初T細(xì)胞。關(guān)于這兩種機(jī)制哪一種在 體內(nèi)占主要地位仍有爭議，且有可能因DNA給藥方法的不同而不同 [102-104]。然而，對抗原進(jìn)行一些修飾(包括與泛蛋白[105]或熱休克蛋白[106， 107] 連接)，有可能改進(jìn)這些抗原靶向常規(guī)的或交叉引發(fā)的MHCI類分子呈遞途 徑的能力(綜述見[108])。質(zhì)粒DNA骨架顯示包含免疫調(diào)節(jié)性核苷酸序列，這些序列由非曱基化 CpG二核苷酸組成并帶有特定的側(cè)翼核苷酸(稱為CpG基元)[109-111]。由 于真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在CpG 二核苷酸的利用頻率和曱基化模式方面的差 異，這類序列在細(xì)菌DNA中比在哺乳動物DNA中出現(xiàn)頻率高20倍[112， 113]。 CpG基元經(jīng)證實通過Toll-樣受體9 (TLR9)起作用[114]，這種受體在 小鼠的巨噬細(xì)胞、DC和B細(xì)胞上表達(dá)，在人體中僅在漿細(xì)胞樣(plasmacytoid) DC和B細(xì)胞上表達(dá)[115-117]。 TLR9與含CpG的質(zhì)粒DNA之間的直接相 互作用被證實導(dǎo)致上調(diào)APC表面的協(xié)同刺激分子、并誘導(dǎo)由先天免疫系統(tǒng) 的多種細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子IL-12, IL-6， IL-18, TNFa， IFNa/(3和IFNy。APC的活化已知對于有效引發(fā)CD8+原初T細(xì)胞很重要，因此，DNA 疫苗的骨架中存在一些CpG基元被認(rèn)為有助于誘導(dǎo)CTL[122]。意外的是， 對TLR9信號傳遞途徑有缺陷的小鼠(TLR9-A或MyD88V-小鼠)反復(fù)進(jìn)行 DNA免疫接種，結(jié)果在這些小鼠中，盡管未觀察到質(zhì)粒DNA對APC的直 接刺激，仍產(chǎn)生正常的、與在野生型小鼠中同樣的CTL應(yīng)答[123, 124]。這 一發(fā)現(xiàn)提示，CpG基元對APC的活化在應(yīng)用DNA疫苗的情況下可能是多 余的，所必需的APC體內(nèi)活化可能可以間接地通過誘導(dǎo)CD4+輔助T細(xì)胞10而發(fā)生(綜述見[125])。事實上，在CD4+ T細(xì)胞耗盡或CD" T細(xì)胞區(qū)室 (compartment)有缺陷(CD4 -/-或MHC II類分子-A敲除)的小鼠中進(jìn)行的 DNA免疫接種試驗表明，CD4+ T細(xì)胞的存在是生成效應(yīng)CTL應(yīng)答的關(guān)鍵 [126-128]。動物模型中的抗癌DNA疫苗DNA疫苗用于開發(fā)抗腫瘤的保護(hù)性應(yīng)答的用途首先用模型腫瘤抗原在 小鼠中證實。用編碼SV40大T抗原[146]、 |3-半乳糖苷酶[147]、人癌胚抗 原(CEA) [148]、人乳頭瘤病毒E7 [149]或人PSA [150]的質(zhì)粒進(jìn)行DNA免疫 接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能保護(hù)小鼠免受表達(dá)相應(yīng)抗原的同基因(syngeneic)腫瘤細(xì)胞 的致死攻擊。損耗研究(Depletion studies)為CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞在腫瘤 排斥中所起的作用提供了證據(jù)[147， 149]。這些研究總體上表明用DNA疫苗 誘導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答的可行性。但這些研究中所用的 所有抗原事實上都是外來蛋白，它們通常比代表自身抗原的"常規(guī)(regular)" 肺瘤抗原有好得多的免疫原性。目前已建立了多個鼠模型，以便能測試DNA疫苗抵抗與臨床所見抗原 更為相似的腫瘤抗原的效力。這些方法有賴于使用以組織特異性方式表達(dá) 模型腫瘤抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠[151, 152],或測試靶向人腫瘤抗原的鼠對應(yīng)物 的DNA疫苗[153， 154]。P815A抗原是屬于MAGE家族的人腫瘤特異性抗原的鼠等效物[155], 抗該抗原的DNA免疫接種導(dǎo)致誘導(dǎo)CTL、并保護(hù)小鼠免受致死性肺瘤攻擊 [153]。該發(fā)現(xiàn)提示，對于在大多數(shù)正常組織中沉默的天然的腫瘤特異性抗 原，可以很容易地誘導(dǎo)抗所述抗原的T細(xì)胞。而天然產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)抗原則顯示較低的固有免疫原性。雖然編碼人 原癌基因Her2的DNA疫苗在野生型小鼠中很容易地誘導(dǎo)出抗體應(yīng)答，但 同樣是這種疫苗，在Her2轉(zhuǎn)基因小鼠中卻僅誘導(dǎo)出中度抗體應(yīng)答，提供的 是較弱的抗腫瘤的保護(hù)作用[152]。在Her2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行CTL應(yīng)答 也得到類似的結(jié)果。用大鼠"w DNA疫苗進(jìn)行免疫接種，在野生型小鼠中 誘導(dǎo)出保護(hù)性CTL應(yīng)答，但在未觀察到CTL應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物中卻無效 [156]。大鼠wewDNA疫苗在野生型小鼠中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力也許可以解 釋為因"ew-衍生的CTL表位與鼠Her2對應(yīng)物(c-erbB-2)之間的氨基酸差 異所致[156， 157]。因此，能識別wew衍生的表位的CD8+T細(xì)胞存在于野生型小鼠中，但很有可能在"W轉(zhuǎn)基因動物中于胸腺選擇期間被消除或在外周 組織中變得無能。與上述發(fā)現(xiàn)一致，抗鼠黑素細(xì)胞分化抗原TRP-1、 TRP-2 (酪氨酸酶相 關(guān)蛋白)、及gp100的DNA免疫接種也不成功[154, 158, 159]。有趣的是， 這些研究還證實，用編碼TRP-1、 TRP-2、或gp100的異基因(xenogeneic)(人) DNA對小鼠進(jìn)行免疫接種，誘導(dǎo)出抗小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的同基因腫瘤攻 擊的免疫應(yīng)答和保護(hù)作用。這種抗腫瘤免疫力通過接種人TRP-1產(chǎn)生的抗 體來介導(dǎo)，在人TRP-2和gpl00的情況下通過CD8+ T細(xì)胞來介導(dǎo)(綜述見 [160])。這些觀察的一個明顯結(jié)論是，用同基因性質(zhì)的(小鼠)基因進(jìn)行免疫 接種，不誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答或抗體應(yīng)答，而用異基因性質(zhì)的(人)基因進(jìn)行免疫 接種，可以導(dǎo)致生成能識別人蛋白和小鼠蛋白兩者的抗體和CTL。在CTL 應(yīng)答中，這種交叉反應(yīng)性的機(jī)制在gpl00的情況中代表的是，在人序列中 隨機(jī)生成畸形表位(heteroclitic epitope),而這種表位與MHC I類抗原有更好 的結(jié)合[161]。因此，編碼人gp100的DNA疫苗誘導(dǎo)出抵抗這種"人"表位、 并能識別相應(yīng)的鼠內(nèi)源序列("鼠"表位)的CD8+T細(xì)胞[159, 162]。在交叉反 應(yīng)性抗體應(yīng)答的情況中，認(rèn)為在異基因序列內(nèi)部存在強(qiáng)效的輔助性表位 [163]。為此，在動物模型中進(jìn)行了一些DNA疫苗研究，在抗腫瘤的保護(hù)作 用方面得到了令人鼓舞的結(jié)果。將DNA疫苗用作治療性工具雖然更反映臨 床實際情況，但仍有一些問題有待解決。如果能更進(jìn)一步了解T細(xì)胞在胸 腺內(nèi)成熟期間形成多樣化T細(xì)胞庫(T cell r印ertoire)的機(jī)制，并作出"自身" 腫瘤抗原反應(yīng)性CTL的真實的表位特異性圖譜，將有助于合理設(shè)計能誘導(dǎo)DNA疫苗的增強(qiáng)效力小鼠中的研究表明，DNA疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性CTL的頻率比病毒誘 導(dǎo)的應(yīng)答低大約10倍，而且，單次DNA接種之后的初次效應(yīng)性CTL應(yīng)答 略有延遲，在接種后的12-15天達(dá)到峰值[164， 165]。初次CTL應(yīng)答中的這 些定性差異可部分地歸結(jié)于質(zhì)粒DNA接種后產(chǎn)生的抗原量較小[90]、和 APC的無效體內(nèi)耙向，這兩方面總和都不足以確保充分引發(fā)原初T細(xì)胞并 使其擴(kuò)增(expansion)。現(xiàn)已開發(fā)出多種遞送DNA的方法，它們與常用的i.m.或i.d.注射DNA 鹽水溶液的方法相比，產(chǎn)生更多的抗原和/或改進(jìn)APC的體內(nèi)靶向。這些技術(shù)包括，將包被有DNA的金粒通過生物射彈方式接種到皮膚中、靶向常駐 的抗原呈遞性朗漢細(xì)胞(Langerhans cell)(也稱"基因槍，，技術(shù))[91, 102]，使用 陽離子性質(zhì)的、表面吸附有DNA的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)孩t粒 [166， 167],經(jīng)i.m.或i.d.注射DNA后向注射部位施加月永沖電場(也稱體內(nèi)電 穿孔)[168-171]。值得注意的是，將棵露DNA直接注射到外周淋巴結(jié)中被 證實誘導(dǎo)出強(qiáng)CTL應(yīng)答，質(zhì)和量都比常規(guī)的i.m.或i.d.接種途徑好[172]。該 發(fā)現(xiàn)提示，DNA免疫接種后引發(fā)原初T細(xì)胞的效力與二級淋巴器官中抗原 刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時間有關(guān)。強(qiáng)。已知對DNA編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化可以在接種DNA之后增加抗原 表達(dá)，從而獲得更好的抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答[173, 174]。將抗原與泛蛋白單 體連接[105]或與熱休克蛋白連接[106, 175]增強(qiáng)抗原特異性CTL應(yīng)答，這大 概是由于改進(jìn)了這些融合蛋白對常規(guī)的或交叉引發(fā)的MHC I類呈遞途徑的 靶向性。使DNA疫苗對免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)最優(yōu)化的另 一策略是基于以下事實對 CD4+輔助T細(xì)胞的誘導(dǎo)明顯導(dǎo)致產(chǎn)生效應(yīng)CTL和抗體應(yīng)答(見4.1節(jié))。通 過將腫瘤抗原與含有強(qiáng)效輔助表位的微生物抗原或病毒抗原連接來提供 CD4+ T細(xì)胞輔助作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種DNA后，增強(qiáng)了抗體應(yīng)答和CTL 應(yīng)答(綜述見[176])。重要的是要注意，設(shè)計這類肺瘤抗原-"輔助"抗原融合 體以達(dá)到增強(qiáng)腫瘤抗原特異性CTL應(yīng)答的目的時，需要考慮其它方面。在 自然狀態(tài)下，CTL應(yīng)答集中針對大分子抗原上非常少的一些肽表位，已知 這是免疫優(yōu)勢現(xiàn)象，用DNA疫苗也可以觀察到這種現(xiàn)象[177， 178]。因此， 為確保CTL應(yīng)答抵抗腫瘤抗原衍生的表位而不是"輔助"抗原衍生的表位， 應(yīng)去除融合體中"輔助"部分的所有潛在CTL表位[179, 180]。雖然最近在TLR9-A和MyD88-A小鼠中進(jìn)行的研究表明，質(zhì)粒DNA骨 架對APC的活化并非誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所絕對必需[123, 124],但CpG介導(dǎo)的對 APC的刺激可以為DNA疫苗提供一定程度的佐劑效應(yīng)。經(jīng)證實，以合成的 寡核香酸形式提供的CpG基元(CpG-ODN)作為佐劑，在接種DNA后，促 進(jìn)更好的抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答(綜述見[181])。 CpG-ODN的這種佐劑效應(yīng)在 DNA疫苗用量低時具有深遠(yuǎn)意義，但在DNA疫苗用量較高時僅有適度的意義[182]。重要的是應(yīng)強(qiáng)調(diào)，在小鼠中提供最佳免疫刺激活性的CpG-ODN 與在靈長類中起作用的那些CpG-ODN相比有序列差異[183]。其它多種增強(qiáng)DNA疫苗效力的策略集中于使用多種免疫刺激分子，包 括細(xì)胞因子和協(xié)同刺激分子(綜述見[184, 185])。這些佐劑可以以重組蛋白或 另一個編碼所選分子的質(zhì)粒的形式施用。這類方法的基本原理一般是基于， 由細(xì)胞因子/協(xié)同刺激分子提供額外信號來促進(jìn)對T細(xì)胞的引發(fā)，這在單獨 施用質(zhì)粒DNA疫苗時可能不是最理想的。成功應(yīng)用該方法的實例包括，在 經(jīng)CEA編碼質(zhì)粒和IL-12表達(dá)質(zhì)粒免疫的小鼠中增強(qiáng)抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答、 導(dǎo)致產(chǎn)生更好的抗腫瘤攻擊的保護(hù)作用[186],在將編碼抗原的DNA疫苗和 表達(dá)鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的質(zhì)粒共同施用 (co-administration)之后，增強(qiáng)抗體應(yīng)答/CTL應(yīng)答[187]， [188]。雖然上文提及的所有策略總體上都顯示增加編碼模型抗原的DNA疫苗 的免疫原性，但其中無一種策略已被穩(wěn)定確認(rèn)為，在相應(yīng)鼠模型中、以及 更重要的是在臨床試驗中，在針對免疫原性弱的"自身"腫瘤抗原進(jìn)行DNA 免疫之后，可以更好地引發(fā)CTL應(yīng)答或抗體應(yīng)答。抗癌DNA疫苗在臨床試—瞼中我們在此介紹數(shù)個近期實施的抗患者體內(nèi)肺瘤相關(guān)抗原的DNA接種I 期臨床試驗，所述患者是患有以下疾病的患者與HPV相關(guān)的肛門發(fā)育不 良[213],轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[212],B細(xì)胞淋巴瘤[214],轉(zhuǎn)移性黑素瘤[215,216], 以及前列腺癌[211,217]。在這些研究中，用到了多個不同的DNA遞送技術(shù) 和佐劑，它們代表了 DNA接種領(lǐng)域的最新進(jìn)展。這些試驗的大多數(shù)都后隨標(biāo)準(zhǔn)劑量擴(kuò)大方案(standard dose escalation scheme),在單個患者中未擴(kuò)大DNA疫苗劑量。DNA接種以單一療法的形 式進(jìn)行，患者在參加試驗之前的至少3周內(nèi)未接受任何其它形式的治療， 例外的是在前列腺癌的研究中，患者同時接受激素治療[217]。由于加入到這些試驗中的患者數(shù)有限，所有這些研究的幾個主要目的 是，評估質(zhì)粒DNA給藥的安全性，監(jiān)控所述疫苗誘導(dǎo)出的劑量依賴性免疫 應(yīng)答，以及評估疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與臨床益處之間的關(guān)聯(lián)性。這些試驗總體上表明，反復(fù)接種DNA的耐受性很好，未觀察到引起毒 性作用的劑量限制點，甚至當(dāng)DNA劑量高達(dá)每次注射2 mg時也未產(chǎn)生毒 性[212]，這說明，用DNA進(jìn)行反復(fù)免疫接種是安全的。在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面，結(jié)果表明，"外來"抗原具有比"自身，，腫瘤相關(guān)抗原更強(qiáng)的免疫原性。用編碼人乳頭瘤病毒E7-衍生的CTL表位的DNA疫苗 進(jìn)行免疫接種，在12例患者的10例中，通過IFNy ELISPOT試驗觀察到， 疫苗誘導(dǎo)出T細(xì)胞應(yīng)答[213]。編碼CEA和乙肝病毒表面抗原(HbsAg-在該 試驗中作為對照"外來"抗原)的二元表達(dá)載體，經(jīng)反復(fù)免疫接種之后，在8 例患者中有6例誘導(dǎo)出HbsAg特異性抗體應(yīng)答[212]。另外，用編碼嵌合免 疫球蛋白(Ig)分子的質(zhì)粒DNA接種，在12例患者中有8例觀察到抗鼠Ig 恒定區(qū)的淋巴增生性應(yīng)答或抗體應(yīng)答[214]。而抗自體肺瘤相關(guān)抗原的免疫 應(yīng)答水平相對較低。在上述研究中，未觀察到CEA特異性抗體應(yīng)答，17例 患者中僅4例出現(xiàn)抗CEA的淋巴增生性應(yīng)答，但所述應(yīng)答未顯示出與質(zhì)粒 DNA接種量或接種時間有明確的關(guān)聯(lián)性[212]。同樣，用嵌合Ig分子進(jìn)行的 免疫接種中，12例患者僅有1例產(chǎn)生抗自體腫瘤衍生的獨特型(Id)決定簇的 短時T細(xì)胞應(yīng)答[214]。在用編碼改良gp100抗原的DNA免疫接種的黑素瘤 患者中，檢測到抗gp 100衍生的HLA-A2限制性CTL表位的CTL應(yīng)答[215], 而在此前進(jìn)行的研究中，用編碼相同DNA構(gòu)建物的重組禽痘病毒(fowl poxvirus),在14例患者中發(fā)現(xiàn)4例誘導(dǎo)出CTL活性[218]。將編碼酪氨酸酶 衍生的HLA-A2限制性新表位的質(zhì)粒DNA注入黑素瘤患者淋巴結(jié)中，共24 例患者有11例觀察到抗該表位的短時CTL應(yīng)答[216].在DNA疫苗和表達(dá)PSMA的重組腺病毒反復(fù)聯(lián)用的研究中，所有患者 都最終對注射PSMA質(zhì)粒DNA產(chǎn)生陽性DTH應(yīng)答，說明誘導(dǎo)出了抗PSMA 的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但這些結(jié)果并未用其它常規(guī)體外試驗加以證實[217]。我們最近在患有用激素難以控制的前列腺癌的患者中進(jìn)行DNA接種的 臨床試驗，共9例患者有2例觀察到PSA特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，這2人 都在接受最高DNA測試劑量的組中[211]。這些研究有多個都觀察到抗腫瘤 相關(guān)抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的劑量依賴性誘導(dǎo)傾向[211, 214],但這些反應(yīng) 性T細(xì)胞的表位特異性仍有待確認(rèn)，以便確認(rèn)有CTL的存在。將DNA接種作為單一療法的臨床益處僅為中度，包括1例B細(xì)胞淋 巴瘤患者骨髓中腫瘤消退[214]， 3例嚴(yán)重肛門生殖器發(fā)育不良(high-grade anogenital dysplasia)患者獲得部分組織學(xué)應(yīng)答[213]， 2例前列腺癌患者因 PSA血清水平降低而被判定為病情穩(wěn)定[211], 11例檢查到抗酪氨酸酶免疫 應(yīng)答的黑素瘤患者比13例無免疫應(yīng)答的患者存活更好[216]。臨床益處與疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)性僅在上述的后兩項研究中觀察到[211,216]。總之，DNA反復(fù)接種已表明是良好且安全的臨床方案，即使在DNA 高劑量(處于1 mg水平)時也是如此，而這似乎是在人體內(nèi)誘導(dǎo)出T細(xì)胞免 疫應(yīng)答所必需的。應(yīng)答頻率低可能是部分地由于參與試驗的晚期患者免疫 受損的狀態(tài)所致。此后的臨床試驗可以集中在緩解期的患者或疾病殘留最 少的患者，在這些患者身上更有可能發(fā)現(xiàn)DNA疫苗的顯著臨床益處。異基因疫苗一般外來抗原比自身抗原更易誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。由于這個原因，使抗原 盡可能是外來抗原但仍誘導(dǎo)抗自身蛋白的免疫力是比較有幫助的。實現(xiàn)這 一點的一個策略是，將外來蛋白附著在天然自身蛋白上。這方面常用的蛋 白是匙孔^>>藍(lán)蛋白(keyhole lymphet cyanogens, KLH)。誘導(dǎo)抗KLH的免 疫應(yīng)答時常常也誘導(dǎo)出對所附著的蛋白的免疫應(yīng)答。另 一策略是使用與天然自身蛋白類似但來自另 一動物物種的蛋白。它 被稱為異基因蛋白。這已經(jīng)用被稱為前列腺特異性膜抗原(PSMA)的前列腺 抗原實現(xiàn)了 。 Wolchok等在小鼠中使用PSMA并誘導(dǎo)出抗小鼠PSMA的良 好免疫應(yīng)答。目前已有將嚙齒類異基因PSMA用于人的臨床試驗。應(yīng)用異基因蛋白的策略已在其它物種中使用。有人用人酪氨酸酶免疫 患黑素瘤的狗。 一般而言，選出的物種之間有很大差異。已有多篇文獻(xiàn)描述了異基因或異基因抗原用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的用途。 其中包括異種抗原的意外或未被承認(rèn)的用途，如將人PSA用于小鼠中。還 包括審慎使用(deliberate use)異種抗原。 一個審慎使用異種抗原的實例是， 用作為抗黑素瘤疫苗的人抗原對狗進(jìn)行免疫4妄種(Bergman et al, 2003, Long-term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA vaccination with xenogeneic human tyrosinase: a phase 1 trial, Clinical Cancer Research, 9:1284-1290)。這些文獻(xiàn)并未描述，用與天然蛋白之間有最小種間 差異的異基因蛋白來誘導(dǎo)抗該天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答。人PSA蛋白于二十世紀(jì)七十年代被發(fā)現(xiàn)并被筌定。PSA蛋白于1979 年首次被純化。從所分析的蛋白和組織制得抗兔血清。人PSA僅見于前列 ^i且織，未見于其它纟且織(^Wang et al Purification of a human prostate specific antigen 1979, Invest. Urol. 17:159-63)。另有人發(fā)現(xiàn)，人PSA在其它組織中有類似的含量。該蛋白在肺癌和乳腺癌的上皮樣細(xì)胞中以低水平表達(dá)(Zarghami et al Frequency of expression of prostate-specific antigen mRNA in lung tumors, 1997 Am J Clin Pathol 108(2): 184-90; Smith et al Prostate-specific antigen messenger RNA is expressed in non-prostate cells: implications for detection of micrometastases 1995 Cancer Res. 55(12》2640-44》人前列腺特異性抗原的基因在1989年被測序(Digby et al Human prostate specific antigen (PSA) gene: structure and linkage to kallifrein-like gene 1989 Nucleic Acids Research, 17(5》2137; Klobeck et al, Genome sequence of human prostate specific antigen, 1989 nucleic Acids Research 17(10》3981)。人(Homo Sapiens) PSA的cDNA序列在Genebank中有記錄。其中一個 序列為Genebank登錄號AJ459783,另 一個序列于1988年公開，為Genebank 登錄號X07730 (Schultz et al. S叫職ce of a cDNA clone encompassing the complete mature human Prostate specific Antigen (PSA) and an unspliced leader sequence; 1988 Nucleic Acids Research 16(13):6226)。人cDNA的另 一個序 列為Genebank登錄號BC056665。非人靈長類動物食蟹猴(Macaca/aw'cw/(2nX)的前列腺特異性抗原前體的 cDNA序列為Genebank登錄號AY647976。獼猴(Macaca mw/^to)的前列腺特異性抗原的cDNA序列為Genebank登 錄號X73560。比較以上3種基因發(fā)現(xiàn)，人PSA與獼猴或與食蟹猴的PSAcDNA有30 個堿基對不同。即有3.8%的差異。因此，獼猴PSA與人PSA相比的氨基酸 差異為9.9%，食蟹猴PSA與人PSA相比的氨基酸差異為10.7%。附圖中有3頁是DNA序列比較(圖1A, 1B和1C),其顯示了人PSA的 cDNA序列(Genebank登錄號為BC056665的cDNA)，獼猴PSA的cDNA 序列，以及食蟹猴PSA的cDNA序列之間的同源性。除了上述科技文獻(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)下列相關(guān)專利和已公開的專利申請。已公開的美國專利申請20040141958披露了治療性疫苗接種的新方法， 并討論了自身肽或帶有呈遞外來肽的CTL表位的蛋白的用途。這是一種嵌 合蛋白。該申請未提及將完整外來蛋白用于誘導(dǎo)抗天然蛋白的交叉免疫力 的用途。美國專利5，925，362披露了用人前列腺特異性抗原激發(fā)抗腫瘤應(yīng)答的 方法。該專利描述了需有兩個部分的一種前列腺癌疫苗。 一個部分是PSA， 另一個部分是用于原位產(chǎn)生人PSA的表達(dá)系統(tǒng)。這是表達(dá)人PSA的DNA 疫苗。該專利未描述異基因PSADNA疫苗的用途。美國專利6,165,460披露了產(chǎn)生抗人前列腺特異性抗原(PSA)的免疫應(yīng) 答。該專利描述了 PSADNA疫苗。其中一個權(quán)利要求限定了用于表達(dá)PSA 的痘病毒載體。它未特別指明人PSA，也未提到異基因PSA。另一權(quán)利要 求涉及使用PSA(或PSACTL表位)、之后再次給予PSA。這是傳統(tǒng)的疫苗 加強(qiáng)策略，包括用表達(dá)另 一種PSA的載體或用PSA蛋白本身進(jìn)行加強(qiáng)免疫。 還有一個權(quán)利要求提及單獨使用CTL表位。用于評價該疫苗的動物模型是 使用人PSA的獼猴模型，但未提及反過來將獼猴PSA用于人的方法。美國專利6,818,751; 6,800,746; 6,759,515; 6,664,377; 6,657,056; 6,630,305; 6,620,922; 6,613,872; 6,329,505; 6,262,245; 6,261,562; 5,854,206都 描述了用前列腺特異性肽診斷前列腺癌，產(chǎn)生抗所述肽的抗體，以及對前 列腺癌進(jìn)行免疫治療。但它們并未描述將異基因PSA用作免疫原。美國專利6,699,483披露了癌癥治療，其中在前列腺癌疫苗中用到三種 人前列腺癌細(xì)胞系。這些細(xì)胞系都是人的細(xì)胞系，它們呈現(xiàn)寬范圍內(nèi)的多 種抗原。該專利未描述異基因細(xì)胞系，異基因PSA的用途或DNA疫苗的 用途。從上文可看出，文獻(xiàn)中已描述了很多種涉及疫苗的方法，包括異基因 的方法。為本發(fā)明的目的，對相關(guān)觀點進(jìn)行簡要綜述。已知將非人抗原引入人體后，人的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗該非人抗原的抗體。據(jù)信，在一些特例中，將病例特異性非人抗原引入人體后，人的免疫 應(yīng)答產(chǎn)生抗類似的病例特異性人抗原的抗體。只有靈長類有前列腺特異性抗原(PSA)。人有人PSA,非人靈長類有非 人靈長類PSA。象小鼠和狗這樣的物種有激肽釋放酶蛋白類的絲氨酸蛋白 酶，但它們與PSA有明顯區(qū)別，因而不會被視為PSA。非人靈長類很多，其中包括獼猴和黑猩猩。人PSA有約260個氨基酸(見圖2的"huPSA");獼猴PSA有約260個氨 基酸(見圖2的"rhPSA")。獼猴PSA氨基酸序列中有約10。/。的氨基酸與人PSA 氨基酸序列不同。盡管人PSA與異基因PSA如獼猴PSA之間存在相似性，人PSA與獼 猴PSA之間的差異仍很顯著，以致于檢測人PSA的實驗室測試不會檢測出 異基因PSA如獼猴PSA。具體到人前列腺癌，對其進(jìn)行的治療涉及外科手術(shù)切除整個前列腺。 進(jìn)一步的治療包括，嘗試破壞經(jīng)手術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞。為此，應(yīng) 將疫苗設(shè)計成能殺滅所有經(jīng)手術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞。人前列腺細(xì)胞產(chǎn)生人PSA，而抗人前列腺癌的疫苗應(yīng)引發(fā)人免疫應(yīng)答， 導(dǎo)致殺滅產(chǎn)生人PSA的人細(xì)胞。這樣一來，因接種抗人前列腺癌的疫苗， 可以殺滅經(jīng)手術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人的導(dǎo)致本發(fā)明的一個發(fā)現(xiàn)是，最好是 在人體中使用異基因抗原(例如蛋白)，且所用的異基因抗原與人自身抗原的 種間差異相對較少，以便在該人體內(nèi)誘導(dǎo)出抗其天然自身抗原的最佳免疫 應(yīng)答。本發(fā)明人的導(dǎo)致本發(fā)明的另一發(fā)現(xiàn)是，最好在人體中使用非人靈長類 異基因抗原(例如蛋白)，且所用的非人靈長類異基因抗原與人自身抗原的種 間差異相對較少，以便在該人體內(nèi)誘導(dǎo)出抗其天然自身抗原的最佳免疫應(yīng) 答。本發(fā)明人的導(dǎo)致本發(fā)明的另一特別發(fā)現(xiàn)是，最好在人體中使用非人靈 長類異基因PSA抗原，且所用的非人靈長類異基因PSA抗原與人自身PSA 抗原的種間差異相對較少，以便在該人體內(nèi)誘導(dǎo)出抗其天然自身PSA抗原 的最佳免疫應(yīng)答。本發(fā)明人的導(dǎo)致本發(fā)明的另 一更特別發(fā)現(xiàn)是，最好提供一種在人體中 誘導(dǎo)出抗人PSA的免疫應(yīng)答的方法，其使用與人PSA有三88°/。且598°/。的氨 基酸同源性(或差別為2-12。/。)的非人PSA。更具體地，所述方法包括獲得從非人靈長類分離出的PSA,對該非人 靈長類PSA進(jìn)行分子水平的改造，以將其與人PSA之間的氨基酸同源性調(diào) 整至最佳平衡點。更具體地，最好是提供最佳同源性平衡點，使得該非人 靈長類PSA與人PSA有足夠的氨基酸序列差異以在該人體中誘導(dǎo)出抗該非19人靈長類PSA的免疫應(yīng)答、但同時也使得該非人靈長類PSA與人PSA有足本發(fā)明還包括DNA序列，所述序列的表達(dá)產(chǎn)生出的蛋白具有與人PSA 88-98%同源性的氨基酸序列。本發(fā)明還包括所述DNA序列在多核苷酸疫苗 如DNA或RNA疫苗中的用途。使用非人靈長類PSA而不是人工制備的PSA的基本原理是，在對蛋白 進(jìn)行的維持絲氨酸蛋白酶活性的天然選擇中所作的所有改變選出具有相似 構(gòu)象的蛋白。這意味著，針對這種蛋白上構(gòu)象依賴性區(qū)域的免疫應(yīng)答在人 和靈長類的異基因PSA之間更有可能相似或相同。根據(jù)本發(fā)明，遞送疫苗可采用多種方法，包括例如，在有轉(zhuǎn)染的化學(xué) 增強(qiáng)劑的情況下進(jìn)行注射，生物射彈方法，或電穿孔。因此，盡管上述現(xiàn)有技術(shù)表明，在非人動物模型中用異基因抗原激起 一些免疫應(yīng)答是已知的，上述現(xiàn)有技術(shù)并未教導(dǎo)或披露具有以下想要的特 性的涉及抗前列腺癌疫苗的方法和組合物(l)抗前列腺的疫苗，其被設(shè)計 為能殺滅經(jīng)手術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞；(2)引發(fā)人免疫應(yīng)答，以殺滅產(chǎn) 生人PSA的人細(xì)胞；(3)不限于激素療法；(4)在人體中使用異基因抗原(例 如蛋白)，且所述異基因抗原與人自身抗原之間具有較少種間差異，以便在 人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答；(5)在人體中使用非人靈 長類異基因抗原(例如蛋白)，且所述非人靈長類異基因抗原與人自身抗原之 間具有較少種間差異，以便在人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身抗原的最佳免疫 應(yīng)答；和(6)在人體中使用非人靈長類異基因PSA抗原，且所述非人靈長 類異基因PSA抗原與人自身PSA抗原之間具有較少種間差異，以便在人體 中誘導(dǎo)出抗人天然自身PSA抗原的最佳免疫應(yīng)答。上述想要的特性由本發(fā) 明與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的獨特方法和組合物提供，可參見以下詳述。 本發(fā)明的其它優(yōu)點也可從以下的描述中看出。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明 一 個目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和 組合物，其經(jīng)設(shè)計能殺滅所有經(jīng)手術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞。本發(fā)明另 一 目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和本發(fā)明另 一 目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和 組合物，其不限于激素療法。本發(fā)明另 一 目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和 組合物，其在人體中使用異基因抗原(例如蛋白)，且所述異基因抗原與人自 身抗原之間具有較少種間差異，以便在人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身抗原的 最佳免疫應(yīng)答。本發(fā)明另 一 目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和 組合物，其在人體中使用非人靈長類異基因抗原(例如蛋白)，且所述非人靈 長類異基因抗原與人自身抗原之間具有較少種間差異，以便在人體中誘導(dǎo) 出抗人天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答。本發(fā)明另 一 目標(biāo)是，提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的新的改進(jìn)方法和 組合物，其在人體中使用非人靈長類異基因PSA抗原，且所述非人靈長類異基因PSA抗原與人自身PSA抗原之間具有較少種間差異，以便在人體中 誘導(dǎo)出抗人天然自身PSA抗原的最佳免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種組合物，其包括非人靈長類PSA和 用于人的可藥用載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種人用疫苗，其包含非人靈長類PSA 用于人的可藥用載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種疫苗，其中的非人靈長類PSA引發(fā) 人免疫應(yīng)答，該應(yīng)答產(chǎn)生抗人PSA的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，將非人靈長類PSA用于制備人用疫苗以提供 抗人PSA的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種疫苗，其中的人免疫應(yīng)答導(dǎo)致對包 含人PSA的人細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的方法，包括將非人靈長類DNA 序列引入人體中以給該人體提供人靈長類PSA的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用非人靈長類DNA序列提供抗原，用于制備 人用疫苗以在人體中提供抗該抗原的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的另 一 方面， 將非人靈長類PSA DNA序列用于制備人用疫苗以在人體中提供抗人PSA 的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，包括將非人 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，包括將非人靈長類PSA引入人體的步驟，其中人免疫應(yīng)答導(dǎo)致產(chǎn)生抗人PSA的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，包括將非人 靈長類PSA引入人體引發(fā)免疫應(yīng)答的步驟，所述應(yīng)答包括對抗含有人PSA 的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，包括將非人 靈長類PSA引入人體的步驟，其中的人免疫應(yīng)答導(dǎo)致對抗含有人PSA的T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供遞送核酸疫苗的方法，所述疫苗在人的 細(xì)胞中表達(dá)非人靈長類抗原，所述方法包括，將一定量(a quantity of)的所述 核酸疫苗施用到人的組織，并對所述人組織施加電場，從而使表達(dá)非人靈 長類抗原的所述核酸疫苗被遞送到所述人組織的細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供遞送核酸疫苗的方法，所述疫苗在人的 細(xì)胞中表達(dá)非人靈長類PSA,所述方法包括，將一定量(a quantity of)的所述 核酸疫苗施用到人的組織，并對所述人組織施加電場，,人而使表達(dá)非人靈 長類PSA的所述核酸疫苗被遞送到所述人組織的細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供人用DNA疫苗，其包括從非人靈長類PSA 的基因衍生的基因序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方 法，其包括將非人PSA引入人體的步驟，其中所述非人PSA具有與人PSA 的氨基酸同源性，所述同源性在等于或大于88%、且等于或小于98%的范 圍。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方PSA基因序列在該人體中表達(dá)為非人PSA。所引入的非人基因序列與從人 PSA基因衍生的基因序列有堿基同源性，所述同源性在等于或大于88%、 且小于或等于98%的范圍。優(yōu)選地，權(quán)利要求18的方法。所述同源性在等 于或大于92%、且小于或等于99%的范圍。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)非人靈長類抗原的載體的用途，其 用于制備人用疫苗以提供抗人抗原的免疫應(yīng)答。
一方面，所述載體可以是DNA載體。另一方面，所述載體可以是RNA載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)非人靈長類PSA的載體的用途，其 用于制備人用疫苗以提供抗人PSA的免疫應(yīng)答。 一方面，所述載體可以是 DNA載體。另一方面，所述載體可以是RNA載體。本發(fā)明的上述目標(biāo)和其它目標(biāo)，以及使本發(fā)明具有新穎性的多個特征， 都在構(gòu)成本說明書一部分的所附權(quán)利要求書中具體化。為了更好地理解本 發(fā)明，其操作優(yōu)點和其應(yīng)用所獲得的具體目標(biāo)，請參考附圖和說明書，它 們舉例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。


參考以下的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明和上述目的，以及除了 上文描述的以外的其它目的。這些描述可參考附圖進(jìn)行理解，在附圖中圖1A、 1B、和1C顯示已知的cDNA的比較，所述cDNA是人PSA 的cDNA，獼猴的非人靈長類PSA cDNA，以及食蟹猴的非人靈長類PSA cDNA。圖2顯示，人PSA有261個氨基酸(第一部分中的"huPSA");獼猴PSA 有261個氨基酸(第一部分中的"rhPSA")。圖2還顯示，人PSA的DNA序 列有786個核苷酸(第二部分中的"huPSA", Genebank登錄號# X73560);獼 猴PSA的DNA序列有786個核苷酸(第二部分中的"rhPSA", Genebank登錄 號# X07730)。圖3顯示獼猴PSA在人樹突細(xì)胞中的表達(dá)，所述細(xì)胞已用pVAX/rhPSA (表達(dá)獼猴PSA的質(zhì)粒)和對照質(zhì)粒(pVAX)轉(zhuǎn)導(dǎo)。的刺激的應(yīng)答。 實施方式本發(fā)明提供了在人體中使用異基因抗原(例如蛋白)的方法和裝置，所述 異基因抗原與人自身抗原之間具有較少種間差異，以便在該人體中誘導(dǎo)出 抗人天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答。相關(guān)種間差異見圖1A, 1B, 1C和2。根據(jù)本發(fā)明一個方面，提供了組合物，其包含非人靈長類PSA和用于 人的可藥用載體。參見下文實施例1。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了人用疫苗，其包含非人靈長類PSA和用于人的可藥用載體。參見下文實施例1。 實施例1這里描述制備疫苗制劑的步驟，所述制劑包含重組非人靈長類PSA。 包含重組非人靈長類PSA的疫苗制劑可以用標(biāo)準(zhǔn)的疫苗佐劑來配制。一種制劑可以含有卯mg抗原(重組獼猴PSA)， 0.7 mg/ml鋁，和140 mM氯化鈉。該制劑可以用以下方法制備 先制得三種溶液。第一，制得2.1 mg/ml氫氧化鋁混合物，方法是將鋁膠(Alhydrogel,來 自 Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury NY)用 10 mM MOPS緩沖液(pH7.4)稀釋，使鋁的終濃度為2.1%?；旌衔镏械匿X膠用量參 考該鋁膠附帶的說明書(insert)來確定。第二，將重組獼猴PSA在lOmMMOPS緩沖液中稀釋至終濃度為270 mg/ml。第三，制得3%氯化鈉(420 mM)的水溶液。將第一種溶液和第二種溶液(鋁膠和重組獼猴PSA溶液)等量(例如各1 ml)混合。將該混合物在4。C上下顛倒30分鐘進(jìn)行溫和混合。最后，加入與該混合物中鋁膠溶液等量(例如1 ml)的氯化鈉，以稀釋該 疫苗混合物，并使氯化鈉濃度達(dá)到140mM。這樣最終制得的疫苗混合物為 組合物，其中包含非人靈長類PSA和用于人的可藥用載體。實施例1所用的重組獼猴PSA通過在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組獼猴PSA 蛋白而制得。簡言之，將rhPSA基因序列以與his標(biāo)簽序列和蛋白信號裂解 位點的序列形成的融合基因形式克隆到桿狀病毒中。通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生 重組rhPSA蛋白。制劑中所用的重組rhPSA蛋白用親和層析從被桿狀病毒感染的昆蟲 細(xì)胞的裂解物中純化出，然后進(jìn)行his標(biāo)簽的蛋白裂解，大小排阻層析，以 及基于序列分析的重折疊。所述序列分析可以在尿素濃度遞減的緩沖液中 進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種疫苗，其中的非人靈長類PSA引發(fā) 人免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答產(chǎn)生抗人PSA的抗體。參見以上的實施例l。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，將非人靈長類PSA用于制備人用疫苗以提供 抗人PSA的免疫應(yīng)答。參見以上的實施例1 。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種疫苗，其中人免疫應(yīng)答導(dǎo)致抗包含 人PSA的人細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。參見以上的實施例l。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，治療人的方法包括將含有非人靈長類DNA序 列的載體引入人體、以便在該人體中表達(dá)非人靈長類PSA的步驟。所述載 體可以是DNA或RNA載體。載體的例子有，哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒，病毒RNA 或DNA， mRNA或其它核酸構(gòu)建體，它們引入哺乳動物細(xì)胞后導(dǎo)致非人靈 長類PSA的表達(dá)。參見以下的實施例2。實施例2在一個方法中，制得DNA疫苗，其含有在CMV啟動子控制下表達(dá)非 人靈長類PSA的質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有生成該質(zhì)粒所必需的其它DNA序列如細(xì) 菌復(fù)制起點，以及抗生素抗性基因如卡那霉素抗性基因。將該質(zhì)粒在合適 的載體中混合至0.5-5嗎/pl的濃度，所述載體如半強(qiáng)度磷酸緩沖鹽水(half strength phosphate buffered saline)。為了進(jìn)4亍施用，將所述載體混合物裝i真 到帶有半英寸長的27號針頭的結(jié)核菌素型注射器(tuberculin type syringe) 中。在三角肌以上部位或在前臂，皮內(nèi)注射20-50 )il所述質(zhì)?；旌衔铩Ｈ缓?，將帶有兩排針(針的直徑0.3mm，排間距4mm， l排內(nèi)的針間距 1 mm, 1排有4個針，針長3 mm)的電極插入皮內(nèi)2-3 mm深處，使該注射 部位每一側(cè)有1排針。然后對所插入的電極施加電穿孔脈沖。 一個脈沖組 是2個1125 V/cm的脈沖(50微秒的持續(xù)時間(duration),脈沖之間間歇0.125 秒)，0.5秒之后為8個275 V/cm的脈沖(10毫秒的持續(xù)時間，脈沖之間間歇 0.125秒)。根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，將包含非人靈長類DNA序列的載體用于制備 人用疫苗以便在人體中提供抗該抗原的免疫應(yīng)答。參見以上的實施例2。根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，將包含非人靈長類DNA序列的載體用于制備 人用疫苗以便提供抗人PSA的免疫應(yīng)答。參見以上的實施例2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，其包括將非 人靈長類PSA引入人體以引發(fā)人免疫應(yīng)答的步驟，所述應(yīng)答產(chǎn)生抗人PSA25的抗體。參見以上的實施例1和2關(guān)于非人靈長類PSA和表達(dá)非人PSA的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，其包括將非導(dǎo)致產(chǎn)生抗人PSA的抗體。參見以上的實施例1和2關(guān)于非人靈長類PSA 和表達(dá)非人PSA的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，其包括將非 人靈長類PSA或表達(dá)非人PSA的載體引入人體以引發(fā)免疫應(yīng)答的步驟，所 述應(yīng)答包括對抗含有人PSA的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。參 見以上的實施例1和2關(guān)于非人靈長類PSA和表達(dá)非人PSA的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供治療人的前列腺癌的方法，其包括將非導(dǎo)致對抗含有人PSA的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。參見以上 的實施例1和2關(guān)于非人靈長類PSA和表達(dá)非人PSA的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供遞送核酸疫苗的方法，所述疫苗在人的 細(xì)胞中表達(dá)非人PSA,所述方法包括，將一定量的所述核酸疫苗施用到人 的組織中，并對所述人的組織施加電場，從而將所述表達(dá)非人靈長類抗原 的核酸疫苗遞送到所述人組織的細(xì)胞中。參見以上的實施例2和以下的實 施例3。實施例3可通過實施電穿孔技術(shù)來施加電場。合適的電穿孔技術(shù)可參見美國專 利6,010,613、 6,603,998和6，713，291，它們都引入本文作參考。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供遞送核酸疫苗的方法，所述疫苗在人的 細(xì)胞中表達(dá)非人靈長類PSA,所述方法包括，將一定量的所述核酸疫苗施 用到人的組織中，并對所述人的組織施加電場，從而將所述表達(dá)非人靈長 類PSA的核酸疫苗遞送到所述人組織的細(xì)胞中。參見以上的實施例2和以 下的實施例3。根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供人用DNA疫苗，其包含由非人靈長類PSA 的基因衍生的基因序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方 法，包括將非人PSA引入人體的步驟，其中的非人PSA包含與人PSA的氨基酸同源性，所述同源性等于或大于88%、且小于或等于98%。見上文關(guān) 于非人PSA的實施例1。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方 法，包括對人施用由非人PSA基因衍生的基因序列的步驟。所述非人PSA 基因序列在該人體中表達(dá)為非人PSA。所引入的非人基因序列與從人PSA 基因衍生的基因序列有堿基同源性，所述同源性在等于或大于88%、且小 于或等于98%的范圍。優(yōu)選地，所述同源性在等于或大于92%、且小于或 等于99%的范圍。見上文的實施例2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)非人靈長類抗原的載體的用途，其 用于制備人用疫苗以提供抗人抗原的免疫應(yīng)答。 一方面，所述載體可以是 DNA載體。另一方面，所述載體可以是RNA載體。參見以上的實施例2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)非人靈長類PSA的載體的用途，其 用于制備人用疫苗以提供抗人PSA的免疫應(yīng)答。 一方面，所述載體可以是 DNA載體。另一方面，所述載體可以是RNA載體。參見以上的實施例2。非人靈長類PSA(例如獼猴PSA)在刺激人的免疫系統(tǒng)攻擊產(chǎn)生人PSA 的人細(xì)胞方面的用途可用圖3和4進(jìn)行舉例說明。圖4顯示人T細(xì)胞對由pVAX/rhPSA轉(zhuǎn)染的單核細(xì)胞衍生的人樹突細(xì) 胞帶來的刺激的應(yīng)答。未成熟的人單核細(xì)胞樹突細(xì)胞通過使人單核細(xì)胞在 有細(xì)胞因子的條件下生長而制得。人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞經(jīng) pVAX/rhPSA轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些細(xì)胞通過在含有polyl:C的培養(yǎng)基中保溫而成熟。 成熟的細(xì)胞被用于在體外免疫接種中刺激自體人T細(xì)胞。經(jīng)兩輪再刺激 (re-stimulation)后，用IFNgamma ELISPOT試驗評估人PSA特異性。將特異 性T細(xì)胞與接受對照人血清白蛋白(HSA)刺激的T細(xì)胞進(jìn)行比較。所述應(yīng)答 顯示，在經(jīng)獼猴PSA轉(zhuǎn)染的人樹突細(xì)胞刺激的細(xì)胞中，出現(xiàn)人PSA特異 性T細(xì)胞應(yīng)答。這表明，在體外免疫接種中，受獼猴PSA刺激的人T細(xì)胞 產(chǎn)生應(yīng)答，表現(xiàn)為攻擊含有人PSA的人細(xì)胞。在上述的人樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)染中，為證實事實上被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)獼猴 PSA，進(jìn)行Western印跡。更具體地，圖3顯示，獼猴PSA在經(jīng)pVAX/rhPSA (表達(dá)獼猴PSA的質(zhì)粒)和對照質(zhì)粒(pVAX)轉(zhuǎn)染的人樹突細(xì)胞中表達(dá)。 Western印跡顯示預(yù)計的獼猴PSA30 kda蛋白有表達(dá)。為了進(jìn)行該表達(dá)，用pVAX/rhPSA和對照質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)人樹突細(xì)胞。在Western印跡的24 小時后分析細(xì)胞，；險測到獼猴PSA，為30kda的泳帶。使用和操作本發(fā)明的方式也可以從以上的描述明顯看出，并因此無需 另外提供關(guān)于使用和操作方式的說明。從以上可以明顯看出，本發(fā)明通過提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的、 可以有利地用于殺滅人體中經(jīng)前列腺切除術(shù)仍未被切除的前列腺細(xì)胞的、 新的改進(jìn)方法和組合物，而實現(xiàn)了所有目標(biāo)。本發(fā)明提供與抗前列腺癌的本發(fā)明提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的方法和組合物，其不限于激素療法。 本發(fā)明提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的方法和組合物，其在人體中使用異 基因抗原(例如蛋白)，且所述異基因抗原與人自身抗原之間具有較少種間差 異，以便在人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供 與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的方法和組合物，其在人體中使用非人靈長類異 基因抗原(例如蛋白)，且所述非人靈長類異基因抗原與人自身抗原之間具有 較少種間差異，以便在人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身抗原的最佳免疫應(yīng)答。 本發(fā)明提供與抗前列腺癌的疫苗有關(guān)的方法和組合物，其在人體中使用非 人靈長類異基因PSA抗原，且所述非人靈長類異基因PSA抗原與人自身 PSA抗原之間具有較少種間差異，以便在人體中誘導(dǎo)出抗人天然自身PSA 抗原的最佳免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明在附圖中顯示，并在上文中具體詳細(xì)地進(jìn)行全面描述， 所描述的內(nèi)容被視為本發(fā)明的最實用和最優(yōu)選方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 理解，可以對所述內(nèi)容進(jìn)行多種改動而不背離本文所述的原則和精髓，所 述改動包括但不限于改變操作、裝配(assembly)和用途的用量、材料、形狀、 形式、功能和方式。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1.組合物，包括非人靈長類PSA和對人施用的可藥用載體。
2. 權(quán)利要求l的組合物，是包含非人靈長類PSA和對人施用的可藥用載 體的人用疫苗。
3. 權(quán)利要求l的組合物，是疫苗，且其中所述非人靈長類PSA引起人的 免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗人PSA的抗體。
4. 權(quán)利要求l的組合物，是疫苗，且其中人的免疫應(yīng)答導(dǎo)致產(chǎn)生抗人 PSA的抗體。
5. 權(quán)利要求l的組合物，是疫苗，且其中人的免疫應(yīng)答導(dǎo)致抗人類細(xì) 胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)型免疫，所述人細(xì)胞含有人PSA。
6. 非人靈長類PSA在制備人用疫苗中的用途，所述疫苗用于提供抗人 PSA的免疫應(yīng)答。于提供抗該抗原的免疫應(yīng)答。于提供抗人PS A的免疫應(yīng)答。
7、<image>image see original document page 2</image>
8、<image>image see original document page 2</image>
9. 治療人類的方法，包括將非人靈長類DNA序列引入人體的步驟，以 便在人體中提供非人靈長類PSA。
10. 治療人的前列腺癌的方法，包括將非人靈長類PSA引入人體的步驟， 以引起人的免疫應(yīng)答。
11. 權(quán)利要求10的方法，包括將非人靈長類PSA引入人體的步驟，其中 人的免疫應(yīng)答導(dǎo)致產(chǎn)生抗人PSA的抗體。
12. 權(quán)利要求10的方法，包括將非人靈長類PSA引入人體的步驟，以引 起人的免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答包括對含有人PSA的細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo) 型免疫。
13. 權(quán)利要求10的方法，包括將非人靈長類PSA引入人體的步驟，其中 人的免疫應(yīng)答導(dǎo)致對含有人PSA的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性、細(xì)胞介導(dǎo)型免疫。
14. 將表達(dá)非人靈長類抗原的核酸疫苗遞送至人類細(xì)胞的方法，包括 對人的組織施用一定量的所述核酸疫苗，和對所述人組織施加電場，從而將所述表達(dá)非人靈長類抗原的核酸疫苗遞送到所述人組織的細(xì)胞中。
15. 將表達(dá)非人靈長類PSA的核酸疫苗遞送至人類細(xì)胞的方法，包括 對人的組織施用一定量的所述核酸疫苗，和對所述人組織施加電場，從而將所述表達(dá)非人靈長類PSA的核酸疫苗遞 送到所述人組織的細(xì)胞中。
16. 人用DNA疫苗，包含源自非人靈長類PSA基因的基因序列。
17. 在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方法，包括將非人PSA引入所 述人體的步驟，其中所述非人PSA具有與人PSA在88 %以上至98 %以下的范 圍內(nèi)的氨基酸同源性。
18. 在人體中誘導(dǎo)抗人PSA的免疫應(yīng)答的方法，包括將源自非人PSA基 因的基因序列引入所述人體的步驟，其中所述非人PSA基因序列在所述人體 中表達(dá)為非人PSA,其中所述引入的非人基因序列與源自人PSA基因的基因 序列有堿基對同源性，且其中所述同源性是在88 %以上至98 %以下的范圍 內(nèi)。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述同源性是在92%以上至99%以下的 范圍內(nèi)。
20.表達(dá)非人靈長類PSA的載體在制備人用疫苗中的用途，所述疫苗用于提供抗人抗原的免疫應(yīng)答。
21. 權(quán)利要求20的用途，其中所述載體是DNA載體。
22. 權(quán)利要求20的用途，其中所述載體是RNA載體。
23. 表達(dá)非人靈長類PSA的載體在制備人用疫苗中的用途，所述疫苗用 于提供抗人PSA的免疫應(yīng)答。
24. 權(quán)利要求23的用途，其中所述載體是DNA載體。
25. 權(quán)利要求23的用途，其中所述載體是RNA載體。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供與抗前列腺癌疫苗有關(guān)的方法和組合物，所述疫苗包括非人靈長類PSA，其用于對人施用以提供抗人PSA的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/00GK101257920SQ200680030353
公開日2008年9月3日 申請日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者佩維爾·皮薩, 克里斯托弗·萊德, 艾倫·D·金, 馬克西姆·帕夫倫科 申請人:塞托·帕爾斯科技公司