一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，所述試劑為側(cè)鏈含有疏水單元和低效率熒光單元的乙二醇殼聚糖高分子。該試劑基于多位點錨定，其生物相容性好、合成簡單、成本低廉、染色方便，無須清洗且不易被細胞內(nèi)吞，可以用做長時間的細胞膜特異性示蹤標記探針。
【專利說明】一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，特別涉及一種基于多位點錨定、免清洗的長時間 細胞膜熒光成像試劑，還涉及該試劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 細胞膜不僅在結構上將細胞個體包裹形成穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境，而且在功能上參與了 物質(zhì)運輸、能量傳遞、信號轉(zhuǎn)導、囊泡運輸、細胞生長、分化、粘附、轉(zhuǎn)移、應激、胞吞、胞吐、凋 亡、壞死、自噬等很多重要生物學過程，因此關于細胞膜的研究越來越受到重視。對細胞膜 進行熒光染色可以對細胞膜進行標記和示蹤，已經(jīng)成為研究細胞膜結構和功能的有力手 段。
[0003] 目前市售的親脂性熒光染料如0丨0家族（0丨0、0丨1、0丨4、0丨1?等）和？1家族 (FM4-64、FM 2-10等）存在很多的不足。這些熒光分子在水介質(zhì)中也有較強的熒光，導致 過量的熒光染料存在于細胞培養(yǎng)液中，進而造成了熒光顯微成像時背景信號干擾極大，需 要用緩沖液或者細胞培養(yǎng)液進行多次清洗，才能實現(xiàn)比較滿意的成像效果。另一方面，DiD 家族因為是小分子，很容易被內(nèi)吞而使細胞器的膜結構等染色，因此失去了細胞膜成像的 特異性。FM染料家族雖然通過增加極性頭部的方式一定程度上提高了染料分子在細胞膜上 的穩(wěn)定性，但染色10分鐘以上仍然會造成內(nèi)吞，難以長時間標記細胞膜。為了解決長時間 成像的問題，目前也有很多的科研人員開發(fā)了一些新型染料，它們都是利用一條或兩條疏 水尾巴作為錨定區(qū)域，通過改善親水性頭部的方式進行設計，因為仍然都是小分子熒光染 料所以很容易被內(nèi)吞（尤其染色時間長時，內(nèi)吞更甚），因此這種單一位點錨定的方式很難 有技術突破。因此，開發(fā)一種的無須清洗的長時間細胞膜特異性成像試劑非常有必要。
[0004] 此外，由于細胞膜相關的生物學過程大多需要長時間尺度的示蹤研究，因此需要 借助長時間細胞膜成像染料；然而，由于很多生物學過程需要原位捕捉最原始的狀態(tài)（比 如在活體組織和器官中），無法進行體外細胞實驗中常用的熒光染料清洗的操作，因此目前 迫切需要研制一類能夠免清洗的細胞膜成像染料。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑。
[0006] 技術方案：本發(fā)明提供的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，所述試劑為 側(cè)鏈含有疏水單元和低效率熒光單元的乙二醇殼聚糖。乙二醇殼聚糖在任何pH值的水溶 液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特 點。疏水單元可通過疏水相互作用多位點地插入細胞膜，并把乙二醇殼聚糖高分子及其上 負載的尼羅紅分子錨定到細胞膜上；乙二醇殼聚糖把各個膽固醇疏水單元和尼羅紅染料單 元交聯(lián)起來，防止其長時間染色被細胞內(nèi)吞；尼羅紅染料由于在水溶液中發(fā)光效率低，而在 疏水的細胞膜上發(fā)出紅色的熒光，可以實現(xiàn)免清洗的長時間細胞膜熒光成像。
[0007] 作為優(yōu)選，所述疏水單元占乙二醇殼聚糖重復單元數(shù)的百分比在5%到30%;所述 尼羅紅染料單元占乙二醇殼聚糖重復單元數(shù)的百分比在I%到5%。
[0008] 作為另一種優(yōu)選，所述乙二醇殼聚糖（glycol chitosan)的分子量在10000以上， 優(yōu)選 10000-100000。
[0009] 作為另一種優(yōu)選，所述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴和維生素 E ;所述疏 水單元通過聚乙二醇高分子鏈接到乙二醇殼聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子 量在500以上。
[0010] 作為另一種優(yōu)選，所述低效率熒光單元為羧基化的尼羅紅染料或羧基化的四苯基 乙烯，其通過與氨基反應直接鏈接到乙二醇殼聚糖上，或通過短鏈PEG鏈接到乙二醇殼聚 糖的氨基上。所述低效率熒光單元在水溶液中發(fā)光效率低，而在疏水性環(huán)境中發(fā)光強度大 的熒光分子，以實現(xiàn)免清洗成像。
[0011] 所述羧基化的尼羅紅染料的結構式為：
[0012]
【權利要求】
1. 一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，其特征在于：所述試劑為側(cè)鏈含有疏水 單元和低效率熒光單元的乙二醇殼聚糖。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，其特征在于：所 述疏水單元占乙二醇殼聚糖重復單元數(shù)的百分比在5%到30% ;所述尼羅紅染料單元占乙 二醇殼聚糖重復單元數(shù)的百分比在1 %到5%。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，其特征在于：所 述乙二醇殼聚糖分子量在10000以上，優(yōu)選10000-100000。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，其特征在于：所 述疏水單元包括膽固醇、磷脂分子、烷烴和維生素 E ;所述疏水單元通過聚乙二醇高分子鏈 接到乙二醇殼聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑，其特征在于：所 述低效率熒光單元為羧基化的尼羅紅染料或羧基化的四苯基乙烯，其通過與氨基反應直接 鏈接到乙二醇殼聚糖上，或通過短鏈PEG鏈接到乙二醇殼聚糖的氨基上。
6. -種免清洗的長時間細胞膜熒光成像試劑的制備方法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 取疏水單元分子和乙二醇殼聚糖分別溶于PBS緩沖液中，混勻，室溫反應；產(chǎn)物透 析、凍干； (2) 在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞 胺（sulfo-NHS)存在下，產(chǎn)物和低效率熒光單元分子室溫反應，純化即得。
【文檔編號】A61K49/00GK104288787SQ201410487271
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權日:2014年9月22日
【發(fā)明者】吳富根, 王宏銀, 陳戰(zhàn) 申請人:東南大學