專利名稱：：使用核酸探針、微珠和熒光激活的細(xì)胞分選器(facs)檢測人乳頭狀瘤病毒(hpv)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明概括地涉及診斷和檢測測定領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的一種或多種分析物的存在或區(qū)分它們的方法和試劑，包括生物芯片。
背景技術(shù)：
：在說明書的末尾，列出了在本申請中提供的參考文獻(xiàn)的著錄項(xiàng)目細(xì)節(jié)。本說明書中的任何現(xiàn)有技術(shù)不是、也不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是承認(rèn)或任何形式的暗示該現(xiàn)有技術(shù)在任何國家形成了普通一般知識的一部分。對在單一測定中快速且可靠地檢測多種分析物的篩選方法的需要，不僅在臨床診斷領(lǐng)域是關(guān)鍵的，而且還在篩選應(yīng)用，例如篩選環(huán)境毒素，和藥物篩選方面是關(guān)鍵的。迫切需要改進(jìn)的篩選方法和試劑的一個(gè)這樣的領(lǐng)域是感染性疾病領(lǐng)域。例如，世界上應(yīng)用于性傳播疾病(例如，人乳頭狀瘤病毒(HPV))的^貪斷檢測的保守估計(jì)是每年約20000000次檢測。許多現(xiàn)有的篩選感染性疾病的病因的檢測是耗時(shí)、費(fèi)力、昂貴的，且經(jīng)常僅對一種特定病原體是特異性的，和/或不能區(qū)分不同的病原體菌林。HPV是子宮頸癌的主要致病病原體。但是，HPV分類群包含許多病原體"菌林"，僅僅其中的一些與子宮頸癌和其它癌的發(fā)展有關(guān)。因此，通常將HPV菌抹分為"高危險(xiǎn)"菌林，包括13種菌抹，它們占子宮頸病例的約98%，或"低危險(xiǎn)"菌抹，它們通常與子宮頸癌的發(fā)展無關(guān)。目前，通過巴氏涂片檢測子宮頸癌。在該技術(shù)中，通過刮術(shù)或洗滌，從子宮頸收集細(xì)胞。然后，將這些細(xì)胞置于顯微鏡載玻片上，制成"涂片，，。病理學(xué)家再檢查載玻片，尋找異常的細(xì)胞。但是，巴氏涂片對于明確地確定子宮頸癌危險(xiǎn)是有些不令人滿意的測定，因?yàn)樵摷夹g(shù)具有約20%的假陰性率，且該技術(shù)不能區(qū)分"高危險(xiǎn)"和"低危險(xiǎn)"分類群。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種檢測測定，它能檢測樣品中的分析物，和/或區(qū)分許多不同的分析物。而且，與有些現(xiàn)有的檢測測定相比，本文所述的本發(fā)明的試劑和方法是相對快速且低廉的。
發(fā)明內(nèi)容在本說明書和所附權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，詞語"包含"和變體，例如"包括"和"含有"，應(yīng)當(dāng)理解為表示包含所述的整體或步驟或組的整體或完整的步驟，但是不排除任何其它整體或步驟或組的整體或完整的步驟。通過序列標(biāo)識號(SEQIDNO:)指示核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:在數(shù)字上與序列標(biāo)識<400〉1(SEQIDN0:1)、<400>2(SEQIDNO:2)等相對應(yīng)。在表1中提供了序列標(biāo)識的總結(jié)。在權(quán)利要求書后提供了序列表。本發(fā)明提供了測定，其能檢測一種或多種分析物，和/或能區(qū)分一類分析物中不同成員。更具體地，使用基于分析物和測定組分的性質(zhì)的多重分析來識別或區(qū)分分析物。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于檢測一種或多種分析物和/或用于區(qū)分一類分析物中的兩個(gè)或多個(gè)成員的珠子集合(beedset),其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中'.(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會與待測樣品中的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和分析物辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份(subsetidentity)，并從而識別珠子已經(jīng)偶聯(lián)的反應(yīng)物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)想到檢測和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種分析物的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸對目標(biāo)分析物特異性的珠子集合；(b)在足以允許所述樣品中的分析物與所述珠子集合內(nèi)的珠子上的反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間；和(c)檢測和/或區(qū)分樣品中結(jié)合到所述珠子的反應(yīng)物上的分析物。在一個(gè)相關(guān)的方面，反應(yīng)物可以標(biāo)有一種或多種熒光染料，其進(jìn)一步允許區(qū)分一類分析物中的不同成員。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了方法和珠子集合，其能檢測和/或區(qū)分生物樣品內(nèi)的分析物，其中所述分析物是對傳染性病原體特異性的。本文考慮到的生物樣品包括血液，血清，唾液，糞便，尿，組織液，精液，滲出物，膿汁，呼吸液，和粘液和來自局部瘍、癌癥和損傷的擦樣。術(shù)語"病原體，，指感染或寄居樣品的微生物或病毒。示例性病原體包括病毒，細(xì)菌，真菌和真核微生物。病毒包括慢病毒屬(例如AIDS病毒，HIV-I，HIV-II，HTLV-IV)，逆轉(zhuǎn)錄病毒和禽流感病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，"病原體"包括微生物或病毒，它會感染多細(xì)胞生物，例如動(dòng)物或植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將分析物視作動(dòng)物或植物病原體。但是，本發(fā)明包括寄居多細(xì)胞生物的非病原性物質(zhì)(例如共生生物，內(nèi)生植物，胃腸寄生物等)的檢測和/或區(qū)分。本發(fā)明的方法也適用于樣品中指示治療性試劑或?yàn)E用物質(zhì)的存在的分析物的檢測。本發(fā)明的方法和試劑也可以用于檢測樣品中的分析物，所述樣品不是源自從動(dòng)物或植物分離的生物樣品。這樣，本發(fā)明的試劑和方法也可以擴(kuò)展到一種或多種分析物的檢測和/或環(huán)境樣品中分析物的區(qū)分，所述樣品，除了上面列出的生物樣品外，包括空氣、水和土壤樣品，包括地球外土壤、灰塵等樣品，工業(yè)樣品等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人受試者的HPV的診斷方法和試劑，且能檢測和區(qū)分不同菌林，以便從"低危險(xiǎn)"HPV分類群中區(qū)分"高危險(xiǎn)"HPV分類群。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了珠子集合，其能區(qū)分多個(gè)不同的HPV菌林。這樣，在一個(gè)方面，分析物是對許多HPV分類群特異性的，且方法和試劑是對下述物質(zhì)的檢測特異性的對許多HPV分類群特異性的核酸或抗原或抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，將能結(jié)合HPV基因組的菌林特異性部的核酸引物或探針固定化到每個(gè)珠子子集的珠子上。然后，使用指向側(cè)接菌林特異性區(qū)域的HPV基因組內(nèi)的保守區(qū)的引物，擴(kuò)增HPM基因組。然后，使用對任一種HPV菌林特異性的珠子子集來檢測或區(qū)分HPV菌林。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面指向珠子集合，其用于檢測一種或多種HPV菌林，和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌抹的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林；(b)在足以允許所述探針結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種HPV菌林。在一個(gè)優(yōu)選的方面，在大小、熒光強(qiáng)度水平、焚光染料類型和能與特定分析物反應(yīng)的試劑的基礎(chǔ)上，區(qū)分珠子集合內(nèi)的珠子。本發(fā)明的關(guān)于HPV檢測的方法可以用于區(qū)分2至16種HPV菌林，包括2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15至16種菌林。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子集合包含至少16個(gè)珠子子集，其針對HPV菌林6，11，16，18，31，33，35，39，45,51，52，56，58，59，"和68。合適的捕獲探針是在圖9中列出且顯示在SEQIDNO:5至20中的那些。使用能區(qū)分珠子集合內(nèi)的不同珠子的任何方法，可以確定分析物和存在于珠子上的反應(yīng)物之間是否已經(jīng)發(fā)生結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，區(qū)分珠子集合內(nèi)的不同珠子的方法是流式細(xì)胞術(shù)。本發(fā)明還設(shè)想到根據(jù)本發(fā)明的試劑和方法使用的診斷試劑盒。更具體地，本發(fā)明擴(kuò)展到生物芯片和擴(kuò)展到測定中的固相組分的minaturization,以建立孩i米測定試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，珠子集合或其一部分或其它試劑固定化在固相(例如生物芯片)上。生物芯片也可以視作"生物實(shí)驗(yàn)室"，在它上面進(jìn)行至少一部分測定，和/或記錄結(jié)果。在表1中提供了本文使用的縮寫的列表。表1-縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖1是描述典型的流式細(xì)胞儀的圖示。圖2是顯示在HPV診斷方法中使用的DM提取操作流程的圖示。圖3是顯示用于擴(kuò)增來自DNA樣品的HPV和人DNA的PCR操作的圖示。GP5+和GP6+指通用HPV引物，其結(jié)合HPV中的保守序列(Y),并產(chǎn)生擴(kuò)增子，其包含在HPV菌林(X卜u)之間可以變化的區(qū)域。引物L(fēng)C1-F和LC1-R擴(kuò)增人基因組DNA區(qū)域(Z)，其用作后一種雜交步驟的對照。引物GP6+和LC1-R包含焚光標(biāo)記物，其摻入在產(chǎn)生的擴(kuò)增子中。圖4是顯示基于大小區(qū)分微球的圖示。顯示了6個(gè)點(diǎn)群(cluster)，其與包含3.0拜，3.5pm，4.1叫5.Ojim,5.6fim和6.8pm直徑的微球相對應(yīng)。圖5是顯示基于熒光標(biāo)記強(qiáng)度區(qū)分相同大小的微球的圖示?？梢郧宄貐^(qū)分0%，4%，20。/。和100%的TMR相對強(qiáng)度。圖6是顯示在測定中使用的每種結(jié)合試劑的示意圖。測定包含具有3.0拜，3.5jim，4.1叫5.0拜，5.6拜和6.8拜的直徑的微球，和0%，4%，20%和100%的熒光標(biāo)記信號強(qiáng)度。在更小的珠子大小(即3.Ojim3.5拜和4.ljim)的情況下，使用0%和100%的TMR強(qiáng)度；對于5.0,微球，使用0%，20%和100%的TMR強(qiáng)度；且對于最大的微球，5.6jim和6.8nm直徑，使用所有信號強(qiáng)度。圖7是顯示如何在顆粒大小和熒光標(biāo)記強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，使用流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分17種結(jié)合試劑的圖示。點(diǎn)群1至4相當(dāng)于分別具有0%，4%，20%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的6.8jim顆粒；點(diǎn)群5至8相當(dāng)于分別具有0%，4%，20%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的5.6nm顆粒；點(diǎn)群9至11相當(dāng)于分別具有100%,20%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的5.0nm顆粒；點(diǎn)群12和13相當(dāng)于分別具有100%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的4.1jun顆粒；點(diǎn)群14和15相當(dāng)于分別具有100%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的3.5jim顆粒；點(diǎn)群16和17相當(dāng)于分別具有0%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的3.0nm顆粒；圖8是顯示擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合哪個(gè)結(jié)合試劑陣列的圖示。結(jié)果表明結(jié)合于病毒保守序列Y、人對照序列Z和病毒菌林特異性序列X16。圖9是對HPV菌林6，11，16，18，31，33,35，39,45，51，52，56，58，59，66和68特異性的捕獲探針(引物)的代表。圖10A至G提供了用于檢測人樣品是否存在HPV的Qplots(商標(biāo))。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了測定和試劑，包括生物芯片，其能檢測一種或多種分析物和/或區(qū)分一類分析物中的不同成員。更具體地，通過基于分析物和測定組分的性質(zhì)的多重分析方法，鑒別或區(qū)分分析物。本發(fā)明的診斷和檢測測定和試劑特別適用于診斷多細(xì)胞真核受試者中的病原體感染。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人受試者中HPV的診斷測定，且能區(qū)分HPV分類群，以便區(qū)分"高危險(xiǎn)，，HPV感染和"低危險(xiǎn)"HPV感染。而且，本發(fā)明還提供了診斷或評價(jià)與分析物感染多細(xì)胞真核受試者有關(guān)的疾病(尤其是，人受試者的子宮頸癌)的發(fā)展的方法。應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，本發(fā)明不限于特定的診斷或測定方法，因?yàn)檫@可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，無意進(jìn)行限制。應(yīng)當(dāng)指出，如在本說明書所使用的，除非上下文已經(jīng)另有說明，單數(shù)形式的"一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)方面。因此，"一種分析物"包括單一分析物和兩種或多種分析物；一種"物理化學(xué)上可區(qū)分的底物"包括單一底物和兩種或多種底物；依此類推。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了珠子集合，其能檢測和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種分析物，所述珠子集合包含(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會與待測樣品中的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和分析物辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別珠子已經(jīng)偶聯(lián)的反應(yīng)物。在一個(gè)相關(guān)的方面，可以進(jìn)一步有區(qū)別地標(biāo)記反應(yīng)物，以基于不同熒光染料的摻入，建立另外的珠子亞群。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測和/或區(qū)分分析物的方法或珠子集合。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法或珠子集合能檢測和/或區(qū)分病原性分析物。本發(fā)明也提供了檢測和/或區(qū)分樣品中的一種或多種分析物的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸對目標(biāo)分析物特異性的珠子集合；(b)在足以允許所述樣品中的分析物與所述珠子集合內(nèi)的珠子上的反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間；和(c)檢測和/或區(qū)分樣品中結(jié)合到所述珠子的反應(yīng)物上的分析物。如本文所使用的，術(shù)語"病原性分析物"指推定感染、寄居或已經(jīng)污染樣品的微生物或病毒。示例性的病原體分析物包括病毒，細(xì)菌，真菌和真核微生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，"分析物"包括感染多細(xì)胞生物(例如動(dòng)物或植物)的微生物或病毒。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，病原性分析物可以視作動(dòng)物或植物病原體。不過，本發(fā)明包括檢測和區(qū)分寄居多細(xì)胞生物的非病原性分析物，例如動(dòng)物的微生物(例如乳酸桿菌屬，反芻動(dòng)物細(xì)菌)，昆蟲的微生物共生生物(例如鏈霉菌屬，沃爾巴克氏體屬)，海綿動(dòng)物的微生物共生生物(例如綠藻，渦鞭藻，藍(lán)細(xì)菌)等；植物的內(nèi)生植物(例如菌根，根瘤菌屬，弗蘭克菌屬，鏈霉菌屬)等。而且，分析物可以是與多細(xì)胞生物無關(guān)的分析物。這樣的分析物包括，細(xì)菌，真菌，病毒，原生生物，線蟲等，其寄居在特定的環(huán)境中，包括"天然"環(huán)境例如土壤，海洋，淡水，水，巖石，熱水口和空氣；衛(wèi)生保健環(huán)境包括醫(yī)院，醫(yī)院設(shè)備，手術(shù)裝備，衛(wèi)生保健人員衣服等；"工業(yè)"環(huán)境包括生產(chǎn)設(shè)備，制藥設(shè)備，釀酒廠，葡萄酒廠等；"實(shí)驗(yàn)室"環(huán)境包括發(fā)酵罐，培養(yǎng)物，實(shí)驗(yàn)臺，儀器等。因此，本發(fā)明設(shè)想到的樣品包括工業(yè)樣品(例如空氣、水和土壤等)和生物樣品(例如血液，血清，唾液，糞便，尿，組織液，精液，滲出物，膿汁，呼吸液，粘液和來自局部瘍、癌癥和損傷的擦樣)。另外，樣品可以是地球外樣品，例如來自隕石或另一個(gè)行星。關(guān)于后者，本發(fā)明的測定適合在行星間的遙控飛船上使用，用于測試土壤或灰塵或冰樣品，或用于測試行星的核心材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析物包含感染動(dòng)物受試者的細(xì)菌、真菌病毒和/或真核寄生物。本文設(shè)想到的"動(dòng)物受試者"包括所有動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物，包括低等的靈長類動(dòng)物，更優(yōu)選人。為了方便，"動(dòng)物"也特別地包括家畜例如牛，馬，綿羊，豬，山羊和驢以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和倉鼠。使用本發(fā)明的試劑和方法可以檢測的示例性人分析物包括病毒，如人乳頭狀瘤病毒(HPV)，冠狀病毒包括SARS病毒，流感病毒，禽流感病毒，HIV包括HIV-I，HIV-II或HLTV-IV，通常的慢病毒屬，肝炎病毒等，性傳播疾病的病原性因子，例如衣原體屬，淋病，支原體屬和梅毒；食物傳播的病原體例如李斯特菌屬，沙門氏菌屬，大腸桿菌(尤其是大腸桿菌H0567)，志賀氏菌屬，布魯氏菌屬，金黃色葡萄球菌；Nosicomial病原體，例如金黃色葡萄球菌包括甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)和腸球菌包括萬古霉素抗性的腸球菌(VRE);從環(huán)境得到的病原體例如軍團(tuán)桿菌屬，賈第蟲屬，C/7"^7/r2V/i/邁屬，炭疽桿菌(炭疽)等。在一個(gè)方面，檢測分析物的樣品優(yōu)選地是源自推定被分析物感染或寄居的多細(xì)胞受試者的樣品。因此，在一個(gè)方面，樣品優(yōu)選地是"生物樣品，，。不以任何方式限制本發(fā)明的示例性生物樣品包括組織或細(xì)胞樣品，例如細(xì)胞刮片，活組織檢查等和體液樣品，包括血液，尿，淋巴，羊水，腦脊液等。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法也適用于檢測非排它地源自多細(xì)胞真核生物的樣品中的"分析物"。這樣，本發(fā)明擴(kuò)展到檢測和/或區(qū)分樣品中的分析物的一種或多種具體的分類群或菌林，所述樣品例如環(huán)境樣品(包括空氣，水和土壤樣品)，工業(yè)樣品，實(shí)驗(yàn)室樣品等。例如，本發(fā)明的方法可以用于評價(jià)土壤、水或空氣樣品或源自人造物體的樣品或表面的原核微生物群、真核微生物群和/或病毒負(fù)載。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，待測分析物是HPV或其菌林，且樣品優(yōu)選地是源自人受試者的生物樣品。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品包含受試者的一種或多種細(xì)胞、血液或尿。最優(yōu)選地，生物樣品包含從受試者收集的子宮頸細(xì)胞。Gearhart等(www.emedicine.com/MED/topic1037.htm，2004)詳細(xì)描述了HPV，將其在下面的部分中再現(xiàn)。HPV會造成皮膚和粘膜的上皮腫瘤。已經(jīng)檢測到超過IOO種HPV類型，且已經(jīng)完全測序了幾乎70種基因組。當(dāng)前的基于基因組序列相似性的分類系統(tǒng)，通常與用于臨床上描述HPV的3種分類相關(guān)肛門生殖器疣和/或粘膜疣，非生殖器皮膚疣，和疣狀表皮發(fā)育不良(EV)。通過HPV序列數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站，可以得到HPV基因組序列的數(shù)據(jù)庫和種系發(fā)生樹。將HPV粘膜感染進(jìn)一步分為潛伏的(無癥狀的)，亞臨床的，或臨床的。臨床的損害大致是明顯的，而潛在感染僅僅可以通過測試病毒DM來檢測到。通過應(yīng)用5%醋酸并在放大下檢查，可以鑒別亞臨床的損害。大多數(shù)HPV感染是潛在的；臨床上明顯的感染通常會導(dǎo)致疣，而不是惡性腫瘤。典型地，將HPV類型6和11標(biāo)記為低危險(xiǎn)，因?yàn)檫@些類型的感染具有低致癌潛能，且通常會導(dǎo)致濕疣的形成和低級癌前期病變。HPV類型16和18已經(jīng)成為HPV的高危險(xiǎn)類型，因?yàn)樗鼈兪谴蠖鄶?shù)高級上皮內(nèi)損害(它們可以發(fā)展成癌)的原因，尤其是在肛門生殖器種類和/或粘膜種類中的那些。HPV感染自身不會造成感染的組織的惡性轉(zhuǎn)化。輔因子，例如吸煙，紫外線輻射，懷孕，葉酸鹽缺乏和免疫抑制參與了該過程。表3列出了許多種疾病和有關(guān)的HPV亞型。表3-疾病和有關(guān)的HPV亞型<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>乳頭狀瘤病毒是高度物種特異性的，不會感染其它物種，甚至在實(shí)驗(yàn)室條件下。人是唯一已知的HPV宿主。乳頭狀瘤病毒是二十面體對稱的無衣殼病毒，其具有72個(gè)在基因組周圍的殼粒，所述基因組含有具有約8000個(gè)堿基對的雙鏈環(huán)狀DNA。認(rèn)為乳頭狀瘤病毒具有2種復(fù)制模式，即附加體基因組在基底細(xì)胞中的穩(wěn)定復(fù)制，和在更分化的細(xì)胞中失控的或生長的復(fù)制，以產(chǎn)生子代病毒。盡管損害的所有細(xì)胞都含有病毒基因組，病毒基因的表達(dá)與細(xì)胞分化的狀態(tài)緊密相關(guān)。在感染的角質(zhì)形成細(xì)胞離開基底層之前，大多數(shù)病毒基因未被激活。病毒顆粒的生產(chǎn)，僅僅發(fā)生在高度分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中；因此，病毒生產(chǎn)僅僅發(fā)生在上皮表面，細(xì)胞在這里最終脫落進(jìn)環(huán)境中。認(rèn)為HPV損害的原因是感染的基底角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。當(dāng)基底細(xì)胞暴露于穿過擾亂的上皮屏障的感染性病毒時(shí)，通常發(fā)生感染，如在性交過程中或微小皮膚擦傷后發(fā)生的。尚未證實(shí)HPV感染是細(xì)胞溶解性的，然而作為脫落細(xì)胞的降解的結(jié)果，釋放出病毒顆粒。而且，HPV病毒可以在低溫和沒有宿主的情況下存活數(shù)月。病毒倍增通常局限在核中。結(jié)果，感染的細(xì)胞通常表現(xiàn)出高度的核異型。中空細(xì)胞病(來自希臘文koilos，指空的)描述了核周透明(環(huán))和濃縮的或皺縮的(rasinoid)核的組合，且是生產(chǎn)性乳頭狀瘤病毒感染的特征。HPV基因組作為環(huán)狀附加體DNA存在，其與良性或低危險(xiǎn)HPV損害中的宿主細(xì)胞核分離，例如通常與HPV類型6和ll有關(guān)的那些。高危險(xiǎn)HPV類型16和18的基因組通常整合在惡性損害的宿主細(xì)胞DNA中。但是，本發(fā)明擴(kuò)展到任意的HPV菌抹，包括但不限于菌林6，11，16，18，31，33，35,39，45，51，52，56，58，59，66和68。病毒基因組向宿主細(xì)胞基因組中的整合，被視作惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。已經(jīng)顯示，高危險(xiǎn)血清型的HPV蛋白E6和E7會滅活宿主胂瘤抑制蛋白p53和Rb，從而導(dǎo)致失調(diào)的宿主細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測和/或區(qū)分生物樣品中的一種或多種特定HPV菌林的方法，所述方法包含下述步驟(i)從人受試者得到生物樣品，其推定包含HPV;(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與每種HPV菌林不同的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增對照核酸序列；(v)標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(Vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與包被有反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合，指示著特定HPV菌林在樣品中的存在。本發(fā)明能檢測擴(kuò)增的HPVDNA，或者，使用逆轉(zhuǎn)錄酶，檢測對應(yīng)的RNA。因此，本發(fā)明設(shè)想到具有RNA或DNA或其化學(xué)類似物的珠子。本發(fā)明的方法部分地用于檢測和/或區(qū)分樣品中的受試者分析物的一種或多種特定菌林。本文中提及的"受試者分析物的特定菌株"包括分析物的物種或分類群的任何變體。分析物的"菌林"的實(shí)例包括分析物的亞種，具有不同毒力水平的分析物變體，當(dāng)感染或寄居宿主時(shí)指示不同預(yù)后的分析物變體，分析物的生物化學(xué)變體等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于檢測和/或區(qū)分與在人類中的更高危險(xiǎn)或更高致癌潛能有關(guān)的特定HPV菌林(高危險(xiǎn)菌林)、和與更低的癌危險(xiǎn)或低致癌潛能有關(guān)的那些(低危險(xiǎn)菌林)。因此，術(shù)語"高危險(xiǎn)"HPV菌林包括與人受試者中癌(包括子宮頸癌)的發(fā)展有關(guān)的任何HPV菌林。如上面指出的，不以任何方式限制本發(fā)明的示例性高危險(xiǎn)HPV菌株包括HPV6，11，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。在圖9中顯示了這些HPV菌株的在珠子上的合適的捕獲探針。術(shù)語"探針"和"引物，，可以在本上下文中互換地使用。"低危險(xiǎn)"HPV菌林包括與人受試者中增加的癌危險(xiǎn)無關(guān)或僅微弱相關(guān)的那些。典型地，低危險(xiǎn)HPV菌抹是瘋形成菌林，包括HPV6和HPV11。本發(fā)明的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會與樣品內(nèi)的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的反應(yīng)物是核酸，且樣品內(nèi)與反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的分析物也是核酸。因此，本發(fā)明的該方面使用指向HPV菌林的保守區(qū)、但是側(cè)接菌林特異性的基因組序列的引物。菌林特異性的序列稱作"可變"序列，因?yàn)榕c在菌林之間恒定的保守序列相比，它們在菌林之間變化。擴(kuò)增后，使擴(kuò)增子接觸珠子集合中的珠子子集，其中每個(gè)子集的每個(gè)珠子攜帶能與菌抹特異性的擴(kuò)增子雜交的捕獲核酸引物或探針。使用珠子大小、熒光強(qiáng)度和DNA結(jié)合特異性進(jìn)行倍增，會實(shí)現(xiàn)HPV菌林的鑒別、分選和區(qū)分。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到珠子集合，其用于檢測一種或多種HPV菌林和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌株特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到用于檢測和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌抹的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌抹特異性的區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林；(b)在足以允許所述引物結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種hpv菌林。也可以用熒光報(bào)告分子標(biāo)記核酸捕獲探針特異性的擴(kuò)增子。使用對于樣品本身和分析物的性質(zhì)方便的任何方法，可以從受試者樣品分離核酸。如本文所使用的，術(shù)語"核酸"指DNA和/或RM。典型地，DNA是分離的，盡管在有些情況下，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，可以更優(yōu)選地分離RNA，例如，當(dāng)目標(biāo)分析物是RNA病毒時(shí)。如果RM是分離的，可以擴(kuò)增RM,或者可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于隨后的擴(kuò)增和分析。優(yōu)選地，"核酸"是DNA。使用任何方便的方式，可以從樣品分離DNA。例如，在人細(xì)胞樣品的病毒(例如HPV)的情況下，可以使用胍或功能等同試劑來裂解細(xì)胞。示例性的基于胍的細(xì)胞裂解和DNA提取方法是Nelson和Krawetz的方法(Anal.Biochem.207(1):97-201:1992)?；陔业牧呀馊芤阂部蓮墓?yīng)商商業(yè)上得到，例如Qiagen，例如QIAamp，PAXgene等。但是，裂解方法可以根據(jù)樣品和分析物的性質(zhì)而變化。例如，對于環(huán)境樣品(例如土壤或沉淀樣品)中分析物的檢測，基于玻璃珠的細(xì)胞裂解系統(tǒng)可以是更合適的，例如Kuske等的方法(Appl.Environ.Microbiol.64(7):2463-2412，1998)。在任何情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不經(jīng)過過度的實(shí)驗(yàn)，即可容易地確定特定分析物和樣品的適宜裂解方法。裂解細(xì)胞后，可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易明白的任何方便的方式(例如參見上面商業(yè)得到的試劑盒)，純化DNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用有限量的DNA結(jié)合試劑，例如但不限于二氧化硅，純化DNA。通過使用有限量的DNA結(jié)合試劑，可以從不同樣品分離一致量的DNA，因?yàn)樵诿糠N情況下回收的DNA的量等于該有限量的DNA結(jié)合試劑可以結(jié)合的DNA的最大量。然后，可以使用任何方便的方式，從DM結(jié)合試劑回收或洗脫DNA結(jié)合試劑結(jié)合的DNA。盡管DNA是優(yōu)選的核酸，也可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)的RNA分離方法，從樣品分離RNA。RM分離典型地包含細(xì)胞破碎步驟和RM分離步驟。適用于分離RNA的示例性的細(xì)胞破碎技術(shù)包括AmbionTechnicalBulletin#183所述的那些("www.ambion.com/techlib/tb/tb-183.html")。而且，在www.ambion.com/techlib/basics/products/rnaisol—compchart.html,描述了適用于許多樣品類型的許多示例性的RNA分離試劑盒。但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些特定的RM分離和純化的方法和試劑盒不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明是與本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的任何RNA分離方法兼容的。關(guān)于HPV檢測，珠子集合可以包含象HPV菌林一樣多的珠子子集。因此，測定可以采用2，3，4，5，6，7,8，9，10，11，12，13，14，15或16個(gè)珠子子集，各自對應(yīng)HPV菌抹6，11，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。其它珠子也可以用作對照。在圖9中公開了合適的捕獲探針。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面指向珠子集合，其用于檢測一種或多種HPV菌林，和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與選自SEQIDNO:5至20的核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌林的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與選自SEQIDNO:5至20的核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌抹；(b)在足以允許所述探針結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種HPV菌林。因此，珠子集合可以包含HPV2，3，4，5，6，7，8，10,11，12，13，14,15，16個(gè)珠子子集，各自具有一種選自SEQIDNO:5至20的核酸分子。SEQIDNO:5至20中的這些HPV菌株特異性的序列包括，與這些序列具有至少90%—致性、或能在低嚴(yán)格性條件下與它們或它們的互補(bǔ)形式雜交的核酸分子。至少90°/。包括90，91，92，93，94，95，96，97，98，99和100%。本發(fā)明的方法部分地依賴于，使用結(jié)合受試者分析物的不同菌林中的保守序列的引物，從樣品擴(kuò)增核酸，但是這會產(chǎn)生擴(kuò)增子，后者包含分析物的每種菌林的不同核苷酸序列。實(shí)際上，在本發(fā)明中使用的引物會結(jié)合在受試者分析物菌林中保守的序列，其側(cè)接在菌林之間至少部分地不保守的或多態(tài)的區(qū)域。示意地，擴(kuò)增的分析物區(qū)域具有下述一般結(jié)構(gòu)C-X-C"其中C是核苷酸序列，它在兩種或多種分析物菌林中是保守的，且是"正向"引物的結(jié)合位點(diǎn)；X是核苷酸序列，它的一部分或全部包含不同分析物菌林之間的變化；C，是核苷酸序列，它在兩種或多種分析物菌林中是保守的，且是"反向"引物的結(jié)合位點(diǎn)；從引物位點(diǎn)(例如上述的那些)擴(kuò)增，會有效地允許使用"通用"引物集合，其結(jié)合在C和C，，以從許多分析物菌林?jǐn)U增X。而且，應(yīng)當(dāng)指出，使用通用引物擴(kuò)增的擴(kuò)增子可以包含保守區(qū)和可變區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用擴(kuò)增HPV序列的引物。更優(yōu)選地，這些引物是GP5+,即5'TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC(SEQIDNO:1),和GP6+，即GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC3'(SEQIDNO:2)。這些引物從HPV產(chǎn)生擴(kuò)增子，其包含保守區(qū)(在圖3中定義為Y)和在不同HPV菌林之間變化的區(qū)域(在圖3中定義為X)。本發(fā)明也設(shè)想到對照序列的擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，對照序列可以包括生物樣品來源受試者的基因組的區(qū)域。但是，本發(fā)明絕不限于這些具體的對照序列，且也設(shè)想到本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的其它對照序列。而且，也可以在不擴(kuò)增對照序列的情況下，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用包含核苷酸序列5'TACACACAGGTGTACACAGA(SEQIDNO:3)的引物L(fēng)C1-F和包含序列5'ACCAAGTACTCTACGTGTTG(SEQIDNO:4)的引物L(fēng)CI—R，從人受試者基因組擴(kuò)增對照序列。使用任意的DM擴(kuò)增方法，可以擴(kuò)增分離的DNA。在"DNAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications"(Demidov和BroudeEds.，HorizonBioscience,2004)中，描述了許多示例性的DNA擴(kuò)增方法，它們不會限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域已知的任何RM方法，可以擴(kuò)增分離的RNA,且已經(jīng)開發(fā)了許多RNA擴(kuò)增技術(shù)。其中的兩大類是(i)使用熱循環(huán)的技術(shù)，例如RT-PCR，和(ii)等溫測定，例如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(Compton，Nature350:91—92，1991;Kievits等，JVirol,methods35:273-286，1991)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)(Hill,J.Clin.LigandAssay19:43-51，1996)?？梢约?xì)分等溫測定，這基于(i)它們是否拷貝和擴(kuò)增耙序列，例如TMA，MSBA和自持續(xù)的序列復(fù)制(3SR)(Guatelli等，Proc.NatlAcad.SciUSA87:1874-1878，1990;Chadwick等，J.Virol.Methods70:59-70，1998;綜述參見Chan和Fox，Rev.Med.Microbiol.10:185—196，1999)，或(ii)它們是否產(chǎn)生可以進(jìn)一步擴(kuò)增的靶物依賴性的信號，例如侵入物測定(Lyamichev等.，Nat.Biotechnol.17:292-296，1999;Ryan等，Mol.Diagn.4:135-144，1999)。存在多種其它擴(kuò)增技術(shù)，它們不能容易地歸入這些類別，例如QP復(fù)制酶(Lizardi等.，Biotechnology(6:1197-1202，1988)和分支的DNA(Todd等，J.AIDSHum.Retrovirol.10:S35-S44，1995;Pawlotsky等，J.Virol.Methods79:227-235，1999)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明設(shè)想到本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的任何RNA擴(kuò)增方法。而且，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明也設(shè)想到使用逆轉(zhuǎn)錄酶或其功能等同物來將RNA轉(zhuǎn)化成DNA，然后可以擴(kuò)增它。根據(jù)本發(fā)明，標(biāo)記在上述方法的步驟(iii)和/或(iv)中所述的擴(kuò)增子?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞?，標(biāo)記本發(fā)明的擴(kuò)增子。示例性的方法包括合成前的和合成后的方法。合成前的標(biāo)記方法包括，標(biāo)記隨后用于PCR擴(kuò)增并從而整合進(jìn)擴(kuò)增子的PCR引物。在該方法中，標(biāo)記典型地結(jié)合在適用于擴(kuò)增擴(kuò)增子的引物的5'末端，盡管也設(shè)想到標(biāo)記引物內(nèi)的其它位置，例如3'標(biāo)記或非末端標(biāo)記。也可以在標(biāo)記和標(biāo)記的多核苷酸之間使用化學(xué)連接物。適宜的連接物序列可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定，可能包括連接物例如C6，C7和C12氨基修飾劑和包含巰基的連接物。容易確定，引物可以包含連接物和標(biāo)記、或單獨(dú)的連接物，可以在后面的階段將標(biāo)記結(jié)合到它上面。擴(kuò)增后的標(biāo)記方法包括切口標(biāo)記系統(tǒng)，其中使用K1enow聚合酶或其功能等同物，使用隨機(jī)引物，從擴(kuò)增子合成標(biāo)記的多核苷酸。在合成過程中，標(biāo)記的核苷酸，或包含連接基團(tuán)的核苷酸，可以摻入Klenow聚合酶合成的多核苷酸中。在任何情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會容易地明白其它標(biāo)記方法，應(yīng)當(dāng)理解，標(biāo)記方法的選擇決不會限定或限制本發(fā)明。優(yōu)選地，使用的標(biāo)記是"熒光標(biāo)記物"或"熒光團(tuán)，，。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉許多不同的熒光標(biāo)記物，熒光標(biāo)記物的選擇不以任何方式限制本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光標(biāo)記物包含任何能夠結(jié)合多核苷酸并能使用選自下列的光源激發(fā)的熒光標(biāo)i己物(i)氬離子激光包含藍(lán)色488nm鐠線，它適用于激發(fā)許多在綠色至紅色區(qū)域發(fā)熒光的染料和熒光染料。也可獲得在波長范圍(458nm、488nm、496nm、515nm等)發(fā)射的可調(diào)氬激光。(ii)二極管激光具有635nm發(fā)射波長?，F(xiàn)在可獲得的其它二極管激光在532nm工作。有趣地，該波長最優(yōu)地激發(fā)殃丙錠(PI)。PI染色廣泛地用于DNA分析，活/死計(jì)數(shù)和倍性測定。也可獲得發(fā)射約476nm光的藍(lán)色二極管激光。(iii)HeNe氣體激光使用紅色633nm譜線工作。(iv)HeCd激光:在325nm工作。(v)100W水銀弧光燈最有效的激發(fā)UV染料(如Hoechst和DAPI)的光源。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記物選自羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP,別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，蓬唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa熒光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素);PE-Cy5,PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4\5'-二氯-2、7'-二曱氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和ROX;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四甲基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物是Cy5，其對于本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是特別方便的。但是，在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，放射性的或非放射性的標(biāo)記可以用于標(biāo)記擴(kuò)增子。方便的放射性標(biāo)記包括"P和3H?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞剑瑢⑦@些標(biāo)記摻入擴(kuò)增子和/或引物。也可以使用許多非放射性的標(biāo)記方法。在Speel(Histochem.CellBiol.112:89-113，1999)中描述了不限制本發(fā)明的示例性的非放射性的標(biāo)記方法。如本文所使用的術(shù)語"反應(yīng)物"應(yīng)當(dāng)理解為包含固定化在珠子上的多核苷酸。更具體地，每種反應(yīng)物包含多核苷酸，后者包含與根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子互補(bǔ)的序列，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上。反應(yīng)物也可以包含與前文定義的對照序列互補(bǔ)的序列，即從多細(xì)胞生物的基因組擴(kuò)增的序列(Z)或在分析物菌抹之間保守的核苷酸序列的擴(kuò)增子(Y)。因此，反應(yīng)物的珠子集合可以包含其中Bl..Bn,By，Bz分別是物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子；cXn是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核普酸序列，后者與對分析物或受試者分析物的特定菌林特異性的特定核酸序列互補(bǔ)，且其中n是要使用珠子集合檢測的分析物或受試者分析物的特定菌林的數(shù)目；cY是珠子集合的任選成員，且是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所迷多核苷酸包含核苷酸序列，后者與在分析物或受試者分析物的菌林之間保守的序列互補(bǔ)；cZ是珠子集合的任選成員，且是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，后者與從多細(xì)胞受試者擴(kuò)增的對照序列互4卜。優(yōu)選地，受試者分析物是HPV,且對照DNA序列是人基因組DM序列。"互補(bǔ)"應(yīng)當(dāng)理解為，固定化的反應(yīng)物多核苷酸會在低嚴(yán)格性條件下與根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子雜交。優(yōu)選地，固定化的多核苷酸會在中等嚴(yán)格性條件下結(jié)合樣品和標(biāo)準(zhǔn)物，且最優(yōu)選地，固定化的多核普酸會在高嚴(yán)格性條件下結(jié)合樣品和標(biāo)準(zhǔn)物。本文中的低嚴(yán)格性包括，至少約0至至少約15%v/v曱酰胺(包括1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%11%，12%，13%和14%v/v甲酰胺)和至少約1M至至少約2M鹽用于雜交，和至少約1M至至少約2M鹽用于洗滌條件。通常，低嚴(yán)格性是在約25-30。C至約52°C，例如25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51和52。C?？梢愿淖儨囟?，且可以使用更高的溫度來替代甲酰胺和/或產(chǎn)生替代性的嚴(yán)格性條件。當(dāng)需要時(shí)，可以使用替代性的嚴(yán)格性條件，例如中等嚴(yán)格性，它包括至少約16y。v/v至至少約30%v/v甲酰胺，包括16%，17%，18%,19%，20%，21%，22%,23°/。，24%，24%，26%，27%，28%,29%和30%v/v曱酰胺，和至少約0.5M至至少約0.9M鹽用于雜交，和至少約0.5M至至少約0.9M鹽用于洗滌條件，或高嚴(yán)格性，它包括至少約31%v/v至至少約50%v/v甲酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M鹽用于雜交，和至少約0.01M至至少約0.15M鹽用于洗滌條件。通常，在L-69.3+0.41(G+C)%(Mar匿和Doty，J.MolBiol.5:109，1962)，進(jìn)行洗滌。但是，錯(cuò)配堿基對的數(shù)目每增加1%,雙鏈DNA的L降低1。C(Bo畫r和Laskey，Eur.J.Biochem.46:83，1974)。在這些雜交條件下，甲酰胺是任選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)格性水平定義如下低嚴(yán)格性是6xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS，在25-42。C;中等嚴(yán)格性是2xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS，在20。C至65。C的溫度；高嚴(yán)格性是O.1xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS,在至少65。C的溫度。反應(yīng)物珠子集合的珠子(Bi…Bn，By，Bz)分別是物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子。術(shù)語"物理化學(xué)上可區(qū)分的"指任何物理的或化學(xué)的特征，其允許一種珠子(例如BJ與另一種珠子(例如B2)區(qū)分開。因此，物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子允許區(qū)分特定反應(yīng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子包含"微粒"。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，幾乎所有均質(zhì)的或不均質(zhì)的材料都可以用作微粒。本文設(shè)想到的微粒也可以包含超過一種物質(zhì)，這樣可以包含貝殼、合金或有機(jī)物和/或無機(jī)物的混合物?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用且代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的特別有用的材料包括選自下述的材料二氧化硅(例如石英或玻璃)，橡膠，鈦，二氧化錫，釔，氧化鋁，和其它二價(jià)金屬氧化物(例如ZnO)，鈣鈦礦和其它壓電金屬氧化物(例如BaTiO》，ZnS，蔗糖，瓊脂糖和其它聚合珠子。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，微粒包含二氧化硅。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語"物理化學(xué)上可區(qū)分的"指珠子大小、特定視覺可檢測的標(biāo)記的存在與否和/或視覺可檢測的標(biāo)記的強(qiáng)度中任一項(xiàng)的可測量的差異?？梢詫⒈景l(fā)明設(shè)想到的珠子制成任何常規(guī)的規(guī)則的或不規(guī)則的三維形狀。但是，通常實(shí)用地合成小球或球狀顆粒。這樣的球或球狀顆粒在本文中也稱作"珠子"。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的"微粒"基本上是球形的或類似球狀的，或包含"微球"。盡管本發(fā)明的珠子可以稱作"微球"，顆粒的實(shí)際大小取決于許多因素，且顆粒實(shí)際上可以包含或不包含微米范圍的度量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子包含約300nm至約30nm的直徑(或非球狀顆粒的等同度量)，包括300nm，350nm，400nm，450nm，500nm，550nm，600nm，650nm，700nm，750認(rèn)，800nm，850nm，900nm5950nm，1.0一，1.1nm，1.2fim，1.3拜，1.4jim，1.5jim，1.6jim，1.7,，1.8fim，1.9jim，2.0拜，2.lfim，2.2拜，2.3叫2.4jim，2.5拜，2.6叫2.7拜，2.8jim,2.9叫3.0,，3.ljun,3.2pm，3.3拜，3.4jim，3.5jim，3.6拜，3.7拜，3.8拜，3.9拜，4.Ofim，4.l拜，4.2jim，4.3jtm,4.4叫4.5jim，4.6jim，4.7拜，4.8拜，4.9jim，5-Ofim，5.1叫5.2pm，5.3^un，5.4jim，5.5pm，5.6戶，5.7拜，5-8拜，5.9拜，6.0拜，6.l拜，6.2戶，6.3拜，6.4jim，6.5拜，6.6拜，6-7jim，6.8戶,6.9fim，7.0拜，7.ljim，7.2拜，7.3jun，7.4pm，7.5,，7.6拜，7.7jim，7.8jim，7.9拜，8.0拜，8.lfim，8.2fim，8.3拜，8.4fim，8.5拜，8.6拜，8.7叫8.8戶，8.9拜，9.0拜，9.l叫9.2n瓜，9.3片m，9,4拜，9.5jim，9.6拜，9.7拜，9.8叫,9.9叫,10fim，llpm，12,，13戶，14fim，15拜,16jim，17拜，18拜，19一，20jim，21叫22叫23叫24fim，25,26jim，27叫28拜，29拜，30nm。更優(yōu)選地，珠子包含ljim至10jim直徑(或非球形顆粒的等同度量)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子是由GeneraBiosystems生產(chǎn)的AmpaSand(商標(biāo)GeneraBiosystems)珠子。這些珠子可商業(yè)上得到，且記栽在www.generabiosystems.com/generabiosystems/technoloRy/AmpaSandBeads/。但是，不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明視作限于j吏用這些特定的珠子。在是否存在一種或多種"視覺可檢測的標(biāo)記"的基礎(chǔ)上，可以區(qū)分珠子。典型地，特定珠子可以包含O，1，2，3，4，5種視覺可檢測的標(biāo)記。如本文所使用的，術(shù)語"視覺可檢測的標(biāo)記"指會發(fā)射焚光、磷光和/或白熱的任何分子、原子或離子。方便的視覺可檢測的標(biāo)記包括會發(fā)射紫外線(波長范圍為約350nm至約3nm)、可見光(波長范圍為約350nm至約800nm)、近紅外(NIR)(波長范圍為約800nm至約1500nm)和/或紅外線(IR)(波長范圍為約1500認(rèn)至約10nm)的那些。但是，由于容易檢測，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測的標(biāo)記是在視覺波長范圍內(nèi)可檢測的。在本發(fā)明的其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測的標(biāo)記包含一種或多種選自下列的標(biāo)記熒光團(tuán)，半導(dǎo)體顆粒，磷顆粒，摻雜的顆粒或納米晶體或量子點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測的標(biāo)記是熒光團(tuán)。如本文所使用的，術(shù)語"熒光團(tuán)"指會表現(xiàn)出熒光性質(zhì)的任何分子。為了本文的目的，術(shù)語"熒光"可以定義為分子的吸收特定波長的光和重新發(fā)射更長波長的光的性質(zhì)。波長變化涉及在該過程中發(fā)生的能量損失。術(shù)語"熒光團(tuán)"可以包括許多視覺可檢測的標(biāo)記，例如化學(xué)熒光團(tuán)和染料，以及量子點(diǎn)。一種可以根據(jù)本發(fā)明使用的特別方便的視覺可檢測的標(biāo)記是包埋的半導(dǎo)體熒光顆粒。這些視覺可檢測的標(biāo)記顆粒可以很小，這樣它們的性質(zhì)和發(fā)射變成大小依賴性的。這樣的微小的視覺可檢測的標(biāo)記顆粒在本領(lǐng)域稱作半導(dǎo)體納米顆粒、量子點(diǎn)、量子線、量子棒或納米晶體或Q-顆粒。但是，如本文所使用的，術(shù)語"量子點(diǎn)"或"QD"應(yīng)當(dāng)理解為包括所有這樣的顆粒。而且，包含QD的視覺可檢測的標(biāo)記可以包含近似球形的或類似球形的顆粒，或包衣的球形的或類似球形的顆粒。但是，術(shù)語QD無論如何不應(yīng)當(dāng)視作限于球形的、類似球形的、環(huán)狀的、圓柱狀的或"點(diǎn)"的任何其它形態(tài)。例如，如本文所使用的QD也可以包含其它形態(tài)，包括，尤其是，棒狀、橢圓形、或包衣的棒狀或橢圓形顆粒。QD由半導(dǎo)體材料的納米級晶體心組成；生物學(xué)活性的形式典型地圍繞有保護(hù)殼和外衣。例如，QD可以包含直徑為約2nm至約30nm的半導(dǎo)體微晶，且可以在晶體內(nèi)含有約50-500000個(gè)原子，包括包含ZnS，ZnSe，ZnTe，CdS，CdSe，CdTe，PbS，PbSe，PbTe，HgS，HgSe，HgTe，Si，ZnO等材料的發(fā)光晶體。QD會發(fā)射寬吸收光譜和窄發(fā)射光譜的熒光。與有些其它的具有不同吸收光譜的熒光團(tuán)不同，QD會吸收超過寬光譜范圍的光，這允用許多光源(例如激光，弧光燈，或LED)激發(fā)量子點(diǎn)。而且，不同QD的集合可以用于使用僅一種激發(fā)源的多種用途。但是，每個(gè)點(diǎn)的發(fā)射光譜通常非常窄，是約30nm的量級，確切的顏色依賴于顆粒的直徑和組分。而且，QD的窄發(fā)射光鐠允許鄰近點(diǎn)的光譜分辨。除了上面的優(yōu)點(diǎn)外，QD也是相對耐光的，甚至在強(qiáng)激發(fā)過程中，且比熒光團(tuán)更亮。鑒于上述內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明包括使用不同大小的QD。而且，本發(fā)明設(shè)想到用熱處理、表面修飾、合金、表面鈍化或覆蓋表面涂層等方法處理的QD,使QD發(fā)射高量子產(chǎn)率，并提高耐光性較長的時(shí)間。QD也可以從QuantumDotCorp.(QDC)等/>司商業(yè)上得到，該7>司生產(chǎn)QD，例如Qdot[商標(biāo)]605抗生物素蛋白鏈菌素綴合物，其含有在605nm發(fā)射的竭化鎘心。也可以得到在525，565，585,和655nm發(fā)射的Qdot綴合物。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明絕不限于QD的特定組合物(或任何其它視覺可檢測的標(biāo)記)，且任何QD(商業(yè)的或其它的)可以與本發(fā)明兼容。也存在許多本領(lǐng)域可得到的熒光染料，其可以用作根據(jù)本發(fā)明的熒光團(tuán)。熒光染料或其它熒光團(tuán)的一種決定它的應(yīng)用潛力的重要性質(zhì)是熒光團(tuán)的激發(fā)波長；它必須與可得到的光源的波長匹配。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的許多不同的熒光染料和其它熒光團(tuán)，熒光標(biāo)記物的選擇，不會限制本發(fā)明?？梢杂糜跇?biāo)記底物的特別方便的熒光染料包括上面關(guān)于標(biāo)記PCR擴(kuò)增子討論的那些。但是，當(dāng)選擇焚光標(biāo)記物時(shí)，結(jié)合試劑使用的熒光標(biāo)記物的發(fā)射光語應(yīng)當(dāng)與擴(kuò)增子使用的標(biāo)記的發(fā)射光鐠不同。兩種染色技術(shù)常用于熒光地標(biāo)記珠子和微球內(nèi)部染色和外部染色(表面標(biāo)記)。這兩種技術(shù)產(chǎn)生具有獨(dú)特性質(zhì)的珠子，分別對于不同用途是有益的。內(nèi)部染色會產(chǎn)生非常穩(wěn)定的顆粒，其典型地具有狹窄的熒光發(fā)射。這些珠子經(jīng)常顯示出更大的對光漂白的耐受性。由于熒光團(tuán)在珠子的內(nèi)部，表面基團(tuán)可以用于將配體(蛋白，抗體，核酸等)綴合到珠子表面上。鑒于該原因，內(nèi)部地標(biāo)記的珠子典型地用于分析物檢測和免疫測定用途。表面標(biāo)記包含熒光團(tuán)向珠子表面的綴合。因?yàn)闊晒鈭F(tuán)是在珠子表面上，它們能與它們的環(huán)境相互作用，正如染色細(xì)胞上的熒光團(tuán)。結(jié)果是珠子標(biāo)準(zhǔn)物，其在許多不同的條件(例如存在污染物或改變pH)下，會表現(xiàn)出與染色的細(xì)胞樣品相同的激發(fā)和發(fā)射性質(zhì)。表面標(biāo)記的珠子的"環(huán)境響應(yīng)性的"性質(zhì)使得它們理論上適用于模仿生物學(xué)樣品。外部地標(biāo)記的珠子經(jīng)常用作許多使用熒光檢測的用途中的對照和標(biāo)準(zhǔn)物。但是，本發(fā)明設(shè)想到珠子與熒光標(biāo)記物通過任何方式的結(jié)合。術(shù)語"發(fā)磷光的珠子"、"磷光珠子"和"磷光劑"在本文中可互換地使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會容易地理解構(gòu)成發(fā)磷光的視覺可檢測的標(biāo)記的物質(zhì)。但是，作為實(shí)例，它們不以任何方式限制本發(fā)明，合適的磷光劑包括ZnS、ZnS:Cu、氧化銪和在顯示裝置使用的其它磷光劑的小顆粒。包含"摻雜的珠子"的視覺可檢測的標(biāo)記可以包括顆粒，后者包含封閉量的一種或多種稀土離子，例如Eu，Y，Yb，Sm等。如本文所使用的，術(shù)語"視覺可檢測的標(biāo)記"應(yīng)當(dāng)理解為也包括多種視覺可檢測的標(biāo)記，視覺可檢測的標(biāo)記的混合物，包衣的納米晶體，合金和熟練的技術(shù)人員顯而易見的其它復(fù)雜的混合物。所有這樣的視覺可檢測的標(biāo)記的應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)視作在本文所述的方法和試劑的范圍內(nèi)。而且，反應(yīng)物的視覺可檢測的標(biāo)記可以包含摻入固定化的多核苷而不是直接結(jié)合珠子本身的標(biāo)記。通常，用固定化的"標(biāo)簽，，或探針寡核苷酸標(biāo)記珠子。該標(biāo)簽攜帶內(nèi)胺(Niy，后者再通過綴合染料的琥珀酰亞胺基酯來修飾。在現(xiàn)有的設(shè)定中，使用的染料是BODIPY-TMR。通過混合標(biāo)記的和未標(biāo)記的標(biāo)簽，然后將該混合物綴合到珠子上，可以生成具有不同水平的熒光標(biāo)記物的珠子等級。方便地使用的比例是l:5X系列；也就是說，通過使用未標(biāo)記的標(biāo)記的標(biāo)簽的比例，產(chǎn)生不同的等級。在下面的表4中對此進(jìn)行了分類例證。表4-未標(biāo)記的標(biāo)記的標(biāo)簽的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>視覺可檢測的標(biāo)記可以用于在許多濃度或強(qiáng)度的珠子，從而提供另一種"在生物化學(xué)上區(qū)分"特定珠子的基礎(chǔ)。例如，如果將特定視覺可檢測的信號的最大可檢測強(qiáng)度視作100%，標(biāo)記可以應(yīng)用于許多珠子，產(chǎn)生0%，2%，4°/。，6%，8%,10°/。，15%,20%，25%，30%，35%，40%,45%,50%，60%，70%,80%，90%,100%的強(qiáng)度。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)物的珠子集合包含3.Onm，3.5戶，4.1,，5.Ojim，5.6fim和6.8拜的珠子，其中所述3.0拜，3.5戶和4.ljim直徑珠子纟皮0%和100°/。標(biāo)記，且5.Onm直徑珠子纟皮0°/。，100%和20%標(biāo)^己，且5.6nm和6.8jim直徑珠子華皮0%，100%，20%和4%標(biāo)記?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞剑瑢⒎磻?yīng)物的固定化的多核苷酸組分，例如cXn，cY和/或cZ，結(jié)合到珠子上。在它們的生產(chǎn)過程中，可以將固定化的多核苷酸包封在珠子中，或在生產(chǎn)后，可以將其結(jié)合到它們的表面上。用于結(jié)合多核苷酸和珠子的方法的選擇取決于使用的材料，如熟練的技術(shù)人員會容易地確定的。另外，可以在結(jié)合多核苷酸之前，對珠子進(jìn)行其它處理，包括硅烷化(用硅烷包被底物)，以便增加所述多核苷酸向珠子的結(jié)合。通常，可以用會共價(jià)地結(jié)合或吸附到珠子表面上的任何化合物包被珠子，另外，反應(yīng)物也應(yīng)當(dāng)具有用于結(jié)合多核苷酸的化學(xué)基團(tuán)，例如巰基、胺或羧基。具有這些特性的化合物的實(shí)例包括氨基-結(jié)尾的硅烷例如氨基-丙基三甲氧基硅烷或氨基-丙基三乙氧基硅烷。除了硅烷外，例如聚-L-賴氨酸，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，熟練的技術(shù)人員可以容易地識別其它化合物，包括適用于將多核苷酸結(jié)合到表面上的其它硅烷，本發(fā)明不受化合物的選擇的限制。可以使用任何方便的方式，將多核苷酸結(jié)合到珠子上，典型地，這通過物理吸附或化學(xué)連接來實(shí)現(xiàn)。另外，可以用促進(jìn)或增加多核苷酸向珠子表面的吸附或結(jié)合的試劑，例如氨基硅烷，進(jìn)一步包被珠子。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會容易地確定能執(zhí)行該功能的其它試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子通過UniversalAnchoringSystem(UAS)(商標(biāo)GeneraBiosystems)結(jié)合到珠子上。簡而言之，該系統(tǒng)包含使用"橋"核酸分子來將核酸"標(biāo)簽"序列連接到具有靶序列的底物上。"橋"序列部分地與標(biāo)簽序列互補(bǔ)，且部分地與靶序列互補(bǔ)，使得橋序列可以結(jié)合標(biāo)簽和靶序列，并使它們保持直線排列(alignment)對齊，以^使可以^使用連接酶連接標(biāo)簽和靶序列。UAS也是商業(yè)上可才尋至ij的,且詳細(xì){己栽在www,generabiosystems.com/generabiosystetns/technology/UAS/。但是，不應(yīng)當(dāng)以4壬4可方式將本發(fā)明視作限于將核酸分子連接到底物上的該特定方法。應(yīng)物上的任何方法，可以確定擴(kuò)增子和反應(yīng)物之間是否已經(jīng)發(fā)生結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可定義為測量當(dāng)細(xì)胞或顆粒在液體懸浮液中運(yùn)動(dòng)或流動(dòng)時(shí)的性質(zhì)的技術(shù)?？膳c更熟悉的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備顯微鏡類比，以進(jìn)一步描述該技術(shù)。大多數(shù)顯微鏡具有如下組成光源典型的顯微鏡使用燈泡照明物體。在流式細(xì)胞儀中，光源通常是激光。使用激光是因?yàn)樗鼈儠峁┓浅＜泻蛷?qiáng)烈的單色光束。光的單色特征在進(jìn)行熒光測量中特別重要。鏡臺在顯微鏡中，鏡臺是可移動(dòng)的，以允許物體通過目鏡的視野。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞或顆粒存在于液體懸浮液中。液體隨氣壓流經(jīng)物鏡，從而攜帶細(xì)胞或顆粒通過視野。透鏡在顯微鏡和流式細(xì)胞儀中，透鏡從物體收集光。一些顯微鏡具有濾鏡，以選擇對觀察者來說最重要的光的特征。在熒光顯微鏡中尤其如此。在熒光中，染料分子被特定波長的光激發(fā)，然后產(chǎn)生更長波長的發(fā)射光。濾鏡會除去激發(fā)光，以允許觀察或測量發(fā)射光。檢測器在顯微鏡中，光檢測器是觀察者。流式細(xì)胞儀使用稱為光電倍增管(PMT)的高靈敏性光檢測器。所述檢測器必須能夠測量來自細(xì)胞或顆粒的激發(fā)光的短暫閃爍，所述細(xì)胞或顆粒是以至多達(dá)每秒數(shù)千個(gè)的速率一次一個(gè)地通過物鏡視野。大多數(shù)流式細(xì)胞儀可測量散射光和焚光。圖1顯示了流式細(xì)胞儀的一個(gè)特定型號的主要組成。在底部的一個(gè)容器提供緩沖液，所述緩沖液攜帶細(xì)胞或顆粒通過儀器，而第二個(gè)容器收集所有廢液。載體流體(通常稱作鞘液)的目的是吸出懸浮液，以使細(xì)胞或顆粒以單列通過激光束。左前方的激光用藍(lán)色光束照明從試管向上流過的細(xì)胞或顆粒。正向的散射光通過與激光束(激光束本身被小的不透明柵阻擋)同軸的透鏡收集，并被反射到光檢測器上。通過與激光束成直角的透鏡收集側(cè)面散射光和熒光。所述儀器可測量在綠、橙和紅光譜區(qū)域的三色熒光。通過濾鏡分離顏色，所述濾鏡反射或只透過想要的波長至合適的探測器。最后，所有來自探測器的電子信號傳輸?shù)接涗浰鼈兒惋@示結(jié)果的計(jì)算機(jī)(未顯示)。因?yàn)樗械臏y量值都是同時(shí)針對每一個(gè)細(xì)胞的，因此可確定它們之間的相關(guān)性。并且，可使用一種測量法選擇細(xì)胞子集，以用另一種測量法進(jìn)行研究。例如，可以檢查熒光和顆粒大小。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測和/或分選珠子。然而，本發(fā)明絕不限定于前面描述的特定的流式細(xì)胞術(shù)方法或儀器。該實(shí)施例只作為說明性目的來提供，并且本發(fā)明不限定于根據(jù)提供的實(shí)施例的儀器或方法。使用流式細(xì)胞儀，通過物體散射光可確定給定的珠子的大小。光散射是光和物體的相互作用。所有物質(zhì)，包括珠子，都會散射光。其主要由反射或折射的光組成。觀察物體的位置通常決定可獲得的信息。在流式細(xì)胞儀中，光散射探測器通常位于激光的對面(相對于細(xì)胞或顆粒)，并且在激光的一側(cè)，與液流/激光束交點(diǎn)同軸。這些檢測器產(chǎn)生的測量分別稱為正向光散射和側(cè)向光散射。正向光散射會提供有關(guān)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的相對大小的一些信息，而側(cè)向光散射會提供有關(guān)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的相對粒度的一些信息。它們通常一起用于區(qū)分未分離的哺乳動(dòng)物血液中不同的主要種類的白細(xì)胞，但也用于許多種其它測定中，例如確定微粒的大小。本發(fā)明者已確定流式細(xì)胞術(shù)能夠區(qū)別直徑約3.Onm，約3.5nm，約4.ljim，約5.(Vm，約5.6nm和約6.8fim的珠子。也可以區(qū)分其它珠子量級，例如，5.0至5.6和5.6至6.8。因此，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)為，流式細(xì)胞術(shù)可區(qū)分至多達(dá)至少6種不同大小的珠子。除了大小檢測外，流式細(xì)胞儀通常具有一個(gè)或多個(gè)用于檢測樣品熒光的激光器和檢測器。熒光是分子的吸收特定波長光并再發(fā)射更長波長光的特性。波長的變化涉及在該過程中發(fā)生的能量損失。它是使熒光特別有用的特征濾鏡可用于排除來自光檢測器或觀測儀的激發(fā)光。因此，測量或觀察到的光只是來源于熒光團(tuán)的光。來自背景或照射到檢測器上的散射光的干擾是非常低的。有許多用于流式細(xì)胞術(shù)的熒光染料。它們結(jié)合多種細(xì)胞化學(xué)組分，例如核酸、蛋白、特定的細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)受體、細(xì)胞內(nèi)離子分子以及更多的成分。確定其用于流式細(xì)胞術(shù)測定的潛力的焚光染料的關(guān)鍵特征是激發(fā)波長，即它必須與可獲得的光源波長匹配。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者被病原性分析物感染的方法，所述方法包含(i)從推定包含所述病原性分析物的受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，從受試者擴(kuò)增對照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與包被有反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與分析物或分析物的特定菌抹的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合，指示著分析物在受試者中的感染。如本文所使用的，術(shù)語"受試者"指對另一種分析物的感染易感的任何生物。這樣，"受試者"包括但不限于，動(dòng)物，植物，真菌和細(xì)菌(其可以被噬菌體感染)。如本文所使用的，術(shù)語"動(dòng)物"優(yōu)選地包括哺乳動(dòng)物，且更優(yōu)選靈長類動(dòng)物，包括低等靈長類動(dòng)物，且更優(yōu)選人。但是，術(shù)語"動(dòng)物"也特別地包括家畜例如牛，馬，綿羊，豬，山羊和驢以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉鼠。兔子和嚙齒動(dòng)物，例如大鼠和小鼠，會提供方便的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或動(dòng)物模型，正如靈長類動(dòng)物和低等靈長類動(dòng)物一樣。也設(shè)想到非哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，例如鳥類、斑馬魚、兩棲動(dòng)物(包括蟾蜍)和果蠅種類例如黑腹果蠅。"受試者"也可以是非動(dòng)物，例如植物。術(shù)語"植物"具體地包括具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物，例如谷類植物(例如小麥，大麥，燕麥，黑麥，黑小麥和玉米)，水稻，果樹(例如蘋果，香蕉，芒果和柑橘)，甘蔗，園藝作物植物(例如土豆，胡蘿卜和洋蔥)等。但是，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷人受試者中HPV感染的方法，所述方法包含(i)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌株特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合指示著人受試者中的HPV感染。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明也設(shè)想到確定人受試者發(fā)展與一種或多種HPV菌林有關(guān)的疾病的危險(xiǎn)的方法，所述方法包含(i)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iU)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌株特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與包含多核苷酸的特定反應(yīng)物的結(jié)合，所述多核苷酸與特定疾病的相關(guān)HPV菌林互補(bǔ)，指示著受試者中所述疾病的增力口的危險(xiǎn)。如部分(v)所述的擴(kuò)增子的標(biāo)記是優(yōu)選的。因此，擴(kuò)增子和珠子都被標(biāo)記。與一種或多種特定HPV菌株有關(guān)的示例性疾病包括在表3中列出的那些。因此，在這方面，本發(fā)明提供了通過特異性地識別哪種HPV菌林感染受試者，診斷受試者發(fā)展特定疾病的增加的危險(xiǎn)的方法。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法適用于確定人受試者發(fā)展子宮頸癌的危險(xiǎn)。本發(fā)明還設(shè)想到用于本文所述的方法的診斷試劑盒，包括診斷人受試者的HPV感染和/或評價(jià)人受試者發(fā)展HPV相關(guān)疾病(包括子宮頸癌)的危險(xiǎn)。試劑盒包含反應(yīng)物的珠子集合，它們各自包含與特定HPV菌抹的核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上。任選地，試劑盒也可以包含結(jié)合到不同HPV菌株之間的保守序列上的引物，但是產(chǎn)生的擴(kuò)增子包含對于每種HPV菌林不同的核苷酸序列，其中所述產(chǎn)生的擴(kuò)增子推定與結(jié)合到試劑盒的一種或多種物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上的多核苷酸互補(bǔ)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)物的珠子集合包含至少一組珠子，各自具有約3.(Vm,約3.5jim，約4.ljim，約5.Ojim,約5.6nm和約6.8拜中的任一種直徑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子的每個(gè)尺寸組包含一個(gè)或多個(gè)微球子群，各自具有不同強(qiáng)度范圍的熒光標(biāo)記物。更優(yōu)選地，熒光標(biāo)記物是TMR，且在約0%，約4%，約20%和約100%的強(qiáng)度使用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包含引物GP5+和GP6+和任選的引物L(fēng)C1-F和LC1-R。試劑盒也可以是固相芯片或支持物的形式，通常稱作生物芯片。在受試者測定中使用的所有或部分試劑可以摻入生物芯片或微小化到納米測定。盡管流式細(xì)胞術(shù)在測量受試者測定的輸出中是特別有用的，生物芯片可以用于測量或自動(dòng)化其它信號，例如與回音壁模式(whisperinggallerymode)測定有關(guān)的那些。盡管熒光強(qiáng)度是多重方法的優(yōu)選方面，本發(fā)明也設(shè)想到其它形式的鑒別。一種這樣的替代方法包括回音壁模式(WGM)檢測。在該實(shí)施方案中，將熒光標(biāo)記物摻入子集珠子中，或摻入或結(jié)合到珠子表面上的DNA。該熒光標(biāo)記物可以用激光或未聚焦的白光源或用過濾的未聚焦的白光源激發(fā)WGM。WGM只允許某些波長的光從顆粒發(fā)射出來。該現(xiàn)象的結(jié)果是，來自例如熒光團(tuán)的普通的寬發(fā)射(10-lOOnm寬)帶受到限制，并作為一系列尖峰來出現(xiàn)，它們有效地與顆粒內(nèi)的光的靜止模式圖語相對應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定WGM特性是對微球顆粒表面的變化非常敏感的，且當(dāng)微球顆粒與分析物或它環(huán)境中的分子相互作用時(shí)，WGM特性會變化。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測分析物的方法，所述分析物例如來自包含菌抹特異性序列的HPV菌林的擴(kuò)增子，所述方法包含使至少一個(gè)微球顆粒集合接觸推定包含所述分析物的樣品，其中微球顆粒集合內(nèi)的每個(gè)顆粒包含視覺可檢測的標(biāo)記和固定化的推定的所述分析物的結(jié)合伴侶(例如能結(jié)合、捕獲或固定化來自HPV菌林的擴(kuò)增子的引物或探針)，其中每個(gè)顆粒集合具有確定的WGM特性，其中所述分析物向所述固定化的結(jié)合伴倡的結(jié)合，會導(dǎo)致所述至少一個(gè)微球顆粒集合的所述WGM特性的變化，這指示著所述分析物的存在。本發(fā)明的方法可以用于檢測微球顆粒的WGM特性的調(diào)控，其中所述調(diào)控來自樣品中的分子向固定化在微球顆粒表面上的潛在結(jié)合顆粒的結(jié)合的檢測?；赪GM特性的靈敏變化，檢測分析物和它的結(jié)合伴侶之間的結(jié)合反應(yīng)，能鑒別和分離分析物。本發(fā)明的一個(gè)特征是，可以用寬范圍的光源激發(fā)微球顆粒，促進(jìn)許多不同WGM特性的測量。"視覺可檢測的標(biāo)記"可以是發(fā)射熒光、磷光和/或白熱的任何分子、原子或離子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測的標(biāo)記是熒光團(tuán)，其可以包括許多視覺可檢測的標(biāo)記，例如化學(xué)熒光團(tuán)和染料，以及量子點(diǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了微球顆粒，其包含直徑為lnm至lOOjim的橡膠(latex)或二氧化珪顆粒，并用視覺可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，例如熒光團(tuán)或量子點(diǎn)，該顆粒還包含待測分析物的推定的結(jié)合伴侶。一個(gè)實(shí)例是捕獲核酸分子，其能結(jié)合使用側(cè)接菌林特異性區(qū)域的HPV基因組的保守區(qū)的2個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)生的HPV擴(kuò)增子。視覺可檢測的標(biāo)記在可見波長是可檢測到的，且該微球顆粒會表現(xiàn)出一種或多種WGM特性。當(dāng)分析物與固定化在顆粒上的結(jié)合伴侶相互作用時(shí)，會可檢測地調(diào)控微球顆粒的一種或多種WGM特性。WGM特性的任何這樣的變化，指示著已經(jīng)結(jié)合到它的結(jié)合伴侶上的分析物的存在。下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明實(shí)施例1:HPV診斷-DNA分離和擴(kuò)增在圖2中顯示了用于分離HPV診斷方法中的DNA的DNA提取方法的概況。如圖3所示，使用PCR來擴(kuò)增DNA樣品。使用引物GP5+和GP6+來產(chǎn)生存在于DNA樣品中的任何HPV菌林的擴(kuò)增子。引物GP6+包含熒光標(biāo)記物，更具體地是Cy5，以允許以后觀察擴(kuò)增子向結(jié)合試劑的結(jié)合。產(chǎn)生的病毒擴(kuò)增子包含保守區(qū)(Y)(它在所有檢查的HPV菌抹中是保守的)和在HPV菌抹之間可變的(即菌林特異性的)區(qū)域Xn,其中n代表與每種HPV菌林有關(guān)的可變區(qū)。固定化在珠子上的結(jié)合伴倡會特異性地結(jié)合HPV菌林特異性的基因組。另外，使用LC1—F和LC1-R引物作為對照，也產(chǎn)生了來自人受試者基因組DNA的擴(kuò)增子。在該情況下，引物L(fēng)Cl一R也攜帶Cy5標(biāo)記。實(shí)施例2:HPV診斷-多重檢測使在實(shí)施例1中產(chǎn)生的擴(kuò)增子與結(jié)合試劑的陣列雜交，每種結(jié)合試劑攜帶與從每種HPV菌林c，11，16，18，31，33，35，42，45，51，52，56，58，59，67和68(X,至Xj產(chǎn)生的推定病毒擴(kuò)增子的可變區(qū)互補(bǔ)的多核苷酸。固定化到珠子上的捕獲核酸的核苷酸序列見圖9。而且，該陣列包含，含有與HPV病毒擴(kuò)增子的保守區(qū)(Y)互補(bǔ)的多核苷酸的結(jié)合試劑。最后，包括如下的結(jié)合試劑，其包含與人對照擴(kuò)增子序列互補(bǔ)的多核苷酸。捕獲核酸可以是DM或RNA。如果使用RNA，可能需要逆轉(zhuǎn)錄酶來從DNA擴(kuò)增子產(chǎn)生RM。陣列中的每種結(jié)合試劑包含具有不同大小和不同熒光(TMR)標(biāo)記強(qiáng)度的微球或珠子。使用如圖4所示的流式細(xì)胞術(shù)，可以將具有3.Onm，3.5nm，4.ljim，5.O^irn,5.6fim和6.8jun的直^圣的珠子彼J:匕區(qū)分開。對于每種給定大小的微球，熒光標(biāo)記物(TMR)以0%，4%，20%和100%的相對強(qiáng)度摻入。使用如圖5所示的流式細(xì)胞術(shù)，可以清楚地區(qū)分開這些標(biāo)記強(qiáng)度。在圖1中顯示了讀取強(qiáng)度的機(jī)器。圖6是顯示在陣列中使用的每種結(jié)合試劑的示意圖?？梢钥闯?，陣列寸吏用具有3.0nm，3.5jun，4.1jim,5.Ojim，5.6jim和6.8jim直徑的微球，且焚光標(biāo)記物信號強(qiáng)度為0%，4%，20%和100%。不過，在更小的珠子大小的情況下，使用更少量級的信號強(qiáng)度。圖7顯示了如何在大小和熒光標(biāo)記強(qiáng)度的基礎(chǔ)上區(qū)分這些結(jié)合試劑中的每一種。圖8顯示了結(jié)合的擴(kuò)增子與陣列中的3種特異性的結(jié)合試劑的結(jié)合。在該圖中，證實(shí)了擴(kuò)增子會結(jié)合人DNA對照(Z)、病毒保守序列(Y)和病毒可變序列X7，這指示著HPV菌林18在樣品中的存在。實(shí)施例3:對比多重檢測方法和傳統(tǒng)的HPVi^斷下面的表5提供了對比本發(fā)明的多重HPV檢測方法和現(xiàn)有的HPV診斷的組織學(xué)方法的概況。表5HPV診斷方法的對比<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例4檢測人樣品中的HPV圖IOA至G提供了實(shí)施例，其中在人樣品中檢測到了HPV或發(fā)現(xiàn)缺少HPV。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白，本文所述的發(fā)明可以進(jìn)行具體描述以外的變化和修飾。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修飾。本發(fā)明也包括在本說明書中單獨(dú)地或統(tǒng)一地提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，和任一種或多種所述步驟或特征的任意和所有組合。參考文獻(xiàn)BonnerandLaskey，Eur.J.Biochem.46:83，1974Chadwicketal.，J.Virol.Methods70:59-70，1998ChanandFox,Rev.Med.Microbiol.10:185-196，1999Compton，Nature350:91-92，1991DemidovandBroude(Eds.)，"MAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications",HorizonBioscience,2004Gearhartetal.，www.emedicine.com/MED/topicl037.htm，2004Guatellietal.，Proc.NatlAcad.Sci.USA87:1874-1878，1990Hill，J.ClinKievitsetalKuskeetal.，1998Lizardietal.，Biotechnology6:1197-1202，1988Lyamichevetal.，Nat.Biotechnol.17:292-296，1999MarmurandDoty,J.Mol.Biol.5:109，1962NelsonandKrawetz，Anal.Biochem.207(1):97-201，1992Pawlotskyetal.，J.Virol.Methods79:227-235，1999Ryanetal.，Mol.Diagn.4:135-144，1999Speel,Histochem.Cel1Biol.112:89-113,1999Toddetal.，J.AIDSHum.Retrovirol.10:S35-S44,1995.UgandAssay19:43-51，1996.，JVirol.Methods35:273-286，1991ApplEnviron.Microbiol.64(7):2463—247權(quán)利要求1.珠子集合，其用于檢測HPV菌株和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌株，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌株特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌株。2.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述珠子大小選自3.O;xm，3.5拜，4.l拜，5.Ojim，5.6戶和6.8,。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的珠子集合，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP，別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3,光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-l，噢唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa熒光染料，包括AlexaFluro-350，—430，—488，-532，—546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4'，5'-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素(J0E);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和R0X;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四曱基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B,FluorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的珠子集合，其中所述珠子上的核酸捕獲探針是DM。5.權(quán)利要求l的珠子集合，其包含2-16個(gè)珠子子集。6.權(quán)利要求5的珠子集合，其中所述珠子集合包含16個(gè)珠子子集。7.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述HPV菌林選自菌林6，11，1618,31，33,35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。8.權(quán)利要求7的珠子集合，其中所述HPV菌林選自6，11,31和33。9.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述核酸捕獲探針選自SEQIDNO:5至20。10.制備用于檢測一種或多種HPV菌抹和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林的珠子集合的方法，該方法包含選擇多珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌抹特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識別子集身份，并從而識別HPV菌林。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述珠子大小選自3.Ojim,3.5jim，4.ljim，5.Ofim，5.6jim和6.8拜。12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，曱氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP，別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，瘞唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa焚光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4'，5'-二氯-2，，7，-二曱氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和ROX;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四曱基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，B0DIPY-FL和德克薩斯紅。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸捕獲探針是DNA。14.權(quán)利要求13的方法，包含選擇2至16個(gè)珠子子集。15.權(quán)利要求14的方法，包含選擇16個(gè)珠子子集。16.權(quán)利要求10的方法，其中所述HPV菌林選自6，11,16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述HPV菌林選自菌林6，11,31和33。18.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸捕獲探針選自SEQIDNO:5至20。19.診斷人受試者中HPV感染的方法，所述方法包含(viii)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ix)從所述樣品分離核酸；(x)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(xi)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對照核酸序列；(xii)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(xiii)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(xiv)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合指示著人受試者中的HPV感染。20.確定人受試者發(fā)展與一種或多種HPV菌抹有關(guān)的疾病的危險(xiǎn)的方法，所述方法包含(viii)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ix)從所述樣品分離核酸；(x)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所迷分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(xi)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對照核酸序列；(xii)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(xiii)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(xiv)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與包含多核苷酸的特定反應(yīng)物的結(jié)合，所述多核苷酸與特定疾病的相關(guān)HPV菌抹互補(bǔ)，指示著受試者中所述疾病的高危險(xiǎn)。21.權(quán)利要求19和20的方法，其中所述珠子大小選自3.Onm，3.5拜，4.ljim，5.Ojim，5.6nm和6.8拜。22.權(quán)利要求19或20中任一項(xiàng)的方法，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP,別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYTOXBlue，hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1,SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，瘞唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa焚光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680,-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7,熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4、5'-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和R0X;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四甲基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。全文摘要本發(fā)明一般地涉及診斷和檢測測定領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的一種或多種分析物的存在或區(qū)分它們的方法和試劑，包括生物芯片。文檔編號G01N15/14GK101341257SQ200580040234公開日2009年1月7日申請日期2005年12月9日優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日發(fā)明者K·波特,T·戈?duì)柕律暾埲?杰納羅生物系統(tǒng)有限公司