梔子提取物在制備抗含ndm-1耐藥基因大腸桿菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及清開靈活性組分梔子提取物對含NDM-1耐藥基因大腸桿菌(Escherichia coli)具有抑制作用，因此它可用于抑制該病菌并治療和/或預(yù)防該細菌引起的疾病。
【專利說明】梔子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥物中的 應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明是中國發(fā)明專利申請（發(fā)明名稱：清開靈活性組分桅子提取物在制備抗多 重耐藥菌的藥物中的應(yīng)用；申請日：2012年12月17日；申請?zhí)枺?01210550177.x)的分案 申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及桅子的一種新的醫(yī)藥用途，具體地說是在桅子提取物制備抗多重耐藥 菌藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 多重耐藥菌（multiple resistant bacteria)是指有多重耐藥性的病原菌，即一 種微生物對三類（比如氨基糖苷類、紅霉素、B -內(nèi)酰胺類）或三類以上抗生素同時耐藥。 其中最為多見的是NDM-1、MDR-TB、MDR-MRSA以及常在I⑶中出現(xiàn)的鮑曼不動桿菌和銅綠 假單胞菌。NDM_l(New Delhi metallo-0-lactamase-l，新德里金屬內(nèi)酰胺酶），又名 NDM-1細菌，是一種耐碳青霉烯類的酶。NDM-1基因常由質(zhì)粒攜帶，但也整合在細菌的染色 體上，易于在不同的菌株間傳播和擴散，NDM-1編碼的蛋白單體分子量為28kDa，它的序列 和其他MBL的序列相似性很低。NDM-1主要分布在腸桿菌科和鮑曼不動桿菌中，攜帶NDM-1 的細菌不但包括條件致病菌，也包括致病菌，如常見的志賀氏菌、霍亂、綠膿假單胞桿菌等。 它具有高度耐藥性，幾乎可以水解臨床常用的一線抗菌藥物，包括內(nèi)酰胺類、碳青霉烯 類、氟喹諾酮類、氨基糖苷等。長期以來，抗生素藥物的濫用，是催生多重耐藥菌的重要原 因。目前，多重耐藥菌感染呈現(xiàn)出增長趨勢，但抗菌藥物選擇方案卻很少，因此重耐藥菌感 染已成為全球性棘手問題。
[0004] 桅子（茜草科植物桅子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實）為清熱 解毒復(fù)方中藥清開靈注射液的主要原料藥，具有護肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用， 在中醫(yī)臨床常用于治療黃疸型肝炎、扭挫傷、高血壓、糖尿病等癥，并且具有良好的效果。開 發(fā)和研究桅子更多更好的醫(yī)藥功效，是許多中醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是要開發(fā)桅子提取物的新醫(yī)藥用途，同時為臨床提供一種可有效 拮抗多重耐藥菌的藥物。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)桅子提取物對含NDM-1耐藥基因細菌具有顯著 地抑制作用，且與藥物濃度成正比，從而發(fā)明了桅子提取物的一種新的醫(yī)藥用途，即完成了 桅子提取物在制備抗多重耐藥菌藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的桅子提取物可按照常規(guī)的中藥提取方法進行。
[0008] 本發(fā)明在此提供的方法如下：
[0009] (1)取桅子適量，加水煎煮兩次，過濾，合并兩次濾液；
[0010] (2)所得濾液減壓濃縮，放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾 液回收乙醇，加水稀釋,過濾；
[0011] (3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用水、乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回 收乙醇至無醇味，得桅子提取物，冷藏。
[0012] 其中，步驟（1)中，加水煎煮，第一次加8倍量的水，煮沸2小時，第二次加6倍量 的水，煮沸1小時；步驟（2)中，加水稀釋至相對密度1. 05?1. 2 (60°C );步驟（3)中，洗脫 劑水用量是5?7倍量柱體積、乙醇是8?10倍量柱體積的40%乙醇。
[0013] 本發(fā)明所述桅子提取物，可按照現(xiàn)有技術(shù)所述方法制備成顆粒、沖劑、射劑、膠囊 等藥物制劑。
[0014] 本發(fā)明中所述的多重耐藥菌是指含有NMD-1基因的多重耐藥菌，包括乙酸鈣不 動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii, A.baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)或含NDM-1 耐藥 基因大腸桿菌（Escherichia coli)。
[0015] 上述含NDM-1耐藥基因檢測菌株為革蘭氏陰性菌，具有較強的致病性和抗生素耐 藥性。其中，乙酸鈣不動桿菌和鮑曼不動桿菌可引起肺部感染、傷口及皮膚感染、泌尿生殖 系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌能引起嚴重的呼吸系統(tǒng)感染等， 含NDM-1耐藥基因大腸桿菌可引發(fā)對腸道感染且對抗生素具有抗藥性。
[0016] 更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗乙酸鈣不動桿菌藥物中的應(yīng) 用，即桅子提取物在制備治療和/或預(yù)防乙酸鈣不動桿菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗鮑曼不動桿菌藥物中的應(yīng)用， 即桅子提取物在制備治療和/或預(yù)防鮑曼不動桿菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌藥物中 的應(yīng)用，即桅子提取物在制備治療和/或預(yù)防嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌引起的疾病的藥物中 的應(yīng)用。
[0019] 更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥物 中的應(yīng)用。
[0020] 更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥 物中的應(yīng)用，即桅子提取物在制備治療和/或預(yù)防含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引起的疾病 的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明所述桅子制劑可用于治療上述由含NDM-1耐藥基因多重耐藥細菌引發(fā)的 疾病，如含NDM-1耐藥基因多重耐藥細菌引發(fā)的腸道感染、呼吸系統(tǒng)感染、傷口及皮膚感 染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，尤其是適用于治療由乙酸鈣不動桿菌、鮑 曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌或含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引發(fā)的疾病。
[0022] 本發(fā)明所述藥物制劑在作為本發(fā)明的用途使用時，其具體用量可根據(jù)臨床試驗以 及患者的具體情況確定。

【具體實施方式】
[0023] 以下通過實施例和試驗例來進一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果。
[0024] 實施例1 :
[0025] 桅子提取物的制備方法
[0026] (1)取桅子適量，加水煎煮兩次，第一次加8倍量的水，煮沸2小時，第二次加6倍 量的水，煮沸1小時，過濾，合并兩次濾液；(2)所得濾液減壓濃縮至原藥材量1. 5?2倍體 積時,放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇，加水稀釋到相對 密度為1. 05?1. 2 (60°C )，過濾；(3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用5?7倍量柱體 積的水、8?10倍量柱體積的40%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得 桅子提取物，冷藏。
[0027] 藥效學(xué)試驗
[0028] 試驗例1
[0029] 桅子提取物對含NDM-1耐藥基因細菌的抑菌效果研究
[0030] 本藥效學(xué)試驗所采用的檢測菌株：乙酸f丐不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus, A. calcoaceticus)> 鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii, A.baumannii)和嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia， S. maltophilia)，均含有 blaNDM-1 耐藥基因；pGEX-4T-NDMl-DH5 a 是含 NDM-1 重組質(zhì)粒 的大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli) ;pGEX-4T-NDM-l-BL21(在大腸桿菌 BL21 中表達 NDM-1)是含NDM-1重組質(zhì)粒的大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli)，其質(zhì)粒上帶有GST 標(biāo)簽。上述菌株均由中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所提供。
[0031] 配制LB瓊脂培養(yǎng)基，高壓冷卻至60°C時，取桅子提取物，按1:9(藥物：LB，V/V)比 例配制不同濃度藥物（0. lg/ml、0. 2g/ml、0. 3g/ml)平板，瓊脂厚度3-4mm，制備藥物平板， 備用。
[0032] 研究桅子對含NDM-1耐藥基因細菌進行抑菌實驗：
[0033] 將4株含NDM-1基因耐藥菌株乙酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單 胞菌及大腸桿菌PGEX-4T-NDM1-DH5 a分別接種于含16 y g/ml亞胺培南的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，次日菌液用無菌PBS緩沖液稀釋10倍后，分別吸取2 yl接種于 藥物瓊脂平板表面或采用劃線法接種，平板置于37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況， 得桅子提取物的抑菌性測定結(jié)果，見表1。
[0034] 采用瓊脂稀釋法對桅子提取物的最小抑菌濃度（MIC)進行測定，將耐藥菌株接種 于不同藥物濃度的瓊脂平板上，37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況，抑制菌株不能生 長的最小藥物濃度（MIC值）分別為乙酸鈣不動桿菌0. 3g/ml、鮑曼不動桿菌0. 3g/ml、嗜麥 芽寡養(yǎng)窄食單胞菌 〇? 2g/ml、pGEX-4T-NDM-l-BL21 0? 3g/ml。
[0035] 實驗結(jié)果表明：桅子對耐藥菌株均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用明 顯增強，說明桅子對含NDM-1耐藥基因耐藥菌都有抑制作用，且抑菌效果明顯；藥物對不同 檢測菌株的抗菌能力不同，MIC也有所差異，具有較強的廣譜抗含NDM-1耐藥基因耐藥菌的 能力。
[0036] 表1桅子提取物濃度對菌株的影響
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述桅子提取物由桅子藥材，加水煎煮兩 次，過濾，合并濾液，所得濾液減壓濃縮，放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過 濾，濾液回收乙醇，加水稀釋到相對密度為1. 05?1. 2 (60°C )，過濾，所得濾液上大孔吸附 樹脂,依次用5?7倍量柱體積的水、8?10倍量柱體積的40%乙醇洗脫，收集洗脫液，過 濾，減壓回收乙醇至無醇味，即得。
【文檔編號】A61P31/04GK104383048SQ201410502576
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月17日
【發(fā)明者】李 東, 黃留玉, 袁靜, 王雪松, 姜海 申請人:神威藥業(yè)集團有限公司