同時(shí)測(cè)定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定細(xì)菌抗藥性和耐藥性測(cè)定方法，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定 亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1961年jevons在英國(guó)首先發(fā)現(xiàn)MRSA，20世紀(jì)60年代中期擴(kuò)展至歐洲許多國(guó) 家及加拿大，70年代末MRSA極具增多遍及全球，耐藥范圍日益擴(kuò)大，耐藥程度日益嚴(yán)重。 80年代后期已成為全球性的病原菌，居醫(yī)院感染病原菌的首位，占教學(xué)醫(yī)院分離金葡菌的 60-80%。20世紀(jì)90年代后期又出現(xiàn)了耐萬(wàn)古的MRSA。目前MRSA是超級(jí)細(xì)菌的重要組成 部分，其耐藥性強(qiáng)、死亡率高已成為與HBV、AIDS并列世界范圍內(nèi)的3大難解決的感染性疾 病。因此探討MRSA的來(lái)源及其耐藥機(jī)制，尋找有效的控制方法，是遏制其感染流行的最有 效途徑。
[0003]消毒劑與抗生素同屬于具有特殊抑殺微生物作用的化學(xué)物質(zhì)，它們對(duì)微生物的作 用機(jī)制也有很多相同或相似之處，某些耐藥的微生物同樣可能產(chǎn)生對(duì)消毒劑的抗性現(xiàn)象。 美國(guó)學(xué)者提出抗生素和消毒劑促成MRSA的選擇和維持性的可能性，實(shí)驗(yàn)證明金葡菌含有 多種抗生素和消毒劑的抗藥性質(zhì)粒，并發(fā)現(xiàn)他們之間存在著一定的聯(lián)系。大量的流行病學(xué) 數(shù)據(jù)也顯示：金黃色葡萄球菌的耐藥菌株對(duì)消毒劑的抗性升高。圍繞金黃色葡萄球菌家族 qac基因和0-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因研宄顯示，qac基因所在的質(zhì)粒同時(shí)攜帶抗菌藥物耐 藥基因，而葡萄球菌0 -內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因blaz和兩個(gè)緊密連接的基因blai和blaR的 轉(zhuǎn)座子Tn552和大質(zhì)粒如pST6也在同一質(zhì)粒上。也有報(bào)道指出qac基因、0-內(nèi)酰胺酶和 latk基因同在多耐藥質(zhì)粒pMs62上，后者還攜帶ermc,frA,acAaphD，產(chǎn)生對(duì)紅霉素、甲氧喃 啶等抗生素耐藥，這些為金黃色葡萄球菌抗藥性和消毒劑交叉耐藥提供一些提示和參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性測(cè)定方法，本發(fā)明方 法具有將細(xì)菌的抗藥性、耐藥性和敏感性恢復(fù)三者結(jié)合，特別是能很直觀看到抗藥性、耐藥 性之間的變化規(guī)律及聯(lián)系，具有準(zhǔn)確、直接地揭示二者的內(nèi)部聯(lián)系的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 一種同時(shí)測(cè)定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)制備含干擾劑的金黃色葡萄球菌的菌懸液；
[0007] (2)配制不同種類(lèi)不同濃度的消毒劑對(duì)所述含干擾劑的金黃色葡萄球菌的菌懸液 進(jìn)行殺菌試驗(yàn)并測(cè)定每一代亞致死量金黃色葡萄球菌的抗藥性；同時(shí)測(cè)定所述每一代亞致 死量金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥性；連續(xù)做20代；
[0008] (3)敏感性恢復(fù)實(shí)驗(yàn)：選取經(jīng)消毒劑亞致死量篩選的第20代金黃色葡萄球菌作為 原代菌，接種到血液增菌肉湯管中培養(yǎng)并制備成血液增菌肉湯菌懸液，將所述血液增菌肉 湯菌懸液進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)；重復(fù)上述步驟至第40代。
[0009] (4)根據(jù)所述步驟（2)、（3)和（4)的測(cè)定結(jié)果，找出所述亞致死量金黃色葡萄球 菌對(duì)所述消毒劑的抗藥性及其對(duì)所述抗生素的耐藥性的變化規(guī)律及聯(lián)系。
[0010] 本發(fā)明所述同時(shí)測(cè)定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述步驟（1)具體包括如下步驟：
[0011] 將所述金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，經(jīng)分離培養(yǎng)后將所述金黃色葡 萄球菌分成單個(gè)細(xì)菌，并使其獨(dú)立分裂繁殖形成單獨(dú)菌落；用接種針挑取所述分離培養(yǎng)得 到的典型菌落接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，在35-37°C條件下培養(yǎng)24h形成菌苔；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%磷酸鹽緩沖液洗下所述菌苔，經(jīng)振蕩均勻并經(jīng)無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾后得到濾液，用無(wú)菌水稀 釋所述濾液制備成濃度為〇. 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的菌懸液；將所述菌懸液與干擾劑溶液做對(duì)倍稀釋 配成l〇ml的濃度為7. 5X107cfu/ml含有干擾劑的菌懸液備用，所述干擾劑溶液時(shí)由成品 血清白蛋白30g和蒸餾水1000mL混勻后用0. 45ym微孔濾膜過(guò)濾除菌制備而成，所述干擾 劑溶液中牛血清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %。
[0012] 本發(fā)明所述同時(shí)測(cè)定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述步驟（2)具體包括如下步驟：
[0013]各濃度碘伏的制備：取11個(gè)無(wú)菌試管分別編號(hào)心~An，用注射器把編號(hào)A2~A^ 的試管各加入4毫升蒸餾水，取4毫升碘伏原液加入八:號(hào)試管中，所述碘伏原液中有效碘 的濃度為5000mg/l;再取4毫升所述碘伏原液加入A2號(hào)試管混勻得到A2碘伏液，其有效 碘的濃度為2500mg/l;然后從^號(hào)試管取4毫升A2碘伏液加到A3號(hào)試管，其有效碘的濃 度為1250mg/l;-次操作至A1(l號(hào)試管，依此類(lèi)推八4號(hào)試管有效碘的濃度為625mg/l45號(hào) 試管有效碘的濃度為312. 5mg/l;八6號(hào)試管有效碘的濃度為156. 25mg/l;A7號(hào)試管有效碘 的濃度為78. 13mg/l;A8號(hào)試管有效碘的濃度約為39. 06mg/l;A9號(hào)試管有效碘的濃度約為 19. 53mg/l;A1(I號(hào)試管有效碘的濃度為9. 77mg/l;An號(hào)試管不加消毒液，只是4毫升蒸餾水 作為陽(yáng)性對(duì)照；
[0014] 各濃度溶葡萄球菌酶的制備：取9個(gè)無(wú)菌試管分別編號(hào)ai~a9，用注射器把編號(hào) a2~a9的試管各加入4毫升蒸餾水，取4毫升溶葡萄球菌酶原液加入a:號(hào)試管中，所述葡 萄球菌酶原液中溶葡萄球菌酶的濃度為1000U/L;再取4毫升所述溶葡萄球菌酶原液加入 a2號(hào)試管混勻得到a2溶葡萄球菌酶溶液，其濃度為500U/L;然后取4毫升所述a2溶葡萄球 菌酶溶液加到a3號(hào)試管中得到a3溶葡萄球菌酶溶液，其溶葡萄球菌酶的濃度為250U/L;依 次操作至a8號(hào)試管，依此類(lèi)推a4號(hào)試管溶葡萄球菌酶的濃度為125U/L;a5號(hào)試管溶葡萄球 菌酶的濃度為62. 50U/L仿6號(hào)試管溶葡萄球菌酶的濃度為31. 25U/L;a7號(hào)試管溶葡萄球菌 酶濃度為15. 63U/L;a8號(hào)試管溶葡萄球菌酶的濃度，為7. 80U/L;a9號(hào)試管只加入4毫升 蒸餾水不含消毒液作為陽(yáng)性對(duì)照；
[0015]各濃度含氯消毒液的制備：取11個(gè)無(wú)菌試管并編號(hào)&~Bn，首先制備有效氯 為5000.Omg/1作為原液，用注射器把B2~Bn的試管各加入4毫升蒸餾水，取4毫升濃度 為5000.Omg/1有效氯原液加入81號(hào)試管中，有效氯的濃度為5000mg/l;再取4毫升加入 B2號(hào)試管混勻得到B2含氯消毒液，其有效氯的濃度為2500mg/l;然后取4毫升所述B2含 氯消毒液加到所述B3號(hào)試管混勻的到B3含氯消毒液，其有效氯的濃度為1250mg/l;依次 操作至B1(l號(hào)試管，依此類(lèi)推B4號(hào)試管中有效氯的濃度為625mg/l;B5號(hào)試管中有效氯的 濃度為312. 5mg/l;B6號(hào)試管中有效氯的濃度為156. 25mg/l;B7號(hào)試管中有效氯的濃度為 78. 13mg/l;B8號(hào)試管中有效氯的濃度為39. 06mg/l;B9號(hào)試管中有效氯的濃度為19. 53mg/ 1 ;B1(I號(hào)試管中有效氯的濃度為9.77mg/l;11號(hào)試管只加入4毫升蒸餾水，不含消毒液作為 陽(yáng)性對(duì)照；
[0016] 以所述制備好的含干擾劑的金黃色葡萄球菌的菌懸液為原代，取樣接種所需培養(yǎng) 基斜面，然后分別同所述配置好的各濃度碘伏、含氯消毒劑及溶葡萄球菌復(fù)合酶作用，所述 碘伏的作用時(shí)間為〇. 5min，所述含氯消毒劑的作用時(shí)間為5min，所述溶葡萄球菌復(fù)合酶的 作用時(shí)間為6min;然后立刻轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)的中和劑的肉湯管中中和10分鐘，中和后轉(zhuǎn)種計(jì) 數(shù)平皿，再?gòu)母髯缘挠?jì)數(shù)平皿上取亞致死量的金黃色葡萄球菌，重復(fù)上述步驟至20代，比 較所述20代亞致死量金黃色葡萄球菌的抗藥