一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液的制作方法
【專利摘要】一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是犬干細(xì)胞技術(shù)。本發(fā)明修復(fù)液中包含犬類干細(xì)胞活性成份提取液，該提取液是從犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中提取得到的，包括多種活性生長因子、膠原蛋白、活性多肽、微量元素、透明質(zhì)酸等物質(zhì)，可以快速促進(jìn)細(xì)胞和組織生長、活化和再生，在治療犬難愈性創(chuàng)面方面能發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)式的調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明修復(fù)液可以快速有效地促進(jìn)皮膚和手術(shù)創(chuàng)面的愈合，以及修復(fù)皮膚和眼部的潰瘍，具有良好的科研和臨床價值。
【專利說明】一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】的犬干細(xì)胞技術(shù)，尤其是快速促進(jìn)犬創(chuàng)傷組織愈合的 犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液的制備方法及其臨床應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stem cells, BMSCs)是骨髓中具有自我更新和 多向分化潛能的細(xì)胞群。具有來源廣泛、采集方便、體外易于擴(kuò)增、低免疫原性等特性，是目 前再生醫(yī)學(xué)、組織工程、基因治療等方面比較理想的種子源細(xì)胞。犬BMSCs在特定的環(huán)境中 可以定向分化，從而達(dá)到修復(fù)細(xì)胞和組織損傷的作用。有研究表明，除了干細(xì)胞本身的分化 作用外，其旁分泌作用在修復(fù)過程中發(fā)揮了更大的作用。犬BMSCs能夠分泌大量的細(xì)胞因 子，其分泌因子在功能上主要可分為免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡、血管發(fā)生、支持干/祖細(xì)胞的 增殖與分化、化學(xué)趨化、抗瘢痕六大類。它們通過自分泌或旁分泌的方式，改善機(jī)體局部微 環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞向傷口部位的遷移和分化，挽救瀕臨凋亡的細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng) 傷組織的目的。犬干細(xì)胞分泌因子包括干細(xì)胞因子（SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)、內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子（VEGF)、表皮細(xì)胞生長因子（EGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、胰島素樣生長 因子（IGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉(zhuǎn)化生長因子、I、II、 III、IV型膠原蛋白、各種溶菌酶等20余種活性物質(zhì)。
[0003] 犬活潑好動，由于運(yùn)動所導(dǎo)致的外傷屢見不鮮，同時手術(shù)創(chuàng)面、皮膚和眼部潰瘍的 修復(fù)也是臨床中常見的問題，創(chuàng)傷和創(chuàng)面的愈合是一個錯綜復(fù)雜的生物學(xué)過程，該過程通 過細(xì)胞因子的高度協(xié)調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用來修復(fù)受損組織。細(xì) 胞因子的協(xié)調(diào)不良或功能障礙均可導(dǎo)致創(chuàng)面愈合"失控"，在臨床上表現(xiàn)為創(chuàng)面難愈。
[0004] 目前犬創(chuàng)傷和潰瘍的治療原則首先是局部治療服從全身治療，其次創(chuàng)面的外科處 理是局部治療的前提和基礎(chǔ)，如局部清創(chuàng)和抗感染等，最后采用某些措施和方法來促進(jìn)難 愈性創(chuàng)面愈合。傳統(tǒng)的方法主要包括傳統(tǒng)醫(yī)藥類、新型敷料類、基因工程藥物（生長因子） 類以及組織工程類。存在的主要問題是抗感染差、血管化延遲、制備技術(shù)復(fù)雜、生產(chǎn)周期長， 價格昂貴以及組織工程皮膚存在生理缺陷等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種犬創(chuàng)傷、手術(shù)創(chuàng)面和皮膚潰瘍能夠快速愈合的修復(fù) 液，該修復(fù)液可以快速有效地促進(jìn)皮膚和手術(shù)創(chuàng)面的愈合，以及修復(fù)皮膚和眼部的潰瘍。
[0006] 本發(fā)明快速愈合犬創(chuàng)傷組織的修復(fù)液，其特征在于該修復(fù)液中包含犬類干細(xì)胞活 性成份提取液，所述提取液是從犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中提取得到的。
[0007] 所述的修復(fù)液中還含有0. 5%-1%提取液質(zhì)量的透明質(zhì)酸。
[0008] 所述的修復(fù)液中還含有0. 3%-0. 5%提取液質(zhì)量的防腐劑丙酸鈣。
[0009] 所述的犬類干細(xì)胞活性成份提取液包括干細(xì)胞因子（SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF)、表皮細(xì)胞生長因子（EGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、胰島 素樣生長因子（IGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉(zhuǎn)化生長因 子、I、II、III、IV型膠原蛋白和溶菌酶。
[0010] 所述的犬類干細(xì)胞活性成份提取液是通過以下的步驟制備而得的： 步驟1 :從健康幼齡犬骨髓中體外分離培養(yǎng)大量的BMSCs ; 步驟2 :收集BMSCs培養(yǎng)上清液，超聲破碎BMSCs并離心取上清； 步驟3 :微孔徑濾膜過濾，濃縮。
[0011] 本發(fā)明利用犬干細(xì)胞增殖過程中能分泌諸如抗炎、血管發(fā)生、胞外基質(zhì)重塑、纖維 組織形成和表皮細(xì)胞再生等愈合相關(guān)因子，可大規(guī)模生產(chǎn)、活性高、使用安全相比于單一因 子更適合體內(nèi)環(huán)境，且不涉及干細(xì)胞使用中存在的爭議，因此具有良好的科研和臨床價值。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 :快速愈合犬創(chuàng)傷組織的修復(fù)液，該修復(fù)液中包含犬類干細(xì)胞活性成份 提取液，透明質(zhì)酸以及防腐劑丙酸鈣。
[0013] 所述的修復(fù)液具體提取步驟如下： 步驟1，犬BMSCs的體外分離：常規(guī)麻醉幼犬，髂后上棘備皮、消毒、鋪巾，用含Iml肝素 鈉的骨髓穿刺針分2-3點(diǎn)共抽取骨髓約10ml，混勻防凝，迅速轉(zhuǎn)入50ml消毒離心管，用等 量DMEM/F12稀釋混勻；取10支底部加入5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管，加入的淋巴細(xì)胞 分離液濃度為1. 077 g/ml，上層分別貼壁流入等量骨髓稀釋液，封口，控制溫度4°C，離心機(jī) 轉(zhuǎn)速為2000 r/min，離心20 min去除上層脂肪細(xì)胞，吸取中間交界處白膜層細(xì)胞，然后用 4°C的10 ml DMEM/F12混勻洗滌界層細(xì)胞，再次離心20 min，轉(zhuǎn)速2000 r/min，去除上清 液，重復(fù)上述洗滌界層細(xì)胞步驟1次；用含15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基5ml重懸沉積物。
[0014] 步驟2,臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活力：取0.4g臺盼藍(lán)，加入100 ml的0.1 M PBS 溶液中，配制成0. 4%臺盼藍(lán)溶液，0. IM PBS溶液配方：NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 488g，KH2PO4 0.2g，加三蒸去離子水至1000 ml，調(diào)整PH值為7. 4,0.22 Mm濾膜過濾除 菌。取0. 4%臺盼藍(lán)溶液0. 5 ml、DMEM/F12培養(yǎng)基0. 3 ml和細(xì)胞懸液0. 2 ml充分混勻， 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未著色細(xì)胞）和死細(xì)胞（著色細(xì)胞），共計(jì)數(shù)500個細(xì)胞，計(jì)算 細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（％) =(細(xì)胞總數(shù)一著色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)X 100%。如臺盼藍(lán)染 色細(xì)胞活力彡95%，則可進(jìn)行下一步操作，否則重復(fù)步驟1 (重復(fù)步驟1、犬BMSCs的體外分 離)。
[0015] 步驟3,大量培養(yǎng)BMSCs :首次培養(yǎng)時用含15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素（雙抗）的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，以I X IO6Ail細(xì)胞密度5 ml的培養(yǎng)液 接種于25 cm2的一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于溫度37°C，5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，培養(yǎng)3天后首次換液，去除紅細(xì)胞、懸浮生長的骨髓造血干細(xì)胞及其它未貼壁的骨髓干 細(xì)胞，以后每隔3天換液1次，即換新鮮的含有15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉 素的DMEM/F12培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至70%?80%融合時，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min， 用含10%的FBS及雙抗的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液按1:3 傳代，倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細(xì)胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代 擴(kuò)增，收集。
[0016] 步驟4,干細(xì)胞活性成份的提取：犬BMSCs用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)IO7個，PBS洗滌3 次，溶于30 ml滅菌生理鹽水中；超聲破碎細(xì)胞，條件：超聲10 s，間隔時間5 s，超聲強(qiáng)度4， 超聲次數(shù)5次，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白及營養(yǎng)成分充分溶出；控制溫度4°C，轉(zhuǎn)速為10000 r/min， 離心10 min，取上清液，去掉細(xì)胞碎片；用孔徑為0.22 Mm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白 濃度，調(diào)整濃度為200 Pg/ml，4°C保存，標(biāo)記為A液。待細(xì)胞長到最旺盛時，測培養(yǎng)基pH值 為5. 5-6. 0,取上層培養(yǎng)液30 ml ;因上層培養(yǎng)液含有大量酚紅和其他成分，用50 k超濾膜 過濾，使其體積濃縮至5 ml左右取出，加入5 ml滅菌生理鹽水，定容至10 ml;用孔徑為 0.22 Mm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為200 Pg/ml，4°C保存，標(biāo)記為B液。 將上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到干細(xì)胞活性提取液。
[0017] 步驟5,干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液的制備：以步驟4所得干細(xì)胞活性成份提取液40 ml為原料，按質(zhì)量比為0. 5%-1%的比例加入透明質(zhì)酸，達(dá)到皮膚保濕和快速愈合傷口的目 的；同時按質(zhì)量比〇. 3%-0. 5%的比例加入防腐劑丙酸鈣，以延長保存時間和增加治愈效果。
[0018] 將本發(fā)明制備的修復(fù)液進(jìn)行應(yīng)用，對創(chuàng)傷組織進(jìn)行治療，并與其他的常規(guī)治療方 法做相關(guān)的對比試驗(yàn)。
[0019] 對比試驗(yàn)如下： 不同品種犬9只，年齡為3-5歲，隨機(jī)分為三組，每組3只，第一組為治療組，使用本發(fā) 明的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液；第二組為常規(guī)治療組，使用碘酒；第三組為對照組，使用 生理鹽水。
[0020] 將9只犬用3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，背部皮膚去毛，消毒，用手術(shù)刀片制備直徑為 I cm的圓形創(chuàng)面，深度為達(dá)皮膚全層，但不觸及肌肉，每天分3次分別在創(chuàng)面上涂抹不同的 藥物，進(jìn)行相應(yīng)的治療。在給予治療的第3,6,9,12,15,18, 21天測量創(chuàng)面大小，進(jìn)行愈合 指標(biāo)觀察：在創(chuàng)后各時間點(diǎn)用消毒的透明薄膜貼于創(chuàng)口上，沿創(chuàng)緣劃線，記錄后用圖像分析 儀測定創(chuàng)面面積；動物致傷后立即測的面積為傷口原始面積。殘留面積百分率=殘留面積 /原始面積X 1〇〇%。
[0021] 創(chuàng)面殘留面積/原始面積的百分比代表創(chuàng)面愈合速度，治療結(jié)果顯示，犬干細(xì)胞 分泌因子修復(fù)液可加快創(chuàng)面的愈合速度：在第6天與對照組比較差異顯著，對照組創(chuàng)面在 傷后18-21天基本愈合，而犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液治療組創(chuàng)面在傷后12-15天已全部愈 合，提前了 6-7天，并且愈合速度明顯優(yōu)于碘酒治療組，結(jié)果列于表1中。
[0022] 結(jié)果表明，利用本發(fā)明的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液可明顯抑制創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)， 快速愈合犬創(chuàng)傷部位的皮膚組織，減少瘢痕組織的形成，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0023] 表1 傷后不同時間創(chuàng)面殘留面積百分比（％， x± s)

【權(quán)利要求】
1. 一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，其特征在于該修復(fù)液中包含 犬類干細(xì)胞活性成份提取液，所述提取液是從犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中提取得到的。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，其特征 在于所述的修復(fù)液中還含有〇. 5%-1%提取液質(zhì)量的透明質(zhì)酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，其特征 在于所述的修復(fù)液中還含有〇. 3%-0. 5%提取液質(zhì)量的防腐劑丙酸鈣。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，其特 征在于所述的犬類干細(xì)胞活性成份提取液包括干細(xì)胞因子（SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF)、表皮細(xì)胞生長因子（EGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、胰島 素樣生長因子（IGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉(zhuǎn)化生長因 子、I、II、III、IV型膠原蛋白和溶菌酶。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種快速愈合犬創(chuàng)傷組織的犬干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，其特征 在于所述的犬類干細(xì)胞活性成份提取液是通過以下的步驟制備而得的： 步驟1 :從健康幼齡犬骨髓中體外分離培養(yǎng)大量的BMSCs ; 步驟2 :收集BMSCs培養(yǎng)上清液，超聲破碎BMSCs并離心取上清； 步驟3 :微孔徑濾膜過濾，濃縮。
【文檔編號】A61P17/02GK104324053SQ201410506749
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】嚴(yán)玉霖, 汪登如, 曹景鋒, 陳玲, 汪逸 申請人:嚴(yán)玉霖, 汪登如