一種抗體靶向修飾的阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗體靶向修飾的阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物,所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物以氫化大豆卵磷脂和膽固醇形成磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),將二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇穿插在磷脂雙分子層,將水溶性藥物包裹進(jìn)脂質(zhì)體中,并在脂質(zhì)體表面修飾有抗體。本發(fā)明還涉及該靶向藥物遞釋復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在,本發(fā)明的靶向納米載藥體系具有良好的生物相容性;通過物理作用將親水性藥物包裹進(jìn)雙層脂質(zhì)體內(nèi),與游離的藥物相比,可以明顯提高藥物靶向性、延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,提高藥物的生物利用率;對(duì)阿爾茲海默病的治療提供一種無創(chuàng)傷給藥方式。
【專利說明】一種抗體靶向修飾的阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地說,是一種抗體靶向修飾的阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默病(AD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化,日常生活能力進(jìn)行性減退,并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。隨著社會(huì)老齡化程度不斷加劇,越來越多的老年人開始受到老年癡呆疾病的困擾,目前全世界患老年癡呆癥的人數(shù)已近3000萬(wàn),患病人數(shù)仍以每年460萬(wàn)的速度在增加。我國(guó)的患病人數(shù)約有500萬(wàn),是世界上癡呆患者最多的國(guó)家之一。因此預(yù)防和治療老年癡呆的研究有著重要的意義。
[0003]研究表明,β樣淀粉蛋白(Αβ )聚集成淀粉樣神經(jīng)纖維是產(chǎn)生毒性的必要條件。淀粉樣蛋白在細(xì)胞表面聚集是因?yàn)榈矸蹣忧绑w蛋白APP在Y分泌酶的作用下產(chǎn)生的有毒性作用的多肽片段Αβ卜42,疏水性的淀粉樣蛋白Αβ卜42與細(xì)胞表面的磷脂分子神經(jīng)節(jié)苷脂GMl作用,在神經(jīng)元細(xì)胞表面聚集成纖維狀,插入磷脂雙分子層,改變膽固醇水平,改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性及通透性,激活細(xì)胞表面相關(guān)信號(hào)分子,致使細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂,依次激活鈣依賴性激酶、蛋白酶、脂肪酶、細(xì)胞內(nèi)自由基生成,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至死亡。人參皂苷Rbl是人參的主要有效成分,其可以明顯提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元的活力,具有促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)元的作用;人參皂苷能保護(hù)培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞少受自由基損傷,增強(qiáng)神經(jīng)元抗氧化能力,減輕氧自由基對(duì)神經(jīng)元的損害。
[0004]連接特異性配體的聚合物載體可靶向至相應(yīng)受體高表達(dá)的組織和細(xì)胞。腦主動(dòng)靶向研究較廣泛的受體有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體、葉酸等。但有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)鐵蛋白并不是理想的腦部導(dǎo)向分子,轉(zhuǎn)鐵蛋白導(dǎo)向的藥物與受體結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)抑制,受體基本被內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和,導(dǎo)致導(dǎo)向效率偏低。一種單克隆抗體mAb270能夠靶向乙酰膽堿受體,可實(shí)現(xiàn)高效的腦轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0005]氫化大豆卵磷脂和膽固醇具有生物可降解、生物相容性較好、毒性較低,形成的納米尺寸雙層脂質(zhì)體可實(shí)現(xiàn)親水性藥物的包裹。同時(shí)抗體通過脂質(zhì)體表面的活性基團(tuán)很容易修飾到載體表面,實(shí)現(xiàn)載體向腦神經(jīng)細(xì)胞的主動(dòng)靶向。
[0006]本發(fā)明涉及的抗體靶向修飾的阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物,國(guó)內(nèi)外尚未見類似的研究報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物。
[0008]本發(fā)明的再一的目的是,提供一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一的目的是,提供一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物的應(yīng)用。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物,所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物以氫化大豆卵磷脂和膽固醇形成磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),將二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇穿插在磷脂雙分子層,將水溶性藥物包裹進(jìn)脂質(zhì)體中,并在脂質(zhì)體表面修飾有抗體。
[0011]所述的水溶性藥物為人參皂苷Rbl。
[0012]所述的脂質(zhì)體表面的馬來酸酐基團(tuán)鏈接巰基化的抗體,所述的抗體為單克隆抗體mAb270o
[0013]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物的制備方法,所述的方法包括以下步驟:取氫化大豆卵磷脂、膽固醇和二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇于1.5 ml的離心管中,65°C加熱溶解于0.3 ml的乙醇溶液中,吸取于I ml注射器中;取3 ml的250 mM的硫酸銨溶液于玻璃瓶中65°C加熱,磁力攪拌下加入人參皂苷使其完全溶解;取出注射器,緩慢將注射器中的油相注入水相中,磁力攪拌10-15min形成包裹人參皂苷的脂質(zhì)體;用巰基化的抗體與包裹人參皂苷的脂質(zhì)體在常溫?cái)嚢柘路磻?yīng)過夜,載體表面的馬來酸酐活性基團(tuán)與巰基化的抗體反應(yīng),最后用50K的透析膜將游離的抗體透析除去,制備得到抗體靶向藥物納米載體,即靶向藥物遞釋復(fù)合物。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明的靶向藥物遞釋復(fù)合物(I)以氫化大豆卵磷脂、膽固醇和DSPE-mPEG2000為基本材料形成類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的雙層脂質(zhì)體結(jié)構(gòu),借助脂質(zhì)體中親水成分與水溶性藥物Rbl之間的相互作用,將藥物包裹進(jìn)脂質(zhì)體中,形成納米尺寸的載藥體系;
(2)通過納米載體表面的活性基團(tuán),將單克隆抗體mAb270連接到納米載體表面,借助抗原抗體特異結(jié)合效應(yīng),使載藥納米粒子靶向神經(jīng)細(xì)胞;所述的納米載藥體系與游離藥物相比具有更長(zhǎng)的半衰期,能顯著提高藥物的生物利用率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]附圖1是靶向納米載藥體系構(gòu)建示意圖。
[0017]附圖2是靶向納米載藥體系粒徑檢測(cè)。
[0018]附圖3是淀粉樣蛋白Aβ 25-35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12活性檢測(cè)。
[0019]附圖4是靶向藥物遞送載體復(fù)合物抑制Αβ 25_35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷。
[0020]附圖5是靶向藥物遞送載體復(fù)合物抑制A β 25_35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。
[0021]附圖6是靶向藥物遞送載體復(fù)合物抑制A β 25_35對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞膜損傷。
[0022]附圖7是原子力顯微鏡檢測(cè)靶向藥物遞送載體復(fù)合物抑制Αβ25_35對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞膜損傷。
[0023]附圖8是靶向藥物遞送載體復(fù)合物抑制A β 25_35對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞骨架損傷。
[0024]附圖9是靶向藥物遞送載體復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PPAR Y含量上升。
[0025]附圖10是靶向藥物遞送載體復(fù)合物降低細(xì)胞膜表面膽固醇含量。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0027]實(shí)施例1
取氫化大豆卵磷脂(PC)、膽固醇(Choleaterol)和DSPE_mPEG2000于1.5 ml的EP管中,加熱溶解于0.3 ml的乙醇溶液中(65°C),吸取于I ml注射器中;取3 ml的250 mM的硫酸銨溶液于玻璃瓶中65°C加熱,磁力攪拌下加入人參皂苷使其完全溶解;取出注射器,緩慢將注射器中的油相注入水相中,磁力攪拌10_15min形成包裹人參皂苷的脂質(zhì)體;用巰基化的抗體與包裹人參皂苷的脂質(zhì)體在常溫?cái)嚢柘路磻?yīng)過夜,載體表面的馬來酸酐活性基團(tuán)與巰基化的抗體反應(yīng),最后用50K的透析膜將游離的抗體透析除去,制備得到抗體靶向藥物納米載體。
[0028]實(shí)施例2
測(cè)樣品的準(zhǔn)備:用MilliQ-water稀釋10倍透析后的祀向藥物納米載體;取0.5mL待測(cè)樣品,加入樣品池,并確認(rèn)測(cè)定容器中無氣泡產(chǎn)生后。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)量條件為:170°散射角,25°C。
[0029]實(shí)施例3
高度分化的PC12細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度種于96孔板,在37°C,5% C02培養(yǎng)條件孵育。設(shè)0,10,15,20,25,30 μ M淀粉樣蛋白處理的實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)空白對(duì)照,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。淀粉樣蛋白處理24h后,加入CCK-8試劑,培養(yǎng)基:CCK-8試劑的體積比為10:1(CCK_8試劑10 μ L),置于搖床上搖勻,放入培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞1.5 h。采用酶標(biāo)儀(TECAN ModelSafire2),在波長(zhǎng)為450nm處測(cè)定各孔的OD值。
[0030]實(shí)施例4
高度分化的PC12細(xì)胞種于96孔板,在含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、對(duì)照組、AD模型組和不同濃度包裹人參皂苷靶向納米載體的保護(hù)組,其中對(duì)照組細(xì)胞不作處理;AD模型組細(xì)胞只用25 μ mol/L淀粉樣蛋白處理24h ;而包裹人參皂苷靶向納米載體保護(hù)組先用不同濃度(10、20、30、40、50 μ mol/L)的人參皂苷預(yù)處理24h (為了描述方便,以下所指的人參皂苷均表示用靶向載體包裹人參皂苷),再用淀粉樣蛋白與不同濃度的人參皂苷共孵育24h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)過不同的處理后,加入事先稀釋好的CCK-8試劑10 μ L,各孔加入培養(yǎng)基至100 μ L0 96孔板置于搖床上搖勻,放入培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞1.5 h。在波長(zhǎng)為450nm處利用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的OD值,計(jì)算細(xì)胞的存活率。
[0031]實(shí)施例5
實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、AD模型組和人參皂苷低濃度保護(hù)組及人參皂苷高濃度保護(hù)組。各組細(xì)胞經(jīng)過不同的條件處理后,用ROS檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
[0032]檢測(cè)ROS的熒光探針DCFH-DA先按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋。本實(shí)驗(yàn)采用收集細(xì)胞后裝載探針的方法,故收集好的各組細(xì)胞先用無血清的培養(yǎng)基漂洗兩遍,加入稀釋好的DCFH-DA溶液10 μ M ;然后,細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,其間每隔3_5 min晃動(dòng)混勻一下,以使探針充分進(jìn)入細(xì)胞,與細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)合;再用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三遍,以充分除去細(xì)胞外的DCFH-DA,避免其干擾;最后重懸各組細(xì)胞,在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光探針的熒光強(qiáng)度,分析活性氧水平。
[0033]實(shí)施例6
細(xì)胞膜氧化情況采用脂質(zhì)氧化(104)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分。第一部分是樣品的制備:將不同處理組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,裂解完全后,高速離心取上清液進(jìn)行后續(xù)分析測(cè)定。裂解過程在冰浴上進(jìn)行。第二部分是104的測(cè)定:第一步,對(duì)試齊0盒進(jìn)行處理,按照說明書的步驟分別配置!'8八儲(chǔ)存液和10八檢測(cè)工作液,并用適量蒸餾水配置標(biāo)準(zhǔn)品。第二步,對(duì)樣品進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)組分為空白對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組。各實(shí)驗(yàn)組取0.11111,隨后加入0.21111 10八檢測(cè)工作液,混勻后置于沸水浴15111111。水浴后,冷卻至室溫,離心后取上清液在532=0處用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析10八含量。第三部分是蛋白濃度的測(cè)定:第一步,蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置,據(jù)說明書配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白的吸收曲線。第二步,測(cè)定樣品中蛋白的濃度,取與10八測(cè)定過程中相同量的樣品按說明書進(jìn)行分析。據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,推算出樣品中總蛋白的含量。
[0034]據(jù)樣品中總蛋白含量及丙二醛的含量計(jì)算單位量蛋白中丙二醛的含量,從而分析細(xì)胞膜的氧化情況。
[0035]實(shí)施例7
實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、仙模型組和低濃度人參皂苷保護(hù)組及高濃度人參皂苷保護(hù)組。將細(xì)胞以適當(dāng)密度種于六孔板貼壁2處,其中仙模型組用25 ^ 001/1淀粉樣蛋白處理2處;而人參皂苷保護(hù)組先用不同濃度的人參皂苷預(yù)處理2處,兩個(gè)保護(hù)組再用淀粉樣蛋白與相應(yīng)濃度的人參皂苷共孵育2處。細(xì)胞經(jīng)不同的處理后,吸去培養(yǎng)基,用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞15111111,然后用超純水洗滌細(xì)胞2-3次,室溫下自然干燥。將制備好的樣品置于八的VI掃描臺(tái)上,采用⑶社狀!:模式成像。實(shí)驗(yàn)采用100 0 111大小的掃描器,111208娃探針,微懸臂的彈性系數(shù)為2.8圖像處理用自帶軟件〈I? 2.1版)進(jìn)行平滑處理,以消除低頻背景噪音。
[0036]實(shí)施例8
高分化的細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏确N于玻片,設(shè)置對(duì)照組、八0模型組和低濃度人參皂苷保護(hù)組及高濃度人參皂苷保護(hù)組。經(jīng)淀粉樣蛋白和人參皂苷處理后,吸除培養(yǎng)基,用沖洗3遍,然后冰浴下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20舊!!,隨后再用?83緩沖液清洗細(xì)胞3遍。將事先配置好的200 11 I 1*110(1211111116-1)11211101(1111工作液滴置玻片上,使細(xì)胞充分浸泡在1*110(^1111116-1)1^1101(1111工作液中。室溫避光孵育細(xì)胞,孵育過程在一個(gè)密閉的濕盒內(nèi)進(jìn)行以避免溶液的蒸發(fā)。細(xì)胞孵育60111111后,用?83沖洗3遍以去除未進(jìn)入細(xì)胞的
1-110(181111116-1)1181101(1111染色液。最后,進(jìn)行封片,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0037]實(shí)施例9
實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、人參皂苷處理組、仙模型組、低濃度人參皂苷保護(hù)組和高濃度人參皂苷保護(hù)組。含量的分析按照抗體標(biāo)記說明書進(jìn)行操作分析:第一步:先離心收集細(xì)胞,再用緩沖液清洗細(xì)胞3遍。第二步:將羅丹明8811(:標(biāo)記的兔抗??八8 V抗體按比例稀釋,不同組細(xì)胞在41避光條件用抗體稀釋液孵育過夜。第三步:用?83緩沖液清洗細(xì)胞2遍,隨后重懸細(xì)胞,上機(jī)進(jìn)行流式分析。
[0038]實(shí)施例10
實(shí)驗(yàn)設(shè)置四個(gè)不同的處理組,分別為對(duì)照組、仙模型組和低濃度人參皂苷保護(hù)組及高濃度人參皂苷保護(hù)組。細(xì)胞在不同情況下處理后,收集細(xì)胞進(jìn)行處理。先用清理液八清3遍,再用抗干擾液0處理10111111。然后,加入膽固醇染色液0室溫避光孵育30 111111后,用清理液纟清洗3遍。最后用清理液重懸細(xì)胞,上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0039]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明方法的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充,這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種阿爾茨海默病靶向藥物遞釋復(fù)合物,其特征在于,所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物以氫化大豆卵磷脂和膽固醇形成磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),將二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇穿插在磷脂雙分子層,將水溶性藥物包裹進(jìn)脂質(zhì)體中,并在脂質(zhì)體表面修飾有抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物,其特征在于,所述的水溶性藥物為人參皂苷Rb I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物,其特征在于,所述的脂質(zhì)體表面的馬來酸酐基團(tuán)鏈接巰基化的抗體,所述的抗體為單克隆抗體mAb270。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物的制備方法,其特征在于,所述的方法包括以下步驟:取氫化大豆卵磷脂、膽固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇于1.5ml的離心管中,65°C加熱溶解于0.3 ml的乙醇溶液中,吸取于I ml注射器中;取3 ml的250 mM的硫酸銨溶液于玻璃瓶中65°C加熱,磁力攪拌下加入人參皂苷使其完全溶解;取出注射器,緩慢將注射器中的油相注入水相中,磁力攪拌10-15min形成包裹人參皂苷的脂質(zhì)體;用巰基化的抗體與包裹人參皂苷的脂質(zhì)體在常溫?cái)嚢柘路磻?yīng)過夜,載體表面的馬來酸酐活性基團(tuán)與巰基化的抗體反應(yīng),最后用50K的透析膜將游離的抗體透析除去,制備得到抗體靶向藥物納米載體,即靶向藥物遞釋復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的靶向藥物遞釋復(fù)合物在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK104288102SQ201410542823
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】李威, 柯長(zhǎng)洪, 孫赟, 蔣成, 陳迪, 祝仙弟, 張付雷, 趙孟鑫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)