豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法，屬于豬支原體肺炎滅活疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開了一種由水相和油相按照1：1-3的體積比組成的豬支原體肺炎滅活疫苗，所述水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5：95-98的比例組成，所述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的比例組成。本發(fā)明進一步公開了制備所述豬支原體肺炎滅活疫苗的方法。本發(fā)明滅活疫苗的乳化佐劑中加入了具有親水和疏水基的聚氧乙烯40氫化蓖麻油，顯著增強了疫苗的乳化效果，顯著降低了白油用量和疫苗的粘稠度，減低了注射的難度和動物的應激反應，抗體在較長的時間內(nèi)能保持在較高的水平，對仔豬免疫效果顯著。
【專利說明】豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及滅活疫苗，尤其涉及豬支原體肺炎滅活疫苗，本發(fā)明進一步涉及制備 該豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，屬于豬支原體肺炎滅活疫苗的制備領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引發(fā)的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺 炎，其病原最早由Mare、Switzer(1965)和Goodwin等（1965)從患肺炎豬的肺組織中分離 出，并在實驗室復制出本病，報導后該病原被命名為M. hyopneumoniae。長期以來，本病被 認為是對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失、最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一。本病 雖為老病，但近年來由于經(jīng)常和豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒等其它病原混合感染，造成重大 的經(jīng)濟損失而突顯出了其重要性。中國地方豬種對本病明顯較引入品種易感。帶菌豬是本 病的主要傳染源，病原體是經(jīng)氣霧或與病豬的呼吸道分泌物直接接觸傳播，其經(jīng)母豬傳給 仔豬使本病在豬群中持久存在。其嚴重程度常因管理水平、季節(jié)、通風條件、豬的密度以及 其它環(huán)境因素改變而有很大差異，最早可能發(fā)生于2?3周齡（地方品種有9日齡的）的 仔豬，但一般傳播緩慢，在6?10周齡感染較普遍，許多豬直到3?6月齡時才出現(xiàn)明顯癥 狀。易感豬與帶菌豬接觸后，發(fā)病的潛伏期大的為十天或更長時間，并且所有自然發(fā)生的病 例均為混合感染，包括支原體、細菌、病毒及寄生蟲等。
[0003]目前，預防豬支原體性肺炎的弱毒活疫苗存在操作復雜、不易推廣的問題，亟待開 發(fā)一種操作簡單，免疫動物后能夠提高體液免疫反應和增強免疫效果的豬支原體肺炎滅活 疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法，該 方法制備工藝簡單，所制備的滅活疫苗免疫動物后能夠提高體液免疫反應并增強免疫效 果。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種豬支原體肺炎滅活疫苗，所述滅活疫苗由水相和油相按照 1 :1-3的體積比組成；其中，所述的水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5 :95-98的 體積比組成；所述的油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油（KolliphorRH40)、司本-80和白油按 照1-2 :5-8 :90-94的體積比組成。
[0007]為了達到更好的技術(shù)效果，所述滅活疫苗由水相和油相按照1 :1的體積比組成。
[0008] 優(yōu)選的，所述的水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照4 :96的體積比組成；所 述的油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1 :6 :93的體積比組成。
[0009] 本發(fā)明還公開了一種制備所述豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液，收獲菌液；⑵加入滅活劑將菌液滅活；⑶制備油相 和水相，將油相和水相混合，乳化；（4)將乳化好的疫苗定量分裝，密封，即得。 toon] 其中，步驟（1)中采用發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液；所述的培養(yǎng)方 式如下：按發(fā)酵罐容積5% -20%的量將豬肺炎支原體接種到培養(yǎng)基中，優(yōu)選為PPLO肉湯培 養(yǎng)基；在以下培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)：溫度37°C、pH值7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，通氣培養(yǎng) 15-96小時；采用逐步擴大培養(yǎng)方式，一直到所需的量；收獲菌液。對收獲的菌液進行抗原 濃度測定，要求5XIO8變色單位<抗原水平/頭份< 2XIOltl變色單位。
[0012] 步驟（2)中所述的滅活劑為二乙烯亞胺（BEI)，其終濃度達到2mmol/L，其中BEI 用2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA)與0. 2mol/L的NaOH溶液在37°C下水浴Ih(每隔15、20min搖 勻一次）配制成所需濃度的BEI滅活液，以0. 22μm濾膜濾器過濾除菌，2?8°C存放備用；
[0013] 加入滅活劑后在37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時；然后加入硫代硫酸鹽滅菌水溶液 中和過剩的二乙烯亞胺，在37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時。
[0014] 步驟（3)中，所述油相的制備方法包括以下步驟：按體積比計，將白油90-94份 加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1-2份，混勻，將油溫降到50°C以后加入司 本-805-8份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；優(yōu)選的，所述油相的制備方法包括 以下步驟：按體積比計，將白油93份加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份，混勻， 將油溫降到50°C以后加入司本-806份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；
[0015] 步驟（3)中所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計，取滅菌的吐 溫-802-5份、檢驗合格的豬肺炎支原體菌液95-98份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即 得；優(yōu)選的，所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計，取滅菌的吐溫-804份、檢驗 合格的豬肺炎支原體菌液96份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
[0016] 步驟（3)中將油相和水相按照體積比油相：水相=1-3 :1混合；優(yōu)選的，將油相和 水相按照體積比1 :1的比例混合均勻。
[0017] 步驟⑷中所述的乳化是以4, 000r/min乳化30min。乳化后，取樣10ml，以 3,OOOr/min離心15min，不分層，即可將乳化好的疫苗定量分裝，密封。
[0018] 本發(fā)明方法制備得到的豬支原體肺炎滅活疫苗對非靶動物、靶動物安全，單劑量 重復接種及超大劑量接種安全，免疫后豬精神良好，采食正常，接種后的注射部位均未出現(xiàn) 紅腫現(xiàn)象；對仔豬免疫效果顯著，免疫組肺部病變計分與對照組差異顯著；免疫期持續(xù)6個 月仍有很強的免疫效果。
[0019] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明乳化佐劑中使用具有親水和疏水基的聚氧乙烯40氫化蓖麻油，增強了乳 化效果，減少了白油用量，簡化了生產(chǎn)工藝；通過減少白油的用量，使疫苗的粘稠度降低，減 少了注射的難度同時顯著減輕了動物的應激反應；動物實驗證明，本發(fā)明制備的豬支原體 肺炎滅活疫苗對非靶動物、靶動物安全，對仔豬免疫效果顯著，使抗體在較長的時間內(nèi)保持 在一個較高的水平，免疫期持續(xù)6個月仍有很強的免疫效果。

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 1、菌株
[0023] 豬肺炎支原體P-5722-3株購自美國輝動保公司，商品名稱為：MHPPstockp-3， NL1042, 4/14/88,由哈藥集團生物疫苗有限公司保存。
[0024] 實施例1豬支原體肺炎滅活疫苗的制備
[0025] 1、菌株特點
[0026]I. 1形態(tài)和生化特性
[0027] 豬肺炎支原體P-5722-3株，菌體形態(tài)為環(huán)狀、球狀、絲狀、桿狀或點狀多形態(tài)微生 物，無細胞壁，革蘭氏染色陰性。
[0028] L 2培養(yǎng)特性
[0029] 在Lps液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)5-10日，培養(yǎng)基pH值下降0. 5以下，呈現(xiàn)輕度 混濁；在固體培養(yǎng)基上，置37°C、含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)7?10日，低倍顯微鏡下可見 灰白色支原體菌落。大多數(shù)菌落邊緣整齊，有少數(shù)菌落邊緣不整齊，多數(shù)菌落中間沒有"臍" 狀特征。
[0030] 1. 3血清學特性
[0031] 用代謝抑制試驗鑒定，即將豬肺炎支原體菌液用Lps培養(yǎng)基稀釋至IO4?IO5CXU/ ml后，與含有20%的兔抗豬肺炎支原體陽性血清（瓊擴效價不低于1 :16)的Lps培養(yǎng)基等 量混合，同時設(shè)不加陽性血清的豬肺炎支原體培養(yǎng)物對照管，置37°C培養(yǎng)15日，觀察培養(yǎng) 基顏色變化。對照管PH值下降0.5以上，含陽性血清的試管培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化或pH 值下降低于〇. 5。豬肺炎支原體陽性血清能特異性地抑制豬肺炎支原體對培養(yǎng)基中葡萄糖 的代謝。
[0032] 1. 4安全性
[0033] 用30?50日齡健康易感豬3頭，經(jīng)胸腔接種10頭份/頭或經(jīng)鼻腔接種20頭份 /頭，觀察20日，不出現(xiàn)由注射引起的不良反應或死亡。
[0034] 1. 5免疫原性
[0035] 用30?50日齡健康易感豬5頭，用PBS(0.01mol/L，pH值7. 2)將菌液稀釋成 5X106(XU/ml，經(jīng)胸腔內(nèi)接種Iml/頭（或經(jīng)鼻腔內(nèi)接種2ml/頭），同時設(shè)對照豬5頭，免疫 45日后，連同對照豬用1 :50稀釋的濟南株豬肺組織強毒（購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏 中心，CVCC354)氣管內(nèi)注射5ml，觀察25日撲殺，檢查肺臟病變并按肺臟病變計分計算免疫 原性保護率。經(jīng)胸腔接種的免疫豬肺臟病變保護率大于70%，經(jīng)鼻腔接種免疫豬的肺臟病 變保護率大于60%。
[0036] 2、豬支原體肺炎滅活疫苗的制備
[0037] (1)采用發(fā)酵罐培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液。將豬肺炎支原體按發(fā)酵罐容積5% -20% 的量接種到PPLO肉湯培養(yǎng)基中，將溫度調(diào)節(jié)37°C、pH值控制在7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min， 通氣培養(yǎng)15-96小時，采用逐步擴大培養(yǎng)方式，一直到所需的量，收獲菌液。
[0038] (2)對收獲的菌液進行抗原濃度測定。取35支無菌試管，每一管裝I. 8mlPPLO肉 湯。在第一支試管里加入0. 2ml待測抗原（滅活前原菌液），充分混勻即-1，從中吸取0. 2ml加入第二支試管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到第11支試管即-11，其中從-4到-11每 個梯度加4支試管。在37°C培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色改變的情況，以顏色發(fā)生變化為依據(jù)，顏 色發(fā)生變化判定為抗原在培養(yǎng)基中具有代謝活力；顏色沒有發(fā)生變化，判定為抗原在培養(yǎng) 基中沒有代謝活力，計算CCU/ml。參照《中國獸藥典》附錄進行病毒半數(shù)致死量、感染量測 定法進行計算。要求，5XIO8變色單位<抗原水平/頭份< 2X101°變色單位。
[0039] (3)將合格的菌液進行滅活，在菌液培養(yǎng)的最后階段，培養(yǎng)物pH值達到7. 8,在該 值至少保持在1小時內(nèi)無大變化。此時加入過濾滅菌的二乙烯亞胺（BEI)，其中BEI用2-溴 乙胺氫溴酸鹽（BEA)與0· 2mol/L的NaOH溶液在37°C下水浴Ih(每隔15、20min搖勻一次） 配制成所需濃度的BEI滅活液，以0. 22μm濾膜濾器過濾除菌，2?8°C存放備用。加入后 使其濃度達到2mmol/L，在溫度37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時。然后加入硫代硫酸鹽滅菌水 溶液來中和過剩的BEI。在溫度37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時。滅活后，用硫代硫酸 鹽中和前，取樣本，用適合的培養(yǎng)基檢測其滅活程度。用適合的培養(yǎng)基進行批量樣品的無菌 測試。滅活培養(yǎng)物可被轉(zhuǎn)到滅菌的器皿中置2-7°C保存直至裝瓶。
[0040] (4)將滅活好的菌液進行無菌檢驗和滅活檢驗。無菌檢驗根據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》 附錄進行檢驗，全部無菌。滅活檢驗將經(jīng)過滅活將滅活的菌液用PPLO肉湯稀釋成含5%、 10%、20%，并設(shè)陰性對照，在371：下，8〇17/111，培養(yǎng)16-17日，觀察有無顏色變化，均無顏色 變化判定滅活徹底。
[0041] (5)制備疫苗，通過制備油相和水相，等比例乳化而成。按體積比計，油相按配方 要求分別量取聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份、司本-806份、白油93份，將白油加熱到KKTC 按照體積加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油，混勻；將油溫降到50°C以后加入司本-80攪拌均 勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得到所述疫苗的油相。水相制備：按體積比計，取滅菌的吐 溫-804份、檢驗合格的菌液96份，導入配苗罐中，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。按體積 比計，取油相1份置于乳化罐內(nèi)，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相1份，再以4,OOOr/ min乳化30min。乳化后，取樣10ml，以3, 000r/min離心15min，不分層。
[0042] (6)將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封，即得。
[0043] 實施例2豬支原體肺炎滅活疫苗的安全性試驗
[0044] 根據(jù)本發(fā)明實施例1的制備方法，試制3批豬支原體肺炎滅活疫苗，分別對試制的 3批豬支原體肺炎滅活疫苗進行非靶動物、單劑量、超劑量和單劑量重復注射劑量安全試 驗。
[0045] 1、豬支原體肺炎滅活疫苗對非祀動物的安全性試驗
[0046] 小白鼠的安全試驗，試制的3批疫苗分別皮下注射體重14?24g小白鼠8只，每 只0. 5ml，同時設(shè)立生理鹽水免疫對照組，觀察14日，觀察有無疫苗所致的不良反應。
[0047] 結(jié)果見表1，接種疫苗的小白鼠未出現(xiàn)任何不良反應，全部健活，證明本發(fā)明制備 的豬支原體肺炎滅活疫苗對非靶動物使用安全。
[0048] 表1疫苗注射非靶動物安全性試驗
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：按體積比計，由水相和油相按照1 :1-3的 比例組成；其中，所述水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5 :95-98的比例組成；所 述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2 :5-8 :90-94的比例組成。
2. 按照權(quán)利要求1所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：由水相和油相按照1 : 1的比例組成。
3. 按照權(quán)利要求1所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：所述水相由吐溫-80 和豬肺炎支原體菌液按照4 :96的比例組成；所述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80 和白油按照1 :6 :93的比例組成。
4. 一種制備權(quán)利要求1-3任何一項所述的豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1)培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液，收獲菌液；（2)加入滅活劑將豬肺炎支原體菌液滅活；(3) 制備油相和水相；將油相和水相混合，乳化；(4)將乳化好的疫苗定量分裝，密封，即得。
5. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中采用發(fā)酵罐培養(yǎng)豬肺炎 支原體菌液；所述的培養(yǎng)方式如下：按發(fā)酵罐容積5% -20%的容積量將豬肺炎支原體接種 到培養(yǎng)基中，在以下條件進行培養(yǎng)：溫度37°C、pH值7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，通氣培養(yǎng) 15-96小時，逐步擴大培養(yǎng)，收獲菌液。
6. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述滅活劑為二乙烯亞 胺，其終濃度達到2mmol/L ;加入滅活劑后在37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時；然后加入硫代 硫酸鹽滅菌水溶液中和過剩的二乙烯亞胺，在37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時。
7. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述油相的制備方法包 括以下步驟：按體積比計，將白油90-94份加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1-2 份，混勻，將油溫降到50°C以后加入司本-805-8份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即 得； 所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計，取滅菌的吐溫-802-5份、豬肺炎支 原體菌液95-98份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
8. 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述油相的制備方法包 括以下步驟：按體積比計，將白油93份加熱到KKTC，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份，混 勻，將油溫降到50°C以后加入司本-806份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；所述 水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計，取滅菌的吐溫-804份、檢驗合格的豬肺炎支 原體菌液96份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
9. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中水相和油相按照1 :1-3的 體積比混合；優(yōu)選的，將水相和油相按照1 :1的體積比混合；所述的乳化是以4, OOOr/min 乳化30min。
10. 權(quán)利要求4-9任何一項所述制備方法制備得到的豬支原體肺炎滅活疫苗。
【文檔編號】A61P31/04GK104399070SQ201410605042
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】梁宛楠, 丁國杰, 劉洪斌, 張智明, 王全杰, 毛春玲, 孫凱, 張祎, 李莉莉, 馮聞迪 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司