豬prrsv、豬肺炎支原體和pvc-2抗原在制備疫苗中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制備預防和治療豬肺炎支原體污染的豬或受到豬肺炎支原體威脅的豬的疫苗中的應用。該應用對于豬肺炎支原體污染的豬群或受到豬肺炎支原體威脅的豬群在不影響豬肺炎支原體免疫效果的前提下，能使PCV2和PRRSV的免疫時間提前，能同時控制豬肺炎支原體、PRRSV和PCV-2三種疾病。
【專利說明】豬PRRSV、豬肺炎支原體和PVC-2抗原在制備疫苗中的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及豬PRRSV、豬肺炎支原體和PVC-2抗原在制備疫苗中的應用。

【背景技術】
[0002]豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)引起的豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病。豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒中的一種。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性以及基因組差異又可將其分為無致病性(或PK15源性)的豬圓環(huán)病毒I型(PCV-1)和有致病性(PMWS源性)的豬圓環(huán)病毒II型(PCV-2)。我國自2000年報道豬群中存在PCV2感染的血清學證據(jù)以來，各地區(qū)陸續(xù)報道，流行范圍已波及全國，豬群平均陽性率38.47%,豬場陽性率58.75%以上，危害日趨嚴重。針對該問題，國內已有商品化的滅活疫苗，可為豬群提供較好的免疫保護，特別在仔豬增重、抑制病毒、減少病毒血癥方面具有顯著的優(yōu)勢。
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)對豬造成的危害是一個世界性難題。2006至2007年，我國二十多個省份發(fā)生了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。隨著豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)現(xiàn)，豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗研究也隨之開展。目前國內外已經商品化的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗有滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。
[0004]在經典株滅活疫苗方面，Bayer公司于1997年推出了滅活疫苗，隨后中國也研制出豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗并商品化。滅活疫苗的優(yōu)點是安全性好，但主要刺激豬體產生體液免疫反應，對清除感染巨噬細胞中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒無能為力，并且免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫力產生期較長，因而不適合仔豬免疫。在免疫效力上滅活疫苗免疫后攻毒不能完全保戶仔豬對繁殖與呼吸綜合征病毒的感染。
[0005]在經典株豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗方面，美國于1995年首次推出商品化減毒疫苗Res PRRS/R印roTM，可供各階段豬群使用，但主要供3~18周齡仔豬預防接種。隨后多個國家，包括中國研制出豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗并商品化。據(jù)報道，接種豬繁殖與呼吸綜合征經典株弱毒疫苗后110日用同源強毒攻擊，可得到100%保護(童光志和田志軍，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究進展，PRRS?？?，2005，2:32_33，46)。但有文獻報道PRRS弱毒疫苗接種PRRS血清學陰性的母豬后，疫苗中病毒可經胎盤感染胎兒，并向未接種的母豬傳播，有些豬群則表現(xiàn)出急性豬繁殖與呼吸綜合征癥狀。并且該疫苗接種公豬后，隨后以強毒攻擊，發(fā)現(xiàn)有精液排毒和精液質量下降等現(xiàn)象。在國內哈爾濱獸醫(yī)研究所通過對國內分離到經典株藍耳病毒株進行致弱獲得PRRSVCH-1R株，該毒株免疫原性好，刺激機體產生抗體速度快，效價高，保護時間長，用于經典株藍耳病病毒的預防。
[0006]在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗方面，國內專家通過對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征變異株(NVDC-JXA1)在Marcl45細胞上連續(xù)繼代進行馴化，獲得了具有良好免疫原性和安全性的弱毒株(NVDC-JXA1-R)，并作為預防高致病性藍耳病疫情政府招標用疫苗株，在控制高致病性藍耳病疫情中起到重要作用。隨后又有兩株高致病性藍耳病變異株(TJM-F92株和HuM-Fl 12株)活疫苗上市。
[0007]高致病性和低致病力豬繁殖障礙綜合癥弱毒疫苗株交叉保護情況存在著爭議，越來越多的數(shù)據(jù)表明，兩類毒株之間都不能提供100%的交叉保護。因此，為更好的控制高致病性和低致病力的豬繁殖與呼吸綜合征疾病，在受到兩種不同毒力病毒威脅時養(yǎng)殖場多采用二種疫苗同時免疫。
[0008]大量研究表明PRRSV和PCV2都可以導致免疫細胞的凋亡，造成機體免疫抑制，并且兩種病毒多同時存在，從而更容易繼發(fā)其它病原體的感染，導致更為嚴重的傳染病。但現(xiàn)有技術中不存在同時預防兩種疾病的疫苗。
[0009]豬肺炎支原體(MH)作為豬呼吸道疾病綜合征的重要原發(fā)病原，可誘發(fā)豬支原體肺炎(又稱為豬氣喘病、豬地方流行性肺炎)，一年四季均可發(fā)生。尤以寒冷、潮濕氣候劇變時多發(fā)。病原體感染后可破壞呼吸道纖毛，引發(fā)肺炎，使感染、發(fā)病豬生產性能下降，治療費用上升，還可導致豬體的體液免疫和細胞免疫功能降低。
[0010]豬肺炎支原體與豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)在實驗條件下共感染，豬肺炎支原體可以促進藍耳病的發(fā)生。肺炎支原體感染后，一方面可以破壞呼吸道的局部清除病原體的能力，使得病毒性病原體嚴重繼發(fā)感染；另一方面，肺炎支原體可以調制肺臟局部的免疫應答，使肺泡巨噬細胞的功能發(fā)生改變，從而促進了 PRRSV的感染，延長了 PRRSV感染的時間。而且PRRSV和肺炎支原體在臨床感染上存在協(xié)同效應，增強彼此的致病力，而且加重了 PRRSV造成的損失。而且支原體是PRDC的主要誘發(fā)者，即使支原體引起的疾病較輕微，即豬群發(fā)生低水平支原體感染，也能使藍耳病很快表現(xiàn)出臨床癥狀。
[0011]最新研究表明，肺炎支原體可以促進PCV-2的感染。PCV-2/肺炎支原體的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原體單獨感染只能引起輕微的一過性呼吸道疾病和病變，但如果二者混合感染，豬肺炎支原體感染可加劇PCV-2所致肺部和淋巴病變的嚴重程度、增加PCV-2抗原的量、延長PCV-2抗原的存在時間，從而提高豬斷奶后多系統(tǒng)消耗性綜合征的發(fā)病率。
[0012]由于豬支原體肺炎、PRRSV和PCV-2這三種病毒在養(yǎng)殖場中廣泛存在，并且經常出現(xiàn)豬肺炎支原體和PRRSV、豬肺炎支原體和PCV-2、PRRSV和PCV-2、甚至出現(xiàn)豬肺炎支原體和PRRSV和PCV-2三種致病因子混合感染現(xiàn)象。國內外許多資料證實支原體感染更易誘發(fā)PRRSV和PCV-2的繼發(fā)感染，從而產生更為嚴重的呼吸障礙綜合癥。因此，有必要采取有效措施控制這3種疾病。目前尚沒有PCV-2和PRRSV弱毒疫苗聯(lián)合配苗和PCV-2、豬肺炎支原體和PRRSV弱毒株三聯(lián)苗應用的報道。
[0013]有學者(Van Thacker, 1999)表明如果在接種肺炎支原體疫苗的同時感染了 PRRS病毒或者接種了 PRRS弱毒活疫苗，均會降低豬肺炎支原體疫苗的功效。因此如何在預防PRRSV和PCV-2的同時提高豬支原體肺炎的免疫效果為本【技術領域】的有待解決的問題。
[0014]專利申請CN101420975A公開了一種抗支原體和PRRSV疫苗，該專利申請基于“豬感染或接種了 PRRSV病毒，豬肺炎支原體疫苗的功效將會顯著降低”的理由而設計的技術路線為:首先用豬肺炎支原體給小豬首次接種，接著用豬肺炎支原體和活的減毒PRRSV進行第二次接種，它們會迅速產生對PRRSV病毒感染和豬肺炎支原體感染的良好保護作用。
[0015]即如果以聯(lián)合的方式給已知首次接觸豬肺炎支原體疫苗的小豬施用致免疫劑量的豬肺炎支原體的免疫原性物質和致免疫劑量的活的減毒PRRSV病毒，就能避開所謂“已知的問題”。
[0016]該申請的第一個實施方案涉及致免疫劑量的豬肺炎支原體的免疫原性物質和致免疫劑量的活的減毒PRRSV在制備用于給已接觸豬肺炎支原體的豬聯(lián)合施用豬肺炎支原體疫苗和PRRSV疫苗的疫苗中的應用。
[0017]該申請通過豬肺炎支原體單苗和含豬支原體肺炎組份的聯(lián)苗兩次免疫仔豬，盡管避免了所謂的“PRRSV減毒株疫苗對豬肺炎支原體免疫效果的影響，但卻推遲了 PRRSV疫苗的免疫時間7~35日，這樣勢必延長了仔豬免疫PRRSV疫苗的時間，降低豬群耐受PRRSV的能力。


【發(fā)明內容】

[0018]為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種有豬肺炎支原體污染的豬群或受到豬肺炎支原體威脅的豬群在不影響豬肺炎支原體免疫效果的前提下，使PCV2和PRRSV的免疫時間提前，以控制豬肺炎支原體、PRRSV和PCV-2三種疾病的方法。
[0019]本發(fā)明的主要目的在于提供一種致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制備預防和治療豬肺炎支原體污染的豬或受到豬肺炎支原體威脅的豬的疫苗中的應用。
[0020]優(yōu)選地，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免所述豬，用致免疫量的所述豬肺炎支原體和致免疫量的所述PCV-2抗原二次免疫所述豬。
[0021]更優(yōu)選地,所豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體,所述PRRSV抗原為PRRSV減毒株，所述PCV-2抗原為滅活的PCV-2病毒。
[0022]更優(yōu)選地,所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株,所述PRRSV抗原為PRRSV NVDC-JXA1-R減毒株，所述PCV-2抗原為滅活的PCV-2病毒SH株。
[0023]PCV2SH 株，保藏號為 CGMCC N0.2389，公開于專利文獻 CN101240264A。
[0024]豬肺炎支原體菌株HN0613株，保藏編號為CCTCC M2012230，保藏單位為位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏日期:2012年6月13日。
[0025]PRRSV NVDC-JXA1-R株，保藏號為CGMCC N0.2467，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2008年4月29日，在CN101307305A中公開。
[0026]更優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原為2X 18CCU~5X 18CCU,優(yōu)選3X 18CCU~5 X 18CCU ;所述 PRRSV 抗原為≤ I X 15TCID5tl，優(yōu)選≤ I X 16TCID50 ；，所述 PCV-2 抗原為≤ I X 14TCID5。，優(yōu)選≤ IX15TCID50o
[0027]更優(yōu)選地，所述首免和二次免疫間隔7~35日，優(yōu)選14~28日，更優(yōu)選21~28曰。
[0028]更優(yōu)選地，所述PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免I~7齡仔豬，優(yōu)選5~7日齡仔豬。
[0029]疫苗組合物中豬肺炎支原體抗原是指滅活后支原體菌體或其有效成分，滅活前含量每頭份含量在2 X 18CCU~5 X 18CCU,優(yōu)選3 X 18CCU~5 X 18CCU ;組合物中PRRSV抗原可以為致弱的PRRSV病毒液，還可以為或含有其保護性抗原GP5蛋白和M蛋白一種成份或多種成份，其中為PRRSV病毒液時每頭份含量> IX 15TCID5tl，優(yōu)選每頭份病毒液含量≥I X 16TCID50 ;組合物中PCV-2抗原是指滅活后的PCV-2全病毒液，或含有PCV-2有效保護抗原VP2等成份，其中為PCV-2抗原時每頭份含量> I X 14TCID5tl，優(yōu)選病毒液含量≥ 1X105TCID5。。
[0030]本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗試劑盒，其中，所述試劑盒包括含所述PCV-2抗原、所述豬肺炎支原體抗原和佐劑的組份I，以及含所述PRRSV抗原的組份II。
[0031]在疫苗組合物組成成分上將滅活的PCV-2抗原、豬肺炎支原體抗原混合后加入水性佐劑作為組份I，組份II為含PRRSV弱毒株抗原凍干保存。使用時組份I和和組分II可單組使用，組分I免疫仔豬可預防和控制PCV-2和豬肺炎支原體感染，組份II加入稀釋液單獨使用免疫仔豬用于預防PRRSV感染；組份I和組份II也可聯(lián)合使用，用組份I中的二聯(lián)苗作為稀釋液來稀釋組份II配制成三種抗原成份的聯(lián)苗，用于同時預防和控制豬肺炎支原體、PCV2和PRRSV這三種疾病的感染。

【具體實施方式】
[0032]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0033]本發(fā)明實施例中分別以豬圓環(huán)病毒2型SH株、PRRSVNVDC-JXA1-R株、豬肺炎支原體HN0613株為例說明本發(fā)明。
[0034]實施例1、豬圓環(huán)病毒2型、PRRSV、豬肺炎支原體組合疫苗的制備
[0035]1.抗原制備
[0036]1.1豬圓環(huán)病毒2型抗原的制備
[0037](I)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):取PK15細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液(含0.25胰酶(I: 250)、0.02% EDTA的Hank' s液消化傳代，以含90 % MEM液、10 %牛血清、各100單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH調整為7.2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好細胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養(yǎng)，其中生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應器。
[0038](2)細胞毒種的繁殖:用病毒培養(yǎng)液，將PCV-2接種到步驟(1)制備的生長良好單層細胞繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為0.2M0I，培養(yǎng)溫度為37°C，至細胞80%以上病變時收獲病毒。
[0039](3)PK15細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養(yǎng):取步驟(1)制備生長良好的ΡΚ15細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后接種于生物反應器中，在生物反應器中加有預處理好的微載體，設定培養(yǎng)溫度37°C，pH7.2，溶氧50，攪拌速度60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，其中生物反應器容積為50L; " B1NOC II"載體，在載體罐中的加入量為50~70g/L，微載體在使用前，需清洗、滅菌，具體步驟為:1)稱量B1NOCII球形微載體250g、使用1L PBS液浸泡三小時；2)用1L PBS液清洗3遍；3)加入1LPBS液浸泡微載體，121 °C蒸汽滅菌30min。
[0040](4)制苗毒液的繁殖:培養(yǎng)后第三日觀察微載體上細胞基本長滿，且細胞計數(shù)結果為約IXlOfVml后進行接毒操作，接種量為0.2M0I，設定培養(yǎng)溫度37°C，pH7.4，溶氧50ppm,攪拌速度60rpm,進行反應器自動控制培養(yǎng),接毒后每隔一定時間取細胞微載體觀察細胞病變情況，同時取反應器中病毒液，用間接免疫熒光法(IFA)測定PCV-2病毒含量。待細胞病變達50%~80%病變時(IFA病毒含量達到最高)停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，收獲上清液。
[0041](5)病毒液的收獲:培養(yǎng)的上清液經過濾、橫向切留超濾處理去除細胞碎片及部分雜蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02%滅活劑BEI滅活37°C滅活72h，然后37°C加入10% V/V(0.1M)硫代硫酸鈉終止BEI活性，然后將滅活后的病毒液于_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0042](6)PCV-2抗原滅活檢驗:滅活后，無菌從每瓶病毒滅活液中取樣，接種96孔板，同步介入PK15細胞，培養(yǎng)120h后，做間接免疫熒光，細胞無免疫熒光。
[0043]1.2豬PRRSV抗原的制備
[0044](I)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):取Marcl45細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液(含
0.25胰酶(I: 250)、0.02% EDTA的HanV s液消化傳代，以含90% MEM液、10%牛血清、各100單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH調整為7.2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好細胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養(yǎng)，其中生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應器。
[0045](2)細胞毒種的繁殖:用病毒培養(yǎng)液，將PRRSV接種到步驟(1)制備的生長良好單層細胞繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為0.2M0I，培養(yǎng)溫度為37°C，至細胞80%以上病變時收獲病毒。
[0046](3)Marcl45細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養(yǎng):取步驟⑴制備生長良好的Marcl45細胞，經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后接種于生物反應器中，在生物反應器中加有預處理好的微載體，設定培養(yǎng)溫度37°C，pH7.2，溶氧50、攪拌速度60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，其中生物反應器容積為50L ; " B1NOC II"載體，在載體罐中的加入量為50~70g/L，微載體在使用前，需清洗、滅菌，具體步驟為:1)稱量B1NOC II球形微載體250g、使用1L PBS液浸泡三小時；2)用1L PBS液清洗3遍；3)加入1L PBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30min。
[0047](4)制苗用PRRSV病毒液的繁殖:觀察微載體上細胞基本長滿，細胞計數(shù)結果達到IXlOVml~IXlOVml后進行接毒操作，所接入種毒為步驟(2)中之種毒，設定培養(yǎng)溫度37°C, H7.2~7.6，溶氧30~60、攪拌速度30~60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時間取細胞微載體觀察細胞病變情況待細胞病變達80%以上病變時，停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，收獲上清液。
[0048](5)病毒液的收獲:培養(yǎng)的上清液經過濾、橫向切留超濾處理去除細胞碎片及部分雜蛋白，即制得病毒液。然后將病毒液于-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0049]1.3豬肺炎支原體培養(yǎng)基及支原體抗原制備
[0050]采用KM2液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，配方如下:乳清蛋白水解物，10.0g ;鮮酵母浸出物，20.0ml ；Eagles氏液，1000.0ml ;Dulbecco磷酸鹽緩沖液,600.0ml ;健康豬血清,400.0ml ;酚紅(0.4% )，3.5ml ;醋酸鉈(1% )，25.0ml ;青霉素，400000.0IU。pH 為 7.4 ~7.6。
[0051]將凍干菌種豬肺炎支原體HN0603株接種于KM2固體培養(yǎng)基，5% CO2環(huán)境培養(yǎng)72小時后，選取3個典型菌落轉接入KM2液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后純粹檢驗合格作為種子液，按發(fā)酵罐容積的70%加入生產用的KM2培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基量的0.02%加入消泡劑(Antifoam204, Sigma)，當培養(yǎng)基溫度升至37°C時，將種子液按10%加入到發(fā)酵罐內。攪拌轉速300r/min, ρΗ7.2，罐壓0.02~0.04Mpa之間、溶氧量40%，培養(yǎng)時間48小時，當濃度達到約IX 109(XU/ml時，經檢驗純粹后，加入然后加入0.02%滅活劑BEI滅活37°C滅活72h，然后37°C加入10% V/V(0.1M)硫代硫酸鈉終止BEI活性，4°C保存?zhèn)溆?，即為豬肺炎支原體抗原。
[0052]1.4半成品檢驗
[0053]無菌檢驗:按《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》附錄301頁對豬PCV-2和PRRSV和豬肺炎支原體抗原液進行檢驗，均無菌生長。
[0054]2疫苗組合物的配制
[0055]2.1組份I的制備:將滅活的PCV-2病毒液和豬肺炎支原體培養(yǎng)液混合均勻后，抗原液按1: 2比例，并加入1份水性佐劑，混勻后作為組份I，分裝、加塞、壓蓋，2~8°C保存。
[0056]2.2組份II的制備:將PRRSV弱毒抗原加入凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到組份II。
[0057]3疫苗組合物預防控制豬肺炎支原體、PCV-2和PRRSV這三種疾病方法:用組份I作為稀釋液稀釋組份II首免，28日后用組份I 二免。
[0058]實施例2、PCV-2、PRRSV、豬肺炎支原體組合疫苗應用
[0059]用本發(fā)明實施例1自制的組份I和組份II聯(lián)合使用，用組份I作為稀釋液稀釋組份II組成聯(lián)苗預防豬肺炎支原體、PCV-2和PRRSV這三種疾病。免疫程序如下:首先7日齡仔豬用組份I稀釋組份II組成聯(lián)苗首免，21日后用組份I 二免。在免疫的同時，對照組用相應的單苗進行免疫，以評價三種抗原成份聯(lián)合應用和相應單一抗原單獨使用在免疫效果上的差異。
[0060]1.材料
[0061]PCV-2和豬肺炎支原體二聯(lián)苗，即組份I，按實施例1制備檢驗。
[0062]PRRSV弱毒疫苗，即組份II，按按實施例1制備檢驗。
[0063]PCV-2單組份疫苗，按實施例1制備，其中每頭份病毒液含量> IX 15TCID5tl。
[0064]豬肺炎支原體單組份疫苗，按實施例1制備，其中每頭份病毒液含量> 3X 108CCU。
[0065]2.試驗方法
[0066]2.1組份I和組份II聯(lián)合應用與PCV-2單組份疫苗免疫效果比較
[0067]用I周齡PCV-2抗原、抗體檢測雙陰性仔豬20頭，分成4組，每組5頭。7日齡第2組頸部肌肉注射PCV-2單組份疫苗I頭份，2周后(21日齡)用PCV-2單組份疫苗二免I頭份；第I組用組份I稀釋組份II配制成三聯(lián)苗免疫I頭份，2周后(21日齡)用組份I 二聯(lián)苗進行二免。第3、4組不免疫。二免2周后(35日齡)第1、2、3組注射PCV2SH株2ml攻毒(含106 °TCID5Q/ml)，觀察21日；第四組作為空白對照。分別于攻毒后的7d，14d，21d稱量各組豬的體重作記錄。于攻毒后第21日撲殺，剖檢，根據(jù)病理學變化和免疫組化判定結果。
[0068]2.2組份I和組份II聯(lián)合應用與PRRSV單組份疫苗免疫效果比較
[0069] 用I周齡的PRRSV抗原、抗體檢測雙陰性仔豬15頭，分為3組，每組5只。7日齡第2組用PRRSV單組份疫苗(即組份II) I頭份；第I組用組份I稀釋組份II配制成三聯(lián)苗免疫I頭份。第3、4組不免疫。免疫3周后(28日齡)第1、2、3組每頭注射PRRSV NVDC-JXAI強毒株3ml (含105_°TCID5(l/ml)，攻毒后觀察21d。攻毒后仔豬死亡判為發(fā)病，根據(jù)發(fā)病情況判定免疫組攻毒保護效果。
[0070]2.3組份I和組份II聯(lián)合應用與豬肺炎支原體免疫效果比較
[0071]用I周齡豬肺炎支原體抗原、抗體檢測雙陰性仔豬15頭，分成3組，每組5頭。7日齡第2組頸部肌肉注射豬肺炎支原體單組份疫苗I頭份，2周后(21日齡)用豬肺炎支原體疫苗二免I頭份;第I組用組份I稀釋組份II配制成三聯(lián)苗免疫I頭份，2周后(21日齡)用組份I 二聯(lián)苗進行二免。第3組不免疫。在首次免疫后70d，第1、2、3組用豬肺炎支原體進行攻毒(CVCC354株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，該菌株為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏的豬支原體肺炎疫苗效力檢驗用毒株)，氣管注射5ml/頭(100MID)，攻毒后觀察30天，剖殺試驗豬。根據(jù)豬支原體肺炎肺病變指數(shù)記分標準對試驗豬的肺病變進行記分。免疫組與對照組進行肺病變指數(shù)差異分析。各試驗組仔豬均在攻毒前稱重，觀察結束時稱重，計算攻毒后至觀察結束時的平均日增重。
[0072]3結果與討論
[0073]3.1組份I和組份II聯(lián)合免疫與PCV-2單組份疫苗免疫效果比較結果
[0074]免疫效果研究結果如表1，組份I和組份II聯(lián)合應用時對豬圓環(huán)病毒2型SH株的攻毒保護為5/5(100% )，單苗對豬圓環(huán)病毒2型SH株的攻毒保護為5/5(100% )，均呈現(xiàn)良好的免疫效果，表明PCV-2與PRRSV活苗和豬肺炎支原體聯(lián)合免疫與PCV-2單苗的免疫效果基本相當。在增重方面，多組分疫苗在平均體重增長率比PCV-2 (SH株)單組分疫苗的體重增長率高，這是一個令人意外的結果。
[0075]表1組份I和組份II聯(lián)合應用與豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗單苗(SH株)
[0076]的免疫效果比較
[0077]

【權利要求】
1.致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制備預防和治療豬肺炎支原體污染的豬或受到豬肺炎支原體威脅的豬的疫苗中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的豬肺炎支原體抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免所述豬，用致免疫量的所述豬肺炎支原體和致免疫量的所述PCV-2抗原二次免疫所述豬。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體，所述PRRSV抗原為PRRSV減毒株，所述PCV-2抗原為滅活的PCV-2病毒。
4.根據(jù)權利要求2所述的應用 ，其中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株，所述PRRSV抗原為PRRSVNVDC-JXA1-R減毒株，所述PCV-2抗原為滅活的PCV-2病毒SH株。
5.根據(jù)權利要求2所述的應用，其中，所述豬肺炎支原體抗原為2X18CCU~5 X 18CCU,優(yōu)選 3 X 18CCU ~5 X 18CCU ；所述 PRRSV 抗原為≥ IX15TCID50,優(yōu)選≥ I X 16TCID50 ；，所述 PCV-2 抗原為≥ I X 14TCID5。，優(yōu)選≥ IX15TCID50o
6.根據(jù)權利要求2所述的應用，其中，所述首免和二次免疫間隔7~35日，優(yōu)選14~28日，更優(yōu)選21~28日。
7.根據(jù)權利要求2所述的應用，其中，所述首免I~7日齡仔豬，優(yōu)選5~7日仔豬。
8.一種疫苗試劑盒，其中，所述試劑盒包括含所述PCV-2抗原、所述豬肺炎支原體抗原和佐劑的組份I，以及含所述PRRSV抗原的組份II。
【文檔編號】A61K39/295GK104043118SQ201310076735
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權日:2013年3月11日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司