一種全人源her2抗體、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種全人源HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。全人源HER2抗體可降低輸液反應(yīng)和免疫原性，提高藥物安全性，具有更好的藥物動力學(xué)特征。
【專利說明】一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] HER2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,人表皮生長因子受體 2)，又稱erbB-2,是生長因子受體家族成員之一。該受體蛋白通常只在胎兒時(shí)期表達(dá)，成年 以后只在極少數(shù)正常組織內(nèi)低水平表達(dá)，然而在多種人類腫瘤組織中（如乳腺癌、胃癌、卵 巢癌、肺癌、原發(fā)性腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等）卻過度表達(dá)，并提示預(yù)后不良。HER2/neu的過 度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖和新生血管的形成，造成腫瘤高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率和高死 亡率。研宄表明，HER2/neu的過度表達(dá)會出現(xiàn)在約30%的乳腺癌和16%的胃癌患者中，是 乳腺癌患者預(yù)后差的指征，同時(shí)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲性/轉(zhuǎn)移性上也發(fā)揮著重要作 用。
[0003] 針對HER2/neu靶點(diǎn)的單克隆抗體藥物治療是繼手術(shù)和放、化療后較為有效的治 療手段。赫賽?。℉erceptin)是美國Genentech公司（現(xiàn)屬Roche公司）研制，于1998年 上市的以HER2/neu為靶點(diǎn)的拮抗性人源化單克隆抗體藥物，被批準(zhǔn)用于HER2/neu高表達(dá) 的乳腺癌和胃癌的治療。該抗體抑制了 HER2/neu的信息傳遞活性，從而阻斷了下游信號傳 導(dǎo)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖停滯和新生血管形成的抑制。赫賽汀作為一線用藥在乳腺癌術(shù)后與化 療合用已在臨床中被證實(shí)可使病人生存期延長，并使復(fù)發(fā)率下降50%。
[0004] 赫賽汀的分子藥理機(jī)制通常被認(rèn)為是通過抑制HER2磷酸化、阻斷細(xì)胞增殖周期、 加速受體內(nèi)化及抗體Fc段誘導(dǎo)的效應(yīng)器作用（如抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，ADCC)的共同 結(jié)果。
[0005] 盡管相當(dāng)多的HER2陽性乳腺癌病人在赫賽汀治療的起始階段對抗體藥物有良好 的反應(yīng)，但最終疾病還會進(jìn)展和惡化，有約70 %病例對赫賽汀治療無效和產(chǎn)生耐藥狀況。因 此，尋求更為有效的抗HER2/neu抗體是目前臨床迫切需要解決的問題。
[0006] 赫賽汀的耐藥機(jī)制目前尚不完全清楚，有HER2受體以下信號傳遞通路異常，如持 續(xù)激活的PI3K途徑、磷酸化PTEN失去作用等。針對HER2分子上不同的表位產(chǎn)生的可抑制 HER2和HER3形成異源性二聚體的單克隆抗體帕妥珠單抗（Pertuzumab)與赫賽汀聯(lián)合應(yīng) 用，在最近的臨床實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)與單用赫賽汀相比其對病人生存期的延長有更加明顯的作 用，說明抗體通過赫賽汀表位以外的結(jié)合位點(diǎn)可以產(chǎn)生不同于赫賽汀的拮抗機(jī)制，從而與 赫賽汀產(chǎn)生相加或協(xié)同效應(yīng)。T-DMl是免疫抗體結(jié)合物（antibody-drug conjugate，ADC)， 是將高效價(jià)細(xì)胞毒素 DMl與單克隆抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab，即赫賽汀）通過共價(jià)鍵 結(jié)合，利用抗體結(jié)合HER2后的受體內(nèi)吞作用，將毒素帶入HER2陽性的腫瘤細(xì)胞，從而起到 對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在之前接受過赫賽汀和化療的HER2陽性晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌病 人中，與標(biāo)準(zhǔn)治療聯(lián)合使用，T-DMl可顯著延長無進(jìn)展生存期。該臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，利用 HER2抗體對HER2陽性腫瘤細(xì)胞的特異免疫反應(yīng)性，攜載細(xì)胞毒素進(jìn)入癌細(xì)胞，可能是克服 赫賽汀藥效不足的有效途徑。臨床前實(shí)驗(yàn)還顯示，利用細(xì)胞工程方法制備的去巖藻糖的曲 妥珠單抗，通過加強(qiáng)與效應(yīng)器細(xì)胞上Fe受體的結(jié)合，獲得了更強(qiáng)的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作 用，在相關(guān)動物模型中展示了比赫賽汀更強(qiáng)的抑制腫瘤的效果。該項(xiàng)研宄結(jié)果提示，加強(qiáng)抗 體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，也可能是優(yōu)化抗HER2抗體的可能途徑之一。
[0007] 赫賽汀是人源化的抗體藥產(chǎn)品，受到技術(shù)發(fā)展的制約?；颊呓邮芸贵w治療后產(chǎn)生 的抗藥抗體，可能是抗體耐藥的機(jī)制之一。人源化抗體臨床常見的副作用是輸液反應(yīng)。高 容量全人源抗體單鏈可變區(qū)片段（scFv)噬菌體展示文庫，是近十幾年來被國際各大生物 制藥公司利用來篩選全人源抗體的平臺之一。過去十幾年來，有利用該文庫篩選得到高親 和力全人源抗體的先例（如Abbott公司的阿達(dá)木單抗（Humira))及豐富經(jīng)驗(yàn)。全人源抗 體可降低輸液反應(yīng)和免疫原性，提高藥物安全性，具有更好的藥代動力學(xué)特征。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種全人源的HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0009] 本發(fā)明的全人源HER2抗體，其是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv的形式。所述 Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv具有本領(lǐng)域所慣常理解的含義。
[0010] 本發(fā)明的全人源HER2抗體，還可以包括人IgG的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。在一 個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述人IgG為IgGl。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述人IgG重鏈恒定 區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述人IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:6。
[0011] 本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明全人源HER2抗體的核苷酸序列。
[0012] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼所述重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:3,編 碼所述輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:4。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的全 人源HER2抗體為全長抗體時(shí)，在本發(fā)明的核苷酸序列中，編碼所述重鏈恒定區(qū)的核苷酸序 列為SEQ ID N0:7,編碼所述輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:8。
[0013] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其中本發(fā)明的核苷酸序列與表達(dá)載體的表達(dá)控制序 列可操作地連接。在具體的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是pGEM-Τ載體或293載體。
[0014] 本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體。所述細(xì)胞可以是原核或真核 的。在具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以哺乳動物細(xì)胞，例如FreeStyle 293F細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體和可藥用載體。
[0016] 此外發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的全人源HER2抗體與赫賽汀的作用機(jī)制不同，因此本 發(fā)明的全人源HER2抗體可用于對赫賽汀耐藥或?qū)召愅o反應(yīng)的患者。
[0017] 本發(fā)明提供了一種聯(lián)合藥物，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體和赫賽汀。
[0018] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體。所述試劑盒可用于 檢測樣品中的HER2蛋白。所述試劑盒還可包含本領(lǐng)域檢測HER2試劑盒中的其他常用組分。
[0019] 本發(fā)明提供了本發(fā)明的全人源HER2抗體用于制備用于治療受試者中的HER2陽性 腫瘤的藥物的用途。
[0020] 所述"HER2陽性腫瘤"是指如果IHC〔免疫組化法〕檢查結(jié)果為3個(gè)加號（+++)， 即，大于30%的腫瘤細(xì)胞的胞膜呈現(xiàn)完整的強(qiáng)著色，就表明為HER2陽性；如果是2個(gè)加號 (++)，即，至少10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中度完整的胞膜染色，那么進(jìn)一步做FISH〔熒光原 位雜交法〕或CISH〔顯色原位雜交法〕檢查，倘若結(jié)果為陽性〔發(fā)生基因擴(kuò)增〕，就可以確診 為HER2陽性。優(yōu)選地，HER2陽性腫瘤檢測結(jié)果是使用我國食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)證的 檢測試劑盒（IHC，F(xiàn)ISH和CISH檢測試劑盒）獲得的結(jié)果。執(zhí)業(yè)醫(yī)師熟知如何判定腫瘤是 否為HER2陽性腫瘤。
[0021] 所述HER2陽性的腫瘤可以選自HER2陽性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、 骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)癌、 結(jié)腸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸 癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、 膀胱癌、腎或尿道癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽囊癌、慢性或急性白血病、淋 巴細(xì)胞淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)癌、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (glioblastoma multiforme)、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、 鱗狀細(xì)胞瘤和垂體腺瘤。
[0022] 優(yōu)選地，所述受試者是人。
[0023] 優(yōu)選地，所述受試者是對赫賽汀耐藥或?qū)召愅o反應(yīng)的人。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖IA顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049重鏈表達(dá)載體（293-VH-CH)的結(jié) 構(gòu)示意圖；圖IB顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049輕鏈表達(dá)載體（293-VL-CL)的 結(jié)構(gòu)示意圖。以PCR方法，利用相應(yīng)模板和引物（詳見實(shí)施例5)分別獲得含5'端EcoRI 酶切位點(diǎn)的信號肽、重鏈可變區(qū)（VH)、含TGA終止密碼子和3'端BamH I酶切位點(diǎn)的重鏈恒 定區(qū)（CH)基因片段，并以over-lapping PCR方法將三段聯(lián)接，獲得GB235-049抗體的重鏈 全長基因片段。以相同方法獲得GB235-049抗體含信號肽、輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū) (CL)的輕鏈全長基因片段。利用EcoRI和BamH I酶切形成的粘性末端分別將重鏈和輕鏈 全長基因片段克隆至PGEM-T載體。
[0025] 圖2顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。將純化 得到的68235-049抗體和赫賽汀對照樣品在50禮二硫蘇糖醇還原條件下經(jīng)10%聚丙烯酰 氨凝膠電泳解析，結(jié)果顯示GB235-049抗體和赫賽汀均呈現(xiàn)分子量為50KDa和25KDa的兩 條帶，分別為抗體的重鏈和輕鏈。
[0026] 圖3顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與人HER2抗原的結(jié)合結(jié)果圖。以 重組人HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗 原分子結(jié)合，并以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體測定結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示與赫賽汀一樣， GB235-049抗體可結(jié)合于人HER2,并呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性。
[0027] 圖4A顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與猴HER2抗原的結(jié)合結(jié)果圖。以 猴HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗原分 子結(jié)合，并以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體測定結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示GB235-049與赫賽 汀一樣，GB235-049抗體可結(jié)合于猴HER2,并呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性。
[0028] 圖4B顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與小鼠 HER2抗原的結(jié)合結(jié)果圖。 在用ELISA測定GB235-049抗體與猴HER2免疫反應(yīng)性的同時(shí)，以重組小鼠 HER2抗原被 ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗原分子結(jié)合，并以HRP 標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體測定結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示GB235-049抗體、赫賽汀與小鼠 HER2 均無交叉反應(yīng)。
[0029] 圖5顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與人HER家族其它成員人HER1、 HER3、HER4抗原的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。以重組人HERl、HER2、HER3和HER4抗原分別包被ELISA 板，以GB235-049抗體和赫賽?。ň鶠?0 μ g/mL)與包被于板上的抗原分子結(jié)合，并以HRP 標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體測定結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示與赫賽汀一樣，GB235-049抗體可結(jié) 合于人的HER2,并且與其他HER家族成員分子沒有免疫反應(yīng)性。
[0030] 圖6顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與赫賽汀表位競爭的結(jié)果圖。用 ELISA方法，以重組人HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀分別 與生物素標(biāo)記的赫賽?。?. 005 μ g/mL固定濃度）共同室溫孵育2小時(shí)后和HER2包被的板 結(jié)合，并用HRP標(biāo)記的抗生物素抗體檢測結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示，隨赫賽汀濃度增加，生物 素標(biāo)記的赫賽汀在HER2抗原上的結(jié)合受到抑制；而GB235-049抗體即使是在實(shí)驗(yàn)涉及的最 高濃度（10 μ g/mL)時(shí)，仍對生物素標(biāo)記的赫賽汀在HER2上的結(jié)合無抑制作用。
[0031] 圖7顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與BT-474細(xì)胞的結(jié)合曲線結(jié)果圖。 將表達(dá)中等水平的HER2和表達(dá)高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌細(xì)胞在96-孔U型板中 分別與不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀孵育，在充分洗滌后，以HRP標(biāo)記的羊抗人Fc 抗體檢測結(jié)合抗體。結(jié)果顯示，GB235-049抗體和赫賽汀一樣可結(jié)合于表達(dá)HER2的細(xì)胞表 面，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性，提示GB235-049抗體對HER2有高度選擇性。
[0032] 圖8顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外抑制BT-474細(xì)胞增殖活性的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將表達(dá)中等水平的HER2和表達(dá)高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌細(xì)胞在96-孔 平底型板中分別與2和10 μ g/mL的GB235-049抗體和赫賽汀孵育72小時(shí)后用Alamar Blue 測定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，兩個(gè)抗體在兩種濃度下均能明顯抑制BT-474細(xì)胞增殖。
[0033] 圖9顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外抑制BT-474細(xì)胞增殖活性可 被可溶性人HER2抗原翻轉(zhuǎn)。將HER2高表達(dá)的BT-474乳腺癌細(xì)胞在96-孔平底板中分別 與不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀孵育72小時(shí)，或在各抗體濃度條件下加入100 μ g/ mL的重組人HER2抗原，并孵育72小時(shí)，用Alamar Blue測定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，與空白 對照相比，兩個(gè)抗體在兩種濃度下均能明顯抑制BT-474細(xì)胞增殖。在存在可溶性HER2抗 原的條件下，高濃度赫賽汀抗體對細(xì)胞增殖的抑制作用部分被翻轉(zhuǎn)，低濃度赫賽汀抗體對 細(xì)胞增殖的作用完全被翻轉(zhuǎn)，而GB235-049抗體無論是在高濃度還是低濃度條件下均被翻 轉(zhuǎn)，提示抗體對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是HER2特異性的。
[0034] 圖10A、圖10B、圖IOC分別顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外作用 BT-474細(xì)胞2小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)后的P-HER2、P-Akt、P-ERK1/2蛋白表達(dá)結(jié)果圖。將 表達(dá)中等水平的HER2和表達(dá)高水平的P-HER2的BT-474在含10%胎牛血清培養(yǎng)基中與2 和20 μ g/mL赫賽汀和GB235-049抗體孵育，并分別于2、24和72小時(shí)取樣。以細(xì)胞裂解 液做免疫印跡，以相應(yīng)抗體分別探測全部和磷酸化的HER2、ERK1/2和Akt。圖IOA的結(jié)果 顯示，在抗體作用2小時(shí)的情況下，與對照組相比，20 μ g/ml和2 μ g/ml的赫賽汀均可引起 P-HER2和P-Akt的下調(diào)，而GB235-049抗體對P-HER2和P-Akt的下調(diào)作用均不明顯，對 P-HER2有輕微的上調(diào)作用。圖IOB的結(jié)果顯示，在24小時(shí)的作用條件下，赫賽汀對P-HER2 和P-Akt的下調(diào)作用與2小時(shí)的一致，而GB235-049抗體對P-HER2有上調(diào)作用，但對P-Akt 無明顯作用。圖IOC的結(jié)果顯示，在作用72小時(shí)的條件下，20 μ g/ml和2 μ g/ml的赫賽汀 對P-HER2、P-Akt和P-ERK1/2都產(chǎn)生了明顯的下調(diào)作用，而GB235-049抗體主要活性體現(xiàn) 在對P-ERK1/2的下調(diào)作用上，無論是在20 μ g/ml還是2 μ g/ml，其下調(diào)作用都很明顯。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 本文所用的術(shù)語"抗體"是能夠通過至少一個(gè)抗原識別位點(diǎn)，和靶分子（包括糖、 多聚核酸、脂類、多肽等）特異結(jié)合的免疫球蛋白。完整的抗體由兩個(gè)相同的輕鏈（L)和兩 個(gè)相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵和重鏈相連，而不同免疫球蛋白同 種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈 的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一端有恒定 區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)相對。特殊的 氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
[0036] 本文所用的術(shù)語"可變區(qū)"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形 成了各種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)可 變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中。 可變區(qū)較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包括四個(gè)FR區(qū)，它 們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)⑶R區(qū)相連，在某些情況下可形成部分β 折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR -起形成抗體的 抗原結(jié)合部位（參見Kabat等，NIH Publ. No. 91-3242,卷I，647-669頁（1991)。恒定區(qū)不 直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗 體的細(xì)胞毒性。
[0037] 脊椎動物抗體（免疫球蛋白）的"輕鏈"可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯 不同的兩類（稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以 分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步 分為亞類（同類型），如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同免疫球蛋白重 鏈恒定區(qū)分別稱為α、β、ε、μ、γ。不同免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周 知的。
[0038] 本文所用的"全人源抗體"是指抗體基因來源于人類的抗體。
[0039] 本文中，所謂"抗體"不但包括完整的多克隆或者單克隆抗體，也包括各種抗體片 段（如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv)，單鏈抗體（scFv)，由抗體片段形成的多特異性抗體，含有抗 體片段的融合蛋白，以及任何經(jīng)過改造但包含所需特異性識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子?？?體的來源或者制備方法并不受限制，例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物 等。
[0040] 下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，然而應(yīng)該理解，列舉這些實(shí)施例只 是為了說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明。下列實(shí)施例中未特別指明的濃度為質(zhì)量百分 比濃度；未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，《分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南》（New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按 照制造廠商所建議的條件。
[0041] 實(shí)施例1從全人源scFv B莖菌體文庫中篩選scFv的陽性克隆
[0042] 人HER2 (胞外域）-Fc融合蛋白（下文稱為hHER2-Fc)抗原（購自Sino Biological 公司，貨號：10004-H02H)用磷酸鹽緩沖液PBS (0· OlM Na2HPO4 ·12Η20+0· 002MKH 2Ρ04+0· 14Μ NaCl+0. 002Μ KC1，pH = 8. 6)稀釋至 5 μ g/ml，按照 100 μ 1/ 孔加入酶標(biāo)板中， 4°C包被過夜。PBST(含0. 05%吐溫20的PBS緩沖液）洗板4次后加入5% BSA(牛血清 白蛋白，貨號：A7030,購自Sigma公司）300 μ1/孔，37°C封閉1小時(shí)。再用PBST洗板2次。 將含有7 X IOltl個(gè)獨(dú)立克隆的全人源scFv噬菌體抗體文庫（此抗體庫由優(yōu)瑞科（北京）生 物技術(shù)有限公司以多個(gè)健康人淋巴細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因與人工合成的重鏈CDR3基因組 合構(gòu)建而成）的懸液按照100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板中，在37°C條件下孵育2小時(shí)。吸出噬菌 體懸液，加入PBST充分吹打5分鐘。在第一輪淘選過程中，PBST吹打一遍，在第二輪和第三 輪淘選中，PBST分別進(jìn)行五遍和十遍的吹打，以去除非特異性的結(jié)合。加入含0. 1 % BSA的 0. 2M甘氨酸-鹽酸（pH = 2. 2)洗脫液，室溫孵育10分鐘后，充分地吹打，洗脫陽性克隆的 噬菌體。將洗脫下的陽性克隆的噬菌體懸液用I MTris-HCUpH = 9. 1)緩沖液中和至中性， 感染對數(shù)期的大腸桿菌（購自Lucigen公司，貨號：60502-1)并擴(kuò)增，用于下一輪淘選（第 一、二輪）。第三輪淘選時(shí)，需將洗脫液進(jìn)行梯度稀釋并感染對數(shù)期宿主菌，在帶氨芐（Amp) 抗性的LB瓊脂培養(yǎng)皿上分離出單克隆來，用于單克隆鑒定及質(zhì)粒保存。
[0043] 實(shí)施例2 scFv噬菌體陽性克隆的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)鑒定
[0044] hHER2-Fc抗原用PBS (pH = 8. 6)稀釋至2 μ g/ml，按照100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板中， 4°C包被過夜。PBST洗板4次后加入5% BSA 300 μ 1/孔，37°C封閉1小時(shí)。再用PBST洗板 2次，加入100 μ 1/孔噬菌體陽性克隆懸液，在37°C條件下孵育2小時(shí)。PBST洗板4次，加 入HRP(辣根過氧化物酶）標(biāo)記的抗M13噬菌體抗體（購自GE公司，貨號：27-9421-01，用 PBSTl: 5000稀釋，100 μ 1/孔），室溫孵育1小時(shí)。PBST洗板4次，加入100 μ 1/孔顯色液 (可溶型單組分TMB底物溶液，購自Tiangen公司，貨號：ΡΑ107-01)，室溫孵育15分鐘顯色， 加入50 μ 1/孔終止液（1Μ硫酸），在多功能酶標(biāo)儀（Model 680Micro reader，購自Bio-Rad 公司）上450/630nm的波長下讀出吸光值。
[0045] 結(jié)果顯示，經(jīng)過三輪篩選，共獲得1312種全人源scFv，可與hHER2-Fc抗原特異性 結(jié)合的scFv噬菌體陽性克隆有499種。經(jīng)DNA測序，這些陽性克隆中有102種核苷酸/氨 基酸序列均不相同的scFv (如表1所示）。
[0046] 表 L
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種全人源的HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，輕鏈可變 區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
2. 權(quán)利要求1的全人源HER2抗體，其是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv的形式。
3. 權(quán)利要求1的全人源HER2抗體，還包括人IgG的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)；優(yōu)選地， 所述人IgG為IgGl;更優(yōu)選地，所述人IgG重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述 人IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:6。
4. 編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的全人源HER2抗體的核苷酸序列；優(yōu)選地，在所述核苷酸 序列中，編碼所述重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:3,編碼所述輕鏈可變區(qū)的核苷酸 序列為 SEQ ID N0:4。
5. 權(quán)利要求4的編碼全人源HER2抗體的核苷酸序列，其中當(dāng)所述全人源HRE2抗體包 含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)時(shí)，編碼所述重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:7,編碼所 述輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:8。
6. -種包含權(quán)利要求4的核苷酸序列的表達(dá)載體，所述核苷酸序列與所述表達(dá)載體的 表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為PGEM-T載體或293載體。
7. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的全人源HER2抗體和可藥用載體。
8. -種聯(lián)合藥物，其包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的全人源HER2抗體和赫賽汀。
9. 一種檢測人HER2的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的全人源HER2抗體。
10. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的全人源HER2抗體用于制備用于治療受試者中的HER2陽性 腫瘤的藥物的用途；優(yōu)選地，所述HER2陽性的腫瘤選自HER2陽性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非 小細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、 肛門區(qū)癌、結(jié)腸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸 癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、 膀胱癌、腎或尿道癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽囊癌、慢性或急性白血病、淋 巴細(xì)胞淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)癌、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形式成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (glioblastoma multiforme)，星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，室管膜瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，腦膜 瘤、鱗狀細(xì)胞瘤和垂體腺瘤；優(yōu)選地，所述受試者是人；更優(yōu)選地，所述受試者是對赫賽汀 耐藥或?qū)召愅o反應(yīng)的人。
【文檔編號】A61K39/395GK104497140SQ201410704632
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】周清, 舒孟軍, 石姝, 言蘇, 譚濤超 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司