專利名稱：一種人mgf多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品，具體是一種特異的人MGF多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1999年，Goldspink等將兔子的脛前肌置于伸展固定狀態(tài)后對(duì)其進(jìn)行電剌激，7天后發(fā)現(xiàn)肌肉塊增大了 35%。釆用差異顯示技術(shù)，在那些處于拉伸狀態(tài)并被電刺激的的肌纖維中，發(fā)現(xiàn)了大量能促使肌肉修復(fù)的IGF-1剪接異構(gòu)體，命名為Mechano GrowthFactor (MGF)。國內(nèi)學(xué)者一般將其翻譯為機(jī)械生長因子、力生長因子、生長因子素等。MGF在快速促進(jìn)受損傷肌肉修復(fù)再生、增加肌肉干細(xì)胞數(shù)量、保護(hù)神經(jīng)等方面具有重要的生理作用。
人MGF基因序列與來自肝臟的IGF-1相比，是在其mRNA的5號(hào)外顯子上插入了49個(gè)堿基，由于插入的堿基不能被3整除，所以產(chǎn)生了不同于IGF-1的表達(dá)產(chǎn)物。與全身性表達(dá)和發(fā)揮廣泛生理功能的IGF-1不同，MGF多在機(jī)體受到機(jī)械刺激或局部肌肉/神經(jīng)遭到損傷時(shí)，才會(huì)在損傷發(fā)生部位表達(dá)并發(fā)揮高效的修復(fù)和保護(hù)功能。在體內(nèi)，通過模式動(dòng)物證實(shí)，MGF在維持局部肌肉質(zhì)量和組織修復(fù)過程中的作用效果也明顯高于IGF-1。把含有MGF cDNA的表達(dá)載體注入老鼠脛骨前肌，僅在15天內(nèi)肌肉質(zhì)量就可增加20%，而攜帶IGF-1Ea cDNA的病毒載體注入后，則需120天肌肉質(zhì)量才達(dá)到同等水平。表明MGF是肌肉修復(fù)過程中一種重要的功能分子，與肌肉再生所必需物質(zhì)的表達(dá)之間存在著密切的內(nèi)在聯(lián)系。通過制備肌肉切片并測(cè)定肌纖維尺寸，發(fā)現(xiàn)肌纖維整體平均增加25%,但這種增加只局限于受注射部位，表明MGF的生理功能既具有作用效果的顯著性，也具有很強(qiáng)的靶位點(diǎn)特異性。另外，Olesen等ff究發(fā)現(xiàn)MGF還可誘導(dǎo)肌腱膠原蛋白的合成，在機(jī)械刺激后表達(dá)迅速上調(diào)的MGF與膠原蛋白III的mRNA合成速率正相關(guān)。另外，MGF還具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。在蒙古沙鼠的短暫腦缺血模型中，Dluzniewska等通過注射MGF合成肽能夠賦予沙鼠顯著的神經(jīng)保護(hù)作用；在抵抗腦部缺血的海馬體內(nèi)檢測(cè)到了表達(dá)明顯上調(diào)的MGF蛋白，而且這種作用是不依賴于IGF-1的受體而獨(dú)立發(fā)揮。Goldspink等研究了 MGF對(duì)面神經(jīng)切斷術(shù)后的修復(fù)損傷作用，發(fā)現(xiàn)相距3毫米的神經(jīng)創(chuàng)面僅在兩周內(nèi)就得到完全愈合，明顯優(yōu)于IGF-1 Ea和其他分子。數(shù)據(jù)顯示，MGF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)效果達(dá)到了80。/。以上。目前為止，未見介紹通過合成多肽進(jìn)行抗人MGF多克隆抗體制備的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決通過免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)人MGF的表達(dá)與天然存在，并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種能特異性針對(duì)人MGF的合成多肽抗體及其制備方法。
本發(fā)明所述的抗人MGF合成多肽抗體，按照以下步驟制備
抗原表位分析與拮抗位置確定利用經(jīng)典的表位預(yù)測(cè)軟件DNAstar進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、表面可及性等，最終確定第76到第88位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為QRHTDMPKTQKYQ。
多肽的合成靶標(biāo)多肽采用全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1。/。的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測(cè)純度。
多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動(dòng)物體內(nèi)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選擇鑰孔嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的免疫原性，從而制備出人工免疫原。
免疫動(dòng)物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免疫家兔制
備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過適應(yīng)性詞養(yǎng)后進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫。
抗體純化達(dá)到要求的免疫動(dòng)物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫
酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度，得到目標(biāo)抗體。
本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)，可與天然人MGF分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和WB試驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為人MGF分子的研究及其相關(guān)疾病的研究提供了一個(gè)重要工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)相應(yīng)靶蛋白的特性、含量的測(cè)定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。


圖1是DNASTAR軟件分析圖，表明本發(fā)明所選擇的肽段位于該蛋白的抗原性和親水性較強(qiáng)區(qū)段。
圖2是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對(duì)親和常數(shù)結(jié)果圖，其中ELISA檢測(cè)制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為106-107L/mol。
具體實(shí)施方式
1、 人MGF抗原肽的合成
用DNAstar分析軟件對(duì)人MGF氨基酸序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(Hydrophilicity)、抗原指數(shù)(Antigenicity)、表面可及性(Surface Probability)等分析以及同源性分析(Homology)，最終確定第76到第88位為靶標(biāo)，其氨基酸序列為QRHTDMPKTQKYQ。在全自動(dòng)多肽合成儀上由固定羧基向氨基端遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30%乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)分析，計(jì)算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定，由圖1所示。.
2、 合成多肽與載體的偶聯(lián)
載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶聯(lián)取KLH 5mg (0.11|jmol，含賴氨酸2.2iJmo1),溶于0.75mL偶聯(lián)緩沖液1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mgMBS (11|jmol)溶于75ijL二甲酷肢(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，室溫作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8 mL)加入預(yù)先用偶聯(lián)緩沖液2 (0.1 mol/L磷酸鹽，0.15 mol/L NaCL， 0.01 mol/LNa2EDTA，pH-7.0)平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5 mg合成多肽于0.15 mL偶聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩沖液0.56mL，室溫下旋轉(zhuǎn)混合，作用2小時(shí)后置4X過夜，將反應(yīng)混合物(約0.7mL)加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將KLH、MBS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。
3、 抗多肽抗體的制備
取偶聯(lián)的KLH-多肽500pg，溶于500 pL磷酸緩沖液，加等體積的完全福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤)，經(jīng)過適應(yīng)性詞養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點(diǎn)注射。2周后抗原量減半(250 pg)，加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強(qiáng)免疫。2周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，方法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1 pg/mL)包被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1: 10萬時(shí)停止免疫，采用頸動(dòng)脈放血收集抗體。
4、 親和層析純化抗多肽抗體
①人MGF合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化S印harose 4B，
用1 mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液洗2次，迅速與溶于5 mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合，室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時(shí)。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50 mL磷酸鹽緩沖液洗凝膠，按終止?jié)舛?.02 %加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。
②親和層析純化抗多肽抗體將20 mL兔抗多肽血清與1.6 mL多肽偶聯(lián)的S印harose4B共同加入50mL離心管，4。C旋轉(zhuǎn)混合6小時(shí)。將凝膠加入層析柱，棄去流出液，用15 mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加0.8 mL pH=2.9， 0.1 mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8支預(yù)先加入80 mL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20mL磷酸鹽緩沖液洗凝膠。上述全部操作過程在4°C下完成。毎管取洗脫液2ijL，稀釋50倍后測(cè)280nm的od值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
5、抗體的鑒定，使用間接ELISA方法檢測(cè)抗體相對(duì)親和常數(shù)用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 u g/mL和10 u g/mL的濃度，在4度下包被ELISA檢測(cè)板過夜，10%的山羊血清室溫封閉2小時(shí)后加入倍比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔lgG二抗0.1mL， TMB顯色測(cè)定A450。以抗
體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以曲線達(dá)到水平時(shí)的A450值為100%，以其他相對(duì)于該濃度
的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，求出A5o即50。/。A值對(duì)應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n-1)/2(n[Ab't-2[Ab]t)算出抗體相對(duì)親和常數(shù)，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A50時(shí)即包被抗原分別為5 p g/mL和10u g/mL時(shí)抗體半飽和時(shí)抗體的摩爾濃度，[Ag]t、 [Ag， ]t指的是包被的抗原濃度本實(shí)驗(yàn)中即指10pg和5wg， n=[Ag]t/[Ag，t，本實(shí)驗(yàn)中n-2，如圖2所示。試驗(yàn)效果
1. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回收率大致相符，大于90%。
2. 抗體效價(jià)多只家兔得到的抗血清效價(jià)均在1: 10萬以上。
3. 抗體親和力相對(duì)親和常數(shù)為106-107L/mol。
4. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋白印跡和各種酶免實(shí)驗(yàn)，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
<110>北京科技大學(xué)
<120> —種人MGF多肽及其抗體制備方法 <160>2
<210> 1 <211> 110 <212> PRT <213>人
<400> 1
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSC DLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQQRHTDMPKTQKYQKGSTF EEHK
<210>2 <211> 13 <212> PRT <213>人
<400> 2
QRHTDMPKTQKYQ
權(quán)利要求
1、一種人MGF多肽及其抗體制備方法，其特征在于，利用經(jīng)典的表位預(yù)測(cè)軟件DNAstar進(jìn)行綜合分析，最終確定第76到第88位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為QRHTDMPKTQKYQ，再經(jīng)多肽合成，多肽與載體蛋白交聯(lián)，免疫動(dòng)物，抗體純化，得到目標(biāo)抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，多肽合成是將靶標(biāo)多肽在全自 動(dòng)多通道多肽合成儀中合成，采用柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1%的標(biāo) 準(zhǔn)乙晴梯度來檢測(cè)純度。
3、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，多肽與載體蛋白交聯(lián)選擇鑰孔 嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)。
4、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，免疫動(dòng)物是以抗原肽-交聯(lián)載體 蛋白做為免疫原，免疫家兔制備抗體。
5、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，抗體純化是將達(dá)到要求的免疫 動(dòng)物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方 法，進(jìn)行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人MGF多肽及其抗體制備方法，涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品。本發(fā)明利用經(jīng)典的表位預(yù)測(cè)軟件DNAstar進(jìn)行綜合分析，確定抗原表位分析與拮抗位置，確定第76到第88位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為QRHTDMPKTQKYQ，經(jīng)過多肽合成，多肽與載體蛋白交聯(lián)，免疫家兔制備抗體和抗體純化，得到目標(biāo)抗體。本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)，可與天然人MGF分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和WB試驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101602794SQ200910083899
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者李傳寶, 杜宏武, 爽 王, 金海明 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)