本發(fā)明屬于磁性納米粒子技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說(shuō)，涉及一種聚兩性電解質(zhì)單體(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨(MPDSAH)修飾的磁納米粒子(MNPs)及其制備方法和應(yīng)用，形成的納米粒子聚合物刷(MNPs@PMPDSAH)具有潛在抗血清吸附功能，期望提高其抗吸附能力和生物相容性，延長(zhǎng)血液循環(huán)半衰期。

背景技術(shù)：

超順磁性納米粒子是一種十分優(yōu)良的MRI造影劑，擁有循環(huán)半衰期長(zhǎng)、生物相容性好、易被細(xì)胞吸收、分辨率高等特點(diǎn)。其可對(duì)腫瘤、血管、大腦、神經(jīng)、受損細(xì)胞、炎癥等許多部位進(jìn)行造影成像，對(duì)正常細(xì)胞和病變細(xì)胞具有很高的辨識(shí)度。新穎的、靶向的納米粒子合成方法使其很快能在許多疾病治療上得到廣泛的應(yīng)用，如腫瘤、腦缺血、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷等。此外，磁納米粒子在電子信息(如高密度信息存儲(chǔ)、電子設(shè)備等)、鐵磁流體、阻尼材料、環(huán)境保護(hù)等方面也有重要的應(yīng)用前景。

聚兩性電解質(zhì)是高分子鏈上同時(shí)帶有相反電荷官能團(tuán)的一類(lèi)物質(zhì)。正負(fù)電荷可以在同一結(jié)構(gòu)單元上，也可以分布在不同結(jié)構(gòu)單元中，還可以位于側(cè)鏈等結(jié)構(gòu)上。正負(fù)電荷基團(tuán)的數(shù)目可以相等而使聚合物呈電中性，也可以不相等而使聚合物帶有正的或負(fù)的凈電荷。前者由于分子內(nèi)的帶電基團(tuán)表現(xiàn)為靜電吸引，分子鏈?zhǔn)湛s并呈球狀，體系粘度相對(duì)較低；后者由于凈電荷不為零，所以其行為與只帶有單一電荷官能團(tuán)的聚電解質(zhì)相似，分子內(nèi)部表現(xiàn)為靜電排斥，分子鏈?zhǔn)嬲共⒊拾魻畹葮?gòu)象，由于分子鏈伸展使鏈間的內(nèi)摩擦增加，體系粘度隨之增大。由于同時(shí)帶有兩種電荷，使得聚兩性電解質(zhì)擁有許多十分獨(dú)特性質(zhì)。

近來(lái)磁納米粒子(MNPs)進(jìn)入了生物研究者的眼球、受到了越來(lái)越多的關(guān)注，由于自身獨(dú)特的性質(zhì)，其有望成為新一代性能優(yōu)異的MRI造影劑。然而，MNPs要達(dá)到使用級(jí)別仍有許多困難要克服，首先要解決的就是如何使其保持穩(wěn)定狀態(tài)以及在血液等生理環(huán)境中不被干擾、吸附、聚集、清除等，當(dāng)然更不能不考慮其生物相容性而使機(jī)體產(chǎn)生諸多危險(xiǎn)的生理反應(yīng)。顯然，裸露的MNPs并不能滿(mǎn)足這些要求，因?yàn)槠渚哂泻艽蟮谋? 表面能，易被氧化以及自發(fā)團(tuán)聚，因此，必須找到一種合適的物質(zhì)對(duì)其進(jìn)行修飾，才能真正達(dá)到醫(yī)用的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子及其制備方法和應(yīng)用，利用磺酸甜菜堿類(lèi)兩性離子聚合物(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨(MPDSAH)聚合物對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾，利用ATRP技術(shù)，可使兩性電解質(zhì)在MNPs表面發(fā)生原位聚合，從而得到改性后的磁納米MRI造影劑。其中PMPDSAH的引入使磁納米粒子具有抗血清吸附功能，使其能在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散。所得聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子(即磁性納米粒子聚合物刷MNPs@PMPDSAH)具有潛在抗血清吸附功能，期望提高其抗吸附能力和生物相容性，延長(zhǎng)血液循環(huán)半衰期。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子，在磁性納米粒子表面通過(guò)化學(xué)鍵連接聚(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨，首先合成磁性納米粒子(MNPs)，然后用氨基修飾的磁納米粒子(MNPs@NH2)，再通過(guò)磁納米粒子表面的氨基與2-溴代異丁酰溴反應(yīng)將溴引入粒子表面(MNPs@Br)最后采用ATRP合成MNPs@PMPDSAH聚合物納米刷(即聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子)。

制備方法按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，合成氨基修飾的磁納米粒子(MNPs@NH2)

將油酸修飾的磁性納米粒子分散在正己烷中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在惰性氣體保護(hù)和室溫20—25攝氏度下反應(yīng)8—12小時(shí)，即得到氨基修飾的磁納米粒子。

在所述步驟1中，所述惰性氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘邭鍤狻?/p>

在所述步驟1中，在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中使用磁力攪拌，以使整個(gè)反應(yīng)體系混合均勻。

在所述步驟1中，油酸修飾的磁性納米粒子為鐵基磁性納米粒子，依照參考文獻(xiàn)(Sun S H,Zeng H,Li G X,et al.Monodisperse MFe₂O₄(M＝Fe,Co,Mn)nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2004,126:273-279)的方法進(jìn)行制備和使用即可。

在所述步驟1中，通過(guò)配體交換的方法將氨基引入到磁性納米粒子中，為確保氨基引入的效果，添加過(guò)量的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在具體實(shí)施中考慮每50mL正己烷 中加入5—10mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

在反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)乙醇沉淀(醇沉)、離心、二氯甲烷溶解分離(萃取)的后處理方式以除去未反應(yīng)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷等雜質(zhì)，即得氨基修飾的磁納米粒子。

步驟2，合成表面帶溴的磁納米粒子引發(fā)劑(MNPs@Br)，通過(guò)磁納米粒子表面的氨基與2-溴代異丁酰溴反應(yīng)將溴引入粒子表面

將步驟1制備的氨基修飾的磁納米粒子、三乙胺和二氯甲烷分散均勻，在惰性氣體保護(hù)和冰水浴的條件下反應(yīng)30—60min，再向體系中加入2-溴代異丁酰溴并維持惰性氣體保護(hù)和冰水浴條件反應(yīng)10—24小時(shí)，即得到表面帶溴的磁納米粒子引發(fā)劑。

在所述步驟2中，所述惰性氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘邭鍤狻?/p>

在所述步驟2中，在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中使用磁力攪拌，以使整個(gè)反應(yīng)體系混合均勻。

在所述步驟2中，所述三乙胺和二氯甲烷的體積比為(1—2)：10，所述三乙胺和2-溴代異丁酰溴的體積比為(1—2)：1；為使氨基修飾的磁納米粒子上氨基與2-溴代異丁酰溴充分反應(yīng)，考慮相對(duì)于氨基修飾的磁納米粒子來(lái)說(shuō)，2-溴代異丁酰溴過(guò)量，在確定三乙胺、二氯甲烷和2-溴代異丁酰溴用量后再確定氨基修飾的磁納米粒子的用量，選擇氨基修飾的磁納米粒子的質(zhì)量(mg)與2-溴代異丁酰溴的體積(ml)相等，即2mg氨基修飾的磁納米粒子和2ml2-溴代異丁酰溴。

步驟3，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方式在氨基修飾的磁納米粒子的表面鍵接聚(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨

單體(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨、步驟2合成表面帶溴的磁納米粒子引發(fā)劑、催化劑CuCl和溶劑二甲基亞砜(DMSO)加到Schlenk管中，采用液氮冷凍后再抽氣的方式反復(fù)進(jìn)行操作，以去除氧的影響；在克蘭克管中的體系結(jié)束凍融后，通過(guò)注射器將配體溶液注入反應(yīng)體系繼續(xù)凍融，以去除氧的影響；凍融結(jié)束后充入惰性氣體并密封，并于室溫20—25攝氏度下反應(yīng)至少24小時(shí)；

所述配體溶液為配體N,N,N’,N’,N”-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA)的二甲基亞砜溶液，N,N,N’,N’,N”-五甲基二亞乙基三胺和二甲基亞砜的體積比為(0.02—0.03)：1；單體(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨和表面帶溴的磁納米粒子引發(fā)劑的質(zhì)量比為(500—800)：(10—15)；催化劑CuCl的質(zhì)量為表面帶溴的磁納米粒子引發(fā)劑質(zhì)量的兩倍；溶劑二甲基亞砜為整個(gè)反應(yīng)提供液態(tài)環(huán)境，用量以溶解和分散反應(yīng)物為原則即可。

在所述步驟3中，在室溫20—25攝氏度下反應(yīng)36—48小時(shí)。

在所述步驟3中，室溫20—25攝氏度下反應(yīng)36—48小時(shí)。

在所述步驟3中，所述惰性氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘邭鍤狻?/p>

在所述步驟3中，在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中使用磁力攪拌，以使整個(gè)反應(yīng)體系混合均勻。

在反應(yīng)結(jié)束后，使反應(yīng)體系接通大氣(氧)以終止反應(yīng)。將溶液液轉(zhuǎn)移到透析袋中，并于去離子水中透析一周以除去溶劑、催化劑以及未反應(yīng)單體等小分子雜質(zhì)。透析結(jié)束后經(jīng)冷凍干燥即得所需產(chǎn)物(聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子)，聚合物的引入使磁納米粒子具有抗血清吸附功能，使其能在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散。

利用荷蘭Philips公司Philips Tecnai G2F20本發(fā)明技術(shù)方案中MNPs和MNPs@PMPDSAH樣品表面形貌進(jìn)行觀察，如圖1-3所示。從圖1中可清楚地看到磁納米顆粒的晶格結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證明磁納米顆粒已被成功合成。從圖2和3中，可以清晰的分辨出晶格結(jié)構(gòu)周?chē)木酆衔飳樱Ц窠Y(jié)構(gòu)即所制備的磁性納米粒子，而其周?chē)臒o(wú)定形相是修飾磁性粒子表面的聚物層，其與磁性納米粒子的結(jié)晶相有明顯的襯度差別。聚合物殼層覆蓋在磁納米顆粒表面，顆粒成不規(guī)則的球形形狀，這也進(jìn)一步說(shuō)明了具有抗血清作用的MPDSAH已聚合到磁納米顆粒表面。

利用美國(guó)LakeShore Ltd.公司的Vibrating Sample Magnetometer測(cè)試本發(fā)明技術(shù)方案中磁納米顆粒和聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子的磁滯回線(xiàn)，如圖4所示。從圖中可以看出，二者都沒(méi)有出現(xiàn)磁滯回線(xiàn)圈，不存在剩磁、矯頑力等，也即所制備的納米顆粒產(chǎn)物具有超順磁性。

利用美國(guó)Thermo公司的Nicolet 380spectrometer紅外光譜儀測(cè)試本發(fā)明技術(shù)方案中聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子(即MNPs@PMPDSAH聚合物納米刷)的紅外光譜，結(jié)果如圖5所示。紅外光譜中，其特征峰有3430cm^-1處的N-H伸縮振動(dòng)峰，1650cm^-1處羰基振動(dòng)峰，1540cm^-1處的C-N、N-H振動(dòng)峰等。當(dāng)然，雖然單體MPDSAH結(jié)構(gòu)中也存在碳氮鍵和氮?dú)滏I，但由于溴引發(fā)劑中的酰胺鍵的干擾，3430cm^-1和1540cm^-1處的振動(dòng)峰并不能證明MPDSAH已經(jīng)接到磁納米顆粒上面。然而，MPDSAH中有一個(gè)很特殊的磺酸基團(tuán)，若紅外譜圖中存在其特征峰即可證明單體已接枝到磁納米顆粒表面，圖中確實(shí)找到了磺酸基的特征峰：1180cm^-1(對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))、1040cm^-1(不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))，故實(shí)驗(yàn)也成功制備了MNPs@PMPDSAH。

本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，所制備的兩性離子聚合物(3-(甲基丙烯酰胺 基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨(MPDSAH)修飾的磁性納米粒子，提高磁納米粒子的穩(wěn)定性和使用性，并且MPDSAH本身具有的超強(qiáng)抗血清吸附能力使得本技術(shù)發(fā)明中的聚合物刷(MNPs@PMPDSAH)作為磁納米造影劑的應(yīng)用，具有潛在抗血清吸附功能，期望提高其生物相容性，延長(zhǎng)血液循環(huán)半衰期。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中使用的磁性納米粒子MNPs的形貌圖。

圖2是本發(fā)明的聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子的形貌圖(1)。

圖3是本發(fā)明的聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子的形貌圖(2)。

圖4是本發(fā)明中使用的磁納米顆粒和聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子的磁滯回線(xiàn)圖，其中五邊形代表聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子，圓形代表磁納米顆粒。

圖5是本發(fā)明聚磺酸甜菜堿兩性電解質(zhì)修飾的磁性納米粒子的紅外光譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

首先依照參考文獻(xiàn)(Sun S H,Zeng H,Li G X,et al.Monodisperse MFe₂O₄(M＝Fe,Co,Mn)nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2004,126:273-279)的方法進(jìn)行磁納米顆粒制備。具體來(lái)說(shuō)，將0.353g的乙酰丙酮鐵、1.29g的1,2-十六烷二醇、0.78mL油酸、0.96mL油胺溶解于20mL的苯醚中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、200℃下回流30分鐘，然后再在265℃下繼續(xù)回流30分鐘，整個(gè)過(guò)程均在磁力攪拌下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后將深褐色產(chǎn)物冷卻至室溫，然后加入40mL無(wú)水乙醇將產(chǎn)物沉淀下來(lái)，并通過(guò)離心(6000r/min,10min)的方法將固體產(chǎn)物分離出來(lái)。為了進(jìn)一步純化產(chǎn)物，再用溶有0.05mL油酸、0.05mL油胺的正己烷溶液將固體產(chǎn)物溶解，離心(6000r/min,10min)以出去不溶物，最后再經(jīng)醇沉、離心得到純化的黑色固體產(chǎn)物，將其置于真空干燥機(jī)中干燥即得油酸修飾的磁納米顆粒(即MNPs@OA)。

將上一步制備的MNPs@OA溶于50mL正己烷中，加入5mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、磁力攪拌及室溫條件下反應(yīng)8小時(shí)，最后經(jīng)醇沉、離心、二氯甲烷溶解等后處理除去未反應(yīng)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷等雜質(zhì)，即得氨基修飾的磁納米顆粒 (即MNPs@NH2)。

將上一步制得的MNPs@NH2與3mL三乙胺、30mL二氯甲烷在氮?dú)獗Ｗo(hù)、磁力攪拌以及冰水浴的條件下反應(yīng)30分鐘，然后再加入2毫升2-溴代異丁酰溴反應(yīng)12小時(shí)(氮?dú)獗Ｗo(hù))。反應(yīng)結(jié)束后，用體積比為1:1水和無(wú)水乙醇的混合液，在pH為4.0(冰醋酸調(diào)節(jié)pH)的條件下，將產(chǎn)物沉淀下來(lái)，并離心分離(6000r/min,10min)即得表面帶溴的磁納米粒子(即MNPs@Br)。

采用ATRP方法使單體MPDSAH在表面溴取代磁納米顆粒引發(fā)劑表面原位聚合，通過(guò)改變單體與引發(fā)劑的投入量以及反應(yīng)的時(shí)間可達(dá)到控制高分子鏈的長(zhǎng)度的目的。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別進(jìn)行了如下幾個(gè)反應(yīng)：

(1)0.50g單體、10mg引發(fā)劑、20mg CuCl、35mL DMSO、反應(yīng)24h；

(2)0.60g單體、10mg引發(fā)劑、20mg CuCl、35mL DMSO、反應(yīng)24h；

(3)0.70g單體、10mg引發(fā)劑、20mg CuCl、35mL DMSO、反應(yīng)24h；

(4)0.80g單體、10mg引發(fā)劑、20mg CuCl、35mL DMSO、反應(yīng)24h；

(5)0.50g單體、10mg引發(fā)劑、20mg CuCl、35mL DMSO、反應(yīng)48h。

現(xiàn)以第(1)個(gè)反應(yīng)條件為例，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：將0.50g MPDSAH單體、10mg MNPs@Br引發(fā)劑、20mg CuCl催化劑和35mL DMSO溶劑(以及磁子)加到Schlenk管中。用液氮將溶液冷凍，體系凍住后再抽氣直至其融化，然后再通氮?dú)?，并這樣重復(fù)三次(即冷凍→抽氣→融化→充氣)。

在凍融的過(guò)程中配制配體N,N,N’,N’,N”-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA)的DMSO溶液：取21μL(0.1mmol)PMDETA溶于2mL DMSO中。待克蘭克管中的體系凍融三次后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下、通過(guò)2mL注射器將配體溶液注入反應(yīng)體系，然后用聚四氟乙烯帶將體系密封好，繼續(xù)凍融三次后，充氮?dú)饷芊猓⒂谑覝叵路磻?yīng)24小時(shí)(磁力攪拌)。

反應(yīng)24小時(shí)后使體系接通大氣以終止反應(yīng)。將溶液液轉(zhuǎn)移到透析袋中，并于去離子水中透析一周以除去溶劑、催化劑以及未反應(yīng)單體等小分子雜質(zhì)。透析結(jié)束后經(jīng)冷凍干燥即得所需產(chǎn)物，即MNPs@PMPDSAH聚合物納米刷，PMPDSAH的引入使磁納米顆粒具有抗血清吸附功能，使其能在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散。由于本發(fā)明采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合，可以通過(guò)改變單體與引發(fā)劑的投入量以及反應(yīng)的時(shí)間來(lái)控制高分子鏈的長(zhǎng)度。

取少量干燥的樣品，采用Vanio-EL(Elementar Analysensysteme GmbH,德國(guó))元素分析儀測(cè)定磁納米引發(fā)劑中溴的含量，以此來(lái)計(jì)算磁納米顆粒表面每條高分子鏈的長(zhǎng)度。

元素分析的測(cè)定結(jié)果顯示，引發(fā)劑的溴含量為3.12％。已知溴含量可以計(jì)算ATRP反應(yīng)后每條高分子鏈的長(zhǎng)度，如以單體MPDSAH投入量為0.5g的反應(yīng)為例：由于ATRP是一種可控活性聚合，基本可認(rèn)為每條鏈的增長(zhǎng)速率一樣，已知MPDSAH的相對(duì)分子質(zhì)量為292、其投入量為0.5g，ATRP反應(yīng)過(guò)程單體轉(zhuǎn)化率為19％(以反應(yīng)24h的產(chǎn)物為例)；溴的相對(duì)原子質(zhì)量為80，引發(fā)劑用量10mg、其溴含量3.12％，則：

同理：

當(dāng)單體投入量為0.6g、引發(fā)劑投入10mg(反應(yīng)24h)，每條鏈鏈段數(shù)為100段；

當(dāng)單體投入量為0.7g、引發(fā)劑投入10mg(反應(yīng)24h)，每條鏈鏈段數(shù)為116段；

當(dāng)單體投入量為0.8g、引發(fā)劑投入10mg(反應(yīng)24h)，每條鏈鏈段數(shù)為133段；

當(dāng)單體投入量為0.5g、引發(fā)劑投入10mg(反應(yīng)48h，即轉(zhuǎn)化率為40％)，每條鏈鏈段數(shù)為176段。

在本發(fā)明內(nèi)容公開(kāi)的參數(shù)范圍進(jìn)行上述實(shí)施例的工藝調(diào)整，均可制備本發(fā)明的產(chǎn)物，且表現(xiàn)出基本相同的性質(zhì)。同時(shí)在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合中，可通過(guò)改變單體與引發(fā)劑的投入量以及反應(yīng)的時(shí)間來(lái)控制高分子鏈的長(zhǎng)度。兩性離子聚合物(3-(甲基丙烯酰胺基)丙基)-二甲基-(3-磺丙)氫氧化銨(MPDSAH)修飾的磁性納米粒子，作為磁納米造影劑的應(yīng)用，具有潛在抗血清吸附功能，期望提高其生物相容性，延長(zhǎng)血液循環(huán)半衰期。

以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。