本發(fā)明屬于黃曲霉毒素凈化處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2凈化的多功能磁性納米粒子，并進(jìn)一步公開(kāi)其制備方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素(aft)是公認(rèn)的天然強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，其中以黃曲霉毒素b1(aftb1)毒性最大。黃曲霉毒素b1為黃曲霉菌、寄生曲霉毒產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸、致突變的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的一種真菌毒素。目前一般的食品加工條件都不易破壞其毒性，因此給食品安全埋下了巨大的隱患。各國(guó)對(duì)食品中黃曲霉毒素的殘留非常重視，制定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，用于黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的凈化技術(shù)主要有免疫親和柱、多功能凈化小柱等。傳統(tǒng)的多功能凈化小柱是以極性、非極性及離子交換等基團(tuán)組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白質(zhì)類等雜質(zhì)，毒素不被吸附而直接通過(guò)，從而達(dá)到對(duì)多種毒素的凈化處理。但是由于這些多功能精華小柱填充顆粒多為直徑較大的微米球，比表面積相對(duì)較小，官能團(tuán)固載量較低，造成低的凈化效率；同時(shí)這些凈化柱價(jià)格昂貴，且多為一次性使用，這使得分析成本較高、耗時(shí)較長(zhǎng)，嚴(yán)重制約了對(duì)食品中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的安全監(jiān)測(cè)和凈化。

對(duì)于黃曲霉毒素的凈化而言，有關(guān)對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行修飾，并應(yīng)用于磁性納米粒子分離純化的研究已有報(bào)道。磁性納米材料是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型材料，研究和開(kāi)發(fā)新型納米磁性材料已經(jīng)引起世界各國(guó)的廣泛興趣。磁性納米粒子具有超高的比表面積，大大提高了官能團(tuán)的固載量，且易于進(jìn)行化學(xué)修飾以實(shí)現(xiàn)多種用途。經(jīng)修飾后的磁性納米粒子能夠與被測(cè)試樣品相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下可以快速?gòu)膹?fù)雜的樣品中實(shí)現(xiàn)分離，因此凈化效率更高、成本更低。

中國(guó)專利cn102680673a公開(kāi)了一種用于凈化黃曲霉毒素樣本的免疫磁性微粒，是將黃曲霉毒素b1抗體與磁性微粒共同反應(yīng)一段時(shí)間后，制備出具有特異性的免疫磁性微粒，可實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素親和吸附到免疫磁性微粒表面。又如中國(guó)專利cn104959114a分別公開(kāi)了一種將黃曲霉毒素b1核酸適配體與磁性微粒偶聯(lián)，制備所得具有特異性的免疫磁性微粒，可用于樣品中黃曲霉毒素b1的分離純化。上述兩種免疫磁性微粒能夠有效分離凈化黃曲霉毒素b1，并改善了分離效率；但是上述免疫磁性微粒均是僅僅針對(duì)黃曲霉毒素b1的凈化制得，其只能夠凈化黃曲霉毒素b1而對(duì)其他真菌毒素?zé)o作用，這也間接使得對(duì)整體毒素的凈化效率略低。因此，對(duì)于復(fù)雜樣品中微量的多種真菌毒素的快速、有效的分離凈化仍是亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2凈化的多功能磁性納米粒子，以解決現(xiàn)有技術(shù)中凈化黃曲霉毒素的磁性顆粒凈化效率較低的問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述的用于黃曲霉毒素凈化的多功能磁性納米粒子，所述磁性納米粒子包括：

由磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；

包覆所述內(nèi)核層的烷化層；

由多功能官能團(tuán)修飾的外殼層。

所述硅烷化層沿靠近所述內(nèi)核層方向包括第一硅烷化層和第二硅烷化層；所述第一硅烷化層為四乙氧基硅烷層；所述第二硅烷化層為甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷層。

所述硅烷化層為由四乙氧基硅烷和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷鍵合包覆的硅烷化層。

所述外殼層為苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸縮水甘油酯修飾層。

所述磁性納米粒子為順磁性的fe3o4磁性納米粒子。

本發(fā)明所述黃曲霉毒素是指黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備所述的用于黃曲霉毒素凈化的多功能磁性納米粒子的方法，包括如下步驟：

(1)取所述磁性納米粒子，在外加磁場(chǎng)下洗滌所述磁性納米粒子，并冷凍干燥；

(2)使用選定的硅烷化試劑制得所述硅烷化層；

(3)取選定的多功能官能團(tuán)經(jīng)反應(yīng)制得所述外殼層，即得。

具體的，所述的制備所述的用于黃曲霉毒素凈化的多功能磁性納米粒子的方法，包括如下步驟：

(1)通過(guò)共沉淀技術(shù)，制備出fe3o4磁性納米粒子，在外加磁場(chǎng)下，洗滌磁性納米粒子，冷凍干燥；

(2)使用反相微乳液中的溶膠-凝膠法制備四乙氧基硅烷包裹的磁性納米粒子，之后用甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷對(duì)硅膠表面進(jìn)行化學(xué)修飾引入雙鍵；

(3)在水相中進(jìn)行乳液聚合，以苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體、二乙烯苯為交聯(lián)劑、過(guò)硫酸鉀為引發(fā)劑、十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，反應(yīng)后經(jīng)水洗制備得到多功能團(tuán)修飾的磁性納米粒子復(fù)合物。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述的用于黃曲霉毒素凈化的多功能磁性納米粒子用于制備黃曲霉毒素凈化劑的用途。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種凈化黃曲霉毒素的方法，包括如下步驟：

(1)按照所述方法制得所需多功能磁性納米粒子；

(2)取含有黃曲霉毒素的待凈化樣本加入甲醇-水或乙腈-水溶液混合進(jìn)行提??；

(3)將所述多功能磁性納米粒子加入上述步驟(2)的混合液中進(jìn)行反應(yīng)，捕獲含有的黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)磁性分離，上清液即為含有所述黃曲霉毒素的樣本。

所述黃曲霉毒素優(yōu)選為牛奶中的黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

所述的凈化黃曲霉毒素的方法，還包括所述磁性納米粒子再生的步驟，具體包括：將所述步驟(3)中磁性分離得到的磁性納米粒子，加入至甲酸甲醇或甲酸乙腈洗脫液中振蕩混合，并經(jīng)磁性分離將所述磁性納米粒子吸附的雜質(zhì)洗脫，分離后的所述磁性納米粒子重懸于水中保存。

本發(fā)明所述多功能磁性納米粒子以順磁性fe3o4磁性納米粒子為內(nèi)核層，并在其所述內(nèi)核層包覆特定硅烷化試劑形成的硅烷層，以及在其表面修飾使其表面鍵合多功能團(tuán)。所述磁性納米粒子具有加大的比表面積，對(duì)多種官能團(tuán)的固定化容量很高，可有效捕獲牛奶中的黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2，樣品凈化效率高，分離效率和回收率高達(dá)80％-90％。

本發(fā)明所述多功能磁性納米粒子，在磁性納米顆粒表面包覆一層惰性的無(wú)機(jī)或者有機(jī)材料，保護(hù)純金屬磁性納米顆粒免受空氣中氧氣的侵蝕問(wèn)題。所述硅膠外殼不僅可以隔絕活性內(nèi)核和外界環(huán)境，還提供了較高活性的硅羥基表面以便進(jìn)一步修飾，同時(shí)避免了修飾試劑和磁性納米粒子直接接觸導(dǎo)致的磁性、光學(xué)性質(zhì)的降低。本發(fā)明所述磁性納米粒子選擇聚(苯乙烯-二乙烯苯-gma)(psd)作為硅膠層的外殼包裹層，合成具有多層核-殼結(jié)構(gòu)的磁性納米粒子。所述psd聚合物的優(yōu)點(diǎn)是利用三組分之間的混合優(yōu)勢(shì)：聚苯乙烯-二乙烯苯可以提供合適的交聯(lián)聚合物，而且這種聚合物本身具有表面性質(zhì)均勻、外形光滑，無(wú)孔的特點(diǎn)，非常適合做聚合物基質(zhì)；gma作為一種含有環(huán)氧的單體分子，極性相對(duì)較大，而另外聚苯乙烯-二乙烯苯為弱極性物質(zhì)，強(qiáng)極性與弱極性基質(zhì)的同時(shí)存在可以更好的去除牛奶樣品中脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對(duì)黃曲霉毒素的萃取效率更高。所以，本發(fā)明所述磁性納米粒子選用適合包裹的psd聚合物，具有較好的外形、分散性控制以及較好的穩(wěn)定性。

本發(fā)明所述多功能磁性納米粒子，用于黃曲霉毒素b1、b2樣品凈化分離過(guò)程簡(jiǎn)單便捷，并可在外磁場(chǎng)作用下進(jìn)行分離，容易回收再生。同時(shí)，所述磁性納米粒子在凈化樣品時(shí)，只需要對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的處理，不需要高速離心和固相萃取的活化處理，也不存在堵塞和反應(yīng)后分離困難的問(wèn)題，還可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整反應(yīng)體積，整個(gè)方法簡(jiǎn)單易行。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中，

圖1為本發(fā)明所述磁性納米粒子的透射電鏡圖；其中，圖a和圖b為所述順磁性fe3o4磁性納米粒子的透射電子顯微鏡圖；圖c和圖d為所述的表面帶有硅膠的磁性納米粒子(fe3o4@sio2)的透射電子顯微鏡圖；圖e和圖f為所述的多官能團(tuán)修飾的磁性納米粒子(fe3o4@sio2@pgma)透射電子顯微鏡圖；

圖2為本發(fā)明所述磁性納米粒子的紅外光譜圖，其中，曲線a為所述順磁性fe3o4磁性納米粒子的紅外光譜圖；曲線b為所述的表面帶有硅膠的磁性納米粒子的紅外光譜圖(fe3o4@sio2)；曲線c為所述的多官能團(tuán)修飾紅外光譜圖(fe3o4@sio2@psd)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備多功能磁性納米子

本實(shí)施例所述多功能磁性納米子包括：

由順磁性的fe3o4磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；

包覆所述內(nèi)核層的第一硅烷化層(四乙氧基硅烷層)，以及包覆所述第一硅烷化層的第二硅烷化層(甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷層)；

由苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多功能官能團(tuán)修飾的外殼層。

本實(shí)施例所述多功能磁性納米子按照如下方法制備：

(1)fe3o4磁性納米粒子的合成

取2.705g六水合氯化鐵(10.0mmol)、0.995g四水合氯化亞鐵(5.0mmol)，溶于10ml用脫氣去離子水配制0.4m鹽酸中，超聲15min使其充分溶解，用機(jī)械攪拌器攪拌。另配100ml0.4m的氫氧化鈉水溶液，也用氦氣脫氣，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，氫氧化鈉溶液用恒壓加料漏斗緩慢均勻的加入體系，室溫下反應(yīng)。氫氧化鈉溶液加完后，體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下放入80℃油浴加熱反應(yīng)30min。冷卻到室溫后，將反應(yīng)體系于4℃、13500rpm離心10min，去上清后加入100ml0.1m鹽酸水溶液浸泡，然后將溶液于4℃、13500rpm離心10min并去上清，再加入100ml乙醇浸泡粒子，并將溶液于4℃、13500rpm離心10min去上清，以去掉未反應(yīng)的堿和其他雜質(zhì)。殘留的固體物質(zhì)用20ml去離子水超聲30min，之后將反應(yīng)液于4℃、13500rpm離心30min后取上清，最終得到20ml黑色的磁性納米粒子分散體系，測(cè)定其含量為10mg/ml，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下4℃保存，備用；

對(duì)上述所得的fe3o4磁性納米粒子的形貌進(jìn)行檢測(cè)，圖1中a和圖1中b顯示了所述順磁性fe3o4磁性納米粒子的透射電子顯微鏡圖；

(2)硅烷化修飾(fe3o4@sio2)磁性納米粒子的合成

在一個(gè)干燥干凈的250ml廣口瓶中，將123.2ml環(huán)己烷與25.6ml正己醇超聲混合，用氦氣脫氣5min，然后加入稱量好的28.3gtritonx-100，磁力攪拌5min，隨即加入3.28ml之前制備的fe3o4磁性納米粒子分散體系，常溫?cái)嚢?0min使之充分形成黑亮均勻的微乳液。另取1.6ml四乙氧基硅烷(teos)用注射器一次性加入反應(yīng)體系，攪拌10min使之充分溶解，然后加入0.96ml濃氨水(25-27％wt)，室溫下攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)完畢，用200ml無(wú)水乙醇淬滅微乳液體系，淬滅過(guò)程需要幾分鐘，然后將反應(yīng)液于24℃、7830rpm離心2min，去上清后取固體物質(zhì)用100ml無(wú)水乙醇超聲5min重懸，然后將重懸液于24℃、7830rpm離心3min，去上清并以乙醇洗滌的過(guò)程重復(fù)3-4次，直至上清液清亮透明為止，以充分除去粒子表面吸附的表面活性劑tritonx-100。固體物質(zhì)洗滌完畢超聲15min重懸于150ml無(wú)水乙醇中，抽換氮?dú)馊危⒃?00℃沸水中回流處理3h。反應(yīng)完畢冷卻室溫后，將粒子離心收集，在一個(gè)干燥的250ml廣口瓶中，將粒子超聲15min重新分散于100ml干燥無(wú)水乙醇中，然后加入1ml硅烷化試劑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(mps)，于35℃油浴中反應(yīng)48h，待反應(yīng)完畢后于24℃、7830rpm離心3min，收集粒子并用無(wú)水乙醇洗滌4次，每次均超聲5min并重懸，然后于24℃、7830rpm離心3min，收集所得的硅烷化修飾粒子。洗滌完畢后，將所得粒子真空干燥，并于4℃保存；

對(duì)上述表面硅烷化修飾的磁性納米粒子的形貌進(jìn)行檢測(cè)，圖1中c和圖1中d顯示了所述的表面帶有硅膠的磁性納米粒子的透射電子顯微鏡圖；

(3)多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性納米粒子的合成

取30mg上述mps修飾的fe3o4@sio2磁性納米粒子，分散于1ml乙醇溶劑中，超聲30min充分分散。另取15ml去離子水用氦氣脫氣，然后加入稱量好的3mgsds，超聲5min充分溶解。然后將上述1ml乙醇分散的fe3o4@sio2磁性納米粒子加入體系中，抽換氮?dú)馊?，超?min。反應(yīng)體系入油浴加熱，待溫度升到40℃后，注射器慢慢加入超聲混勻的混合單體(含1ml苯乙烯，0.1mlgma，0.04ml二乙烯苯，各單體均用堿性氧化鋁過(guò)濾)，磁力攪拌下升溫，待體系溫度升到75℃時(shí)，注射加入0.5ml過(guò)硫酸鉀溶液(kps，0.02g/ml)，控制溫度穩(wěn)定在75℃，反應(yīng)17h，待體系顏色由黑變灰，并逐漸發(fā)紅。反應(yīng)完畢后體系磁分離，收集固體，固體物質(zhì)用水洗三次。洗滌完畢將粒子分散于20ml去離子水中，氦氣脫氣，加入0.1mlgma，抽換氮?dú)馊?，油浴加熱。待混度升?0℃，加入0.1ml過(guò)硫酸銨溶液(10％wt)，溫度維持80℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢粒子變紅，反應(yīng)體系用磁力分離，所得固體粒子用水洗兩次，得到所需fe3o4@sio2@psd磁性納米粒子，然后超聲分散于20ml水中，4℃保存；

對(duì)上述多功能磁性納米子復(fù)合物的形貌進(jìn)行檢測(cè)，圖1中e和圖1中f顯示了所述多官能團(tuán)修飾的磁性納米粒子的透射電子顯微鏡圖，所示的每個(gè)獨(dú)立的多功能磁性納米粒子中，深色區(qū)域顯示為內(nèi)核層，淺色區(qū)域顯示為外殼層。

分別對(duì)所述的fe3o4磁性納米粒子、所述表面硅烷化修飾的磁性納米粒子及所述多功能磁性納米子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，圖2中曲線a為所述順磁性fe3o4磁性納米粒子的紅外光譜圖；曲線b為所述的表面帶有硅膠的磁性納米粒子的紅外光譜圖；曲線c為所述的多官能團(tuán)修飾紅外光譜圖。實(shí)施例2制備多功能磁性納米子

本實(shí)施例所述多功能磁性納米子包括：

由順磁性的fe3o4磁性納米粒子構(gòu)成的內(nèi)核層；

包覆所述內(nèi)核層的烷化層，所述硅烷化層由四乙氧基硅烷和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷鍵合包覆；

由苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸縮水甘油酯多功能官能團(tuán)修飾的外殼層。

本實(shí)施例所述多功能磁性納米子按照如下方法制備：

(1)fe3o4磁性納米粒子的合成

所述fe3o4磁性納米粒子的合成同實(shí)施例1步驟(1)；

(2)硅烷化修飾(fe3o4@sio2)磁性納米粒子的合成

硅烷化修飾(fe3o4@sio2)磁性納米粒子的合成同實(shí)施例1步驟(2)，其區(qū)別僅在于將兩種硅烷化試劑共同添加進(jìn)行鍵合；

(3)多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性納米粒子的合成

所述多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性納米粒子的合成步驟同實(shí)施例1步驟(3)。

應(yīng)用例1

本應(yīng)用例以實(shí)施例1所制備的多功能磁性納米粒子提取牛奶樣品中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

所述待凈化樣本的制備包括：分別在空白牛奶樣品中添加10g/kg、20g/kg、50g/kg的黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2，平行添加5個(gè)樣品。

所述凈化牛奶樣品中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的方法包括如下步驟：

(1)分別量取上述制得的待凈化牛奶樣本5ml，加入10ml水-乙睛溶液(4：6，v/v)，渦旋混合2min，超聲處理15min，靜置后每個(gè)樣本取1ml上清液，備用；

(2)分別向上述每個(gè)上清樣本中加入實(shí)施例1制得的多功能磁性納米粒子10mg，振蕩反應(yīng)30min，并在反應(yīng)后在外加磁場(chǎng)作用下，磁性分離得到上清液和磁性納米粒子；

(3)將磁性分離后的磁性納米粒子加入至5ml甲酸甲醇(1+99，v/v)溶液中，解脫出黃曲霉毒素，洗脫氮?dú)獯蹈?，并加?00ml三氟乙酸于50℃衍生5min后，于50℃吹干衍生試劑，用流動(dòng)相定容至1.0ml，待hplc-fld分析；

(4)將步驟(3)中分離的磁性納米粒子保存在脫氣水中。

將上述處理后的樣品，進(jìn)行hplc-fld分析，結(jié)果見(jiàn)下表1。

所述黃曲霉毒素的hplc-fld評(píng)價(jià)方法檢測(cè)條件包括：

色譜柱：c18，4.6×150mm，5m；

柱溫：30℃；

流動(dòng)相：乙睛+甲醇+水(13+12+75)；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣量：20.0l；

洗脫方式：等度洗脫；

熒光檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)，365nm，發(fā)射波長(zhǎng)，440nm。

表1多功能磁性納米粒子復(fù)合物應(yīng)用于牛奶中黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率和重復(fù)性

上述數(shù)據(jù)可知，經(jīng)測(cè)定本發(fā)明所述磁性納米離子對(duì)黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的回收率均達(dá)到80％以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％，說(shuō)明該納米材料適用于牛奶實(shí)際樣品中黃曲霉毒素的凈化。

另在空白牛奶樣品中添加20g/kg黃曲霉毒素b1，平行添加5個(gè)，使用同一份多功能磁性納米粒子，經(jīng)上述步驟(1)-(4)處理后，其添加回收率分別是86％、84％、80％、81％，說(shuō)明該納米材料具備良好的再生性。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。