本發(fā)明涉及一種組合物，包含綠茶提取物、膠原蛋白和軟骨素。這種組合物可以用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎、增長(zhǎng)動(dòng)物的預(yù)期壽命、在動(dòng)物中保持可動(dòng)性或預(yù)防可動(dòng)性下降并用于制備這種組合物的方法中。該組合物還可以用于治療關(guān)節(jié)炎的方法、增長(zhǎng)預(yù)期壽命的方法、保持可動(dòng)性或預(yù)防可動(dòng)性降低的方法或延緩衰老的方法中。
背景技術(shù)：
：動(dòng)物健康的維持與改善是本領(lǐng)域中不斷持續(xù)的目標(biāo)。健康包括任何動(dòng)物、哺乳動(dòng)物，特別是貓、犬或人類(lèi)的健康?，F(xiàn)今獸醫(yī)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步為寵物主人提供了，無(wú)論寵物生病與否，延長(zhǎng)寵物壽命以及改善生命質(zhì)量的能力。寵物主人將會(huì)竭盡全力延長(zhǎng)珍愛(ài)的寵物的生命。寵物主人常常對(duì)寵物有高度依戀或極度的奉獻(xiàn)(commitment)，或者依賴(lài)動(dòng)物將其作為主要情感支柱。因此，對(duì)于用于寵物及甚至其它動(dòng)物包括人類(lèi)的延長(zhǎng)壽命并確保高質(zhì)量生活的產(chǎn)品有需求。關(guān)節(jié)炎是寵物動(dòng)物和人類(lèi)中的常見(jiàn)問(wèn)題。對(duì)犬的骨關(guān)節(jié)炎的治療可以是醫(yī)學(xué)上的或外科的，在危重病例中，其可以包括髖關(guān)節(jié)置換。通常，犬的骨關(guān)節(jié)炎將隨著時(shí)間惡化，但某些藥物可以減慢進(jìn)程。治療可以包括抗炎藥物的給藥。這同樣適用于人類(lèi)。不幸的是，這些藥物具有不良的副作用，并且外科手術(shù)是漫長(zhǎng)且昂貴的。可以延長(zhǎng)動(dòng)物生命的食品是十分理想的。另外，對(duì)于可用于治療動(dòng)物的骨關(guān)節(jié)炎的新方法和組合物、特別是有效控制這些病癥的食品組合物有持續(xù)的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及組合物及其用途。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種組合物，包含綠茶提取物、膠原蛋白和軟骨素。綠茶提取物是指來(lái)自綠茶葉片(茶樹(shù)(Camelliasinensis))的草本衍生物。綠茶提取物可以通過(guò)軟浸劑、軟浸膏、干浸膏和部分純化的浸膏技術(shù)產(chǎn)生。綠茶提取物可以包含綠茶兒茶酚(greenteacatechins，GTC)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechingallate，ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)和類(lèi)黃酮，諸如莰非醇、五羥黃酮、楊梅黃酮。膠原蛋白包括水解膠原蛋白、纖絲膠原蛋白(fibrillarycollagen)和膠原蛋白I型至膠原蛋白XVIII型。水解膠原蛋白是特別優(yōu)選的，尤其是與綠茶提取物和硫酸軟骨素組合。軟骨素是軟骨膠衍生物。軟骨素包括硫酸軟骨素。任意一種或多種成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物15mg至5g、水解膠原蛋白50mg至17g以及軟骨素10mg至4g。成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物15mg至1g、水解膠原蛋白50mg至1g以及軟骨素10mg至1g。成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物15mg至500mg、水解膠原蛋白50mg至500mg以及軟骨素10mg至500mg。成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物1g至5g、水解膠原蛋白5g至17g以及軟骨素1g至4g。成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物1g至3g、水解膠原蛋白8g至14g以及軟骨素1g至3g。成分可以以下列范圍存在：綠茶提取物200mg至2g、水解膠原蛋白500mg至5g以及軟骨素200mg至2g。成分綠茶提取物、膠原蛋白和軟骨素的這些量可以作為每日總量提供。該量將考慮動(dòng)物的大小。30mg/kg/日的綠茶提取物的所需量將在用于小型犬(約0.5kg)的約15mg至用于大型犬(166kg)的約5g的范圍內(nèi)。對(duì)于膠原蛋白，所需量可以是100mg/kg/日，并且將在用于小型犬(約0.5kg)的約50mg至用于大型犬(166kg)的約17g的范圍內(nèi)。對(duì)于軟骨素，所需量可以是20mg/kg/日，并且將在用于小型犬(約0.5kg)的約10mg至用于大型犬(166kg)的約3g的范圍內(nèi)。犬的重量的范圍可以為1kg至120kg、5kg至100kg、10kg至90kg、15kg至60kg、20kg至40kg、25kg至35kg。適合的范圍還包括20mg/kg/日綠茶提取物至40mg/kg/日。約0.2％、0.25％、0.3％、0.35％的飲食是適合的(尤其對(duì)于犬)。適合的范圍還包括50mg/kg/日至150mg/kg/日的膠原蛋白。約0.5％、0.8％、0.9％、1.0％的飲食是適合的(尤其對(duì)于犬)。適合的范圍還包括150mg/kg/日至250mg/kg/日的軟骨素。約0.1％、0.15％、0.16％、0.7％、0.2％的飲食是適合的(尤其對(duì)于犬)。如本發(fā)明的第一方面中定義的組合物的性質(zhì)為其在使用上是足夠熱穩(wěn)定的，并因此在制造食品時(shí)是理想的。組合物可以是以食品的形式。食品可以是干產(chǎn)品、半微濕產(chǎn)品或微濕產(chǎn)品。濕產(chǎn)品包括以罐頭或袋裝出售的食品，并且具有70％至90％的含水量。干食品包括具有相似組分的食品，但具有5％至15％的水分，并以小餅干-如磨成粗粒的食物呈現(xiàn)。半微濕產(chǎn)品具有的水分范圍為16％至69％。在任何產(chǎn)品中水分的量會(huì)影響可使用或所需的包裝類(lèi)型。食品可以通過(guò)將成分混合在一起并磨碎以制成可烹調(diào)的均勻的面團(tuán)來(lái)制造。產(chǎn)生干寵物食品的工藝通常通過(guò)烘焙和/或擠壓來(lái)完成。典型地將面團(tuán)供應(yīng)至稱(chēng)為膨脹器的機(jī)器中，該機(jī)器使用加壓蒸汽或熱水來(lái)對(duì)成分進(jìn)行烹調(diào)。在膨脹器內(nèi)部時(shí)，面團(tuán)處于超高壓和高溫下。然后推動(dòng)面團(tuán)使其通過(guò)模具(特定尺寸的洞)，然后使用刀切斷。通過(guò)使膨化面團(tuán)塊通過(guò)干燥器以排出所有剩余水分而將其制成磨成粗粒的食物。然后可以對(duì)磨成粗粒的食物噴涂脂肪、油、礦物質(zhì)和維生素，并可選地密封到包裝中。為了制造罐頭食品，首先對(duì)肉制品提取脂肪或加工，以將水、脂肪和蛋白質(zhì)組分分開(kāi)。然后將肉磨碎并烹調(diào)，然后與其它成分混合。將成品填充至罐頭中，保質(zhì)期為3至5年。對(duì)罐頭進(jìn)行真空包裝。組合物可以是以食品補(bǔ)充劑的形式。組合物可以以粉末或碎屑呈現(xiàn)，包括白色粉末或固體形式。粉末用于噴灑在動(dòng)物的主要食物上。其它形式包括固體小丸、顆粒、片劑或液體。優(yōu)選地，對(duì)食品進(jìn)行包裝。以這種方式，消費(fèi)者能夠從包裝確定食品中的成分，并確認(rèn)其適合所討論的特定寵物。包裝可以是金屬(通常以錫或撓性箔(flexifoil))、塑料、紙或卡。作為寵物食物產(chǎn)品形式的組合物可以包括寵物在其飲食中食用的任何產(chǎn)品。因此，本發(fā)明涵蓋標(biāo)準(zhǔn)食物產(chǎn)品，以及寵物食品小吃(例如點(diǎn)心棒、餅干和甜味食品)。食物產(chǎn)品優(yōu)選地是熟食。其可以包括肉或動(dòng)物來(lái)源的材料(諸如牛肉、雞肉、火雞肉、羔羊肉、魚(yú)、血漿、髓骨等，或它們的一種或多種)?？商鎿Q地，產(chǎn)品可以是不含肉的(優(yōu)選地包括肉替代品，諸如大豆、玉米麩質(zhì)或大豆產(chǎn)品)，以提供蛋白源。產(chǎn)品可以含有附加的蛋白源，諸如大豆蛋白濃縮物、乳蛋白、麩質(zhì)等。產(chǎn)品還可以含有淀粉源，諸如一種或多種谷物(例如，小麥、玉米、水稻、燕麥、大麥等)，或可以不含淀粉。產(chǎn)品可以包括纖維，諸如菊苣、甜菜漿等，和/或組分諸如菊粉、低聚果糖、益生菌，最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寵物食物產(chǎn)品的組合的成分提供用于所討論的特定動(dòng)物的所有建議的維生素和礦物質(zhì)(全面且均衡的食物)，例如在國(guó)家研究委員會(huì)，1985，犬的營(yíng)養(yǎng)需求，國(guó)家科學(xué)院出版社，華盛頓DC(NationalResearchCouncil,1985,NutritionalRequirementsfordogs,NationalAcademyPress,WashingtonDC)或美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)，官方出版物1996(AssociationofAmericaFeedControlOfficials,OfficialPublication1996)中所述的。食物產(chǎn)品可以根據(jù)本領(lǐng)域中的已知的任何方法來(lái)制備，例如在帕加馬牛津出版社出版的由ATBEdney編輯、A.Rainbird分章節(jié)的犬與貓的營(yíng)養(yǎng)叢書(shū)中第57-74頁(yè)中的標(biāo)題為“均衡的膳食”(WalthamBookofDogandCatNutrition,Ed.ATBEdney,ChapterbyA.Rainbird,entitled"ABalancedDiet"onpages57to74,PergamonPressOxford)中的方法。本發(fā)明的第一方面的組合物特別用于預(yù)防或治療動(dòng)物特別是貓或犬的關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎包括骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本發(fā)明的第一方面的組合物特別用于增長(zhǎng)動(dòng)物特別是貓或犬的預(yù)期壽命。增長(zhǎng)的預(yù)期壽命可以通過(guò)延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命來(lái)測(cè)定。組合物的其它作用包括保持生命力、健康、身體活力、生命質(zhì)量和延緩衰老的體征。身體活力包括具有能量且有活力的寵物。身體活力可以通過(guò)動(dòng)物整體能量水平、可動(dòng)性(mobility)、食欲和嬉鬧測(cè)定。本發(fā)明的第一方面的組合物特別用于在動(dòng)物特別是貓或犬中維持可動(dòng)性或預(yù)防可動(dòng)性降低。在動(dòng)物如寵物中，可動(dòng)性常常因?yàn)殛P(guān)節(jié)問(wèn)題而降低。關(guān)節(jié)問(wèn)題的一個(gè)原因是軟骨磨損的比身體可更換的要快。當(dāng)軟骨磨損，關(guān)節(jié)變得腫脹且疼痛，因此產(chǎn)生可動(dòng)性困難。在寵物中可動(dòng)性降低的體征包括生活方式和行為的改變，諸如跳躍或跑步/步行的能力或意愿降低、睡眠減少和上下樓梯困難。本發(fā)明的第一方面的組合物特別用于延緩動(dòng)物特別是貓或犬的衰老。衰老的體征可以包括能量普遍下降、移動(dòng)更緩慢、聽(tīng)力下降、視力減弱等。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種治療動(dòng)物特別是貓或犬的關(guān)節(jié)炎的方法，包括向所述動(dòng)物施用本發(fā)明第一方面中限定的組合物。關(guān)節(jié)炎包括骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。該方法可以是預(yù)防性的或治療性的。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種增長(zhǎng)動(dòng)物特別是貓或犬的預(yù)期壽命的方法，包括向所述動(dòng)物施用本發(fā)明第一方面中限定的組合物。增長(zhǎng)的預(yù)期壽命可以通過(guò)延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命來(lái)測(cè)定。組合物的其它作用包括保持生命力、健康、身體活力、生命質(zhì)量和延緩衰老的體征。身體活力包括具有能量且有活力的寵物。身體活力可以通過(guò)動(dòng)物整體能量水平、可動(dòng)性、食欲和嬉鬧測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種在動(dòng)物特別是貓或犬中保持可動(dòng)性或預(yù)防可動(dòng)性降低的方法，包括向所述動(dòng)物施用本發(fā)明第一方面中限定的組合物。在寵物中可動(dòng)性降低的體征包括生活方式和行為的改變，諸如跳躍或跑步/步行的能力或意愿降低、睡眠減少和上下樓梯困難。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種延緩動(dòng)物特別是貓或犬的衰老的方法，包括向所述動(dòng)物施用本發(fā)明第一方面中限定的組合物。衰老的體征可以包括能量普遍下降、移動(dòng)更緩慢、聽(tīng)力下降、視力減弱等。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面中限定的組合物的方法，包括在例如托特平底玻璃杯(totetumbler)中將成分混合在一起形成組合物，以產(chǎn)生粉末、小丸或糊劑，或如上所述的。產(chǎn)品可以以所有其它方式通過(guò)本領(lǐng)域已知的工藝生產(chǎn)。本發(fā)明第一方面中限定的組合物可以在對(duì)一種或多種其它成分加熱或烹調(diào)之前或之后加入。具體實(shí)施方式現(xiàn)在將參照以下非限定性實(shí)例描述本發(fā)明：非常感激來(lái)自骨關(guān)節(jié)和牙科組織工程實(shí)驗(yàn)室(LaboratoryforOsteoArticularandDentalTissueEngineering，LIOAD)的艾樂(lè)迪·樂(lè)·提利(ElodieleTilly)、勞倫特·貝克(LaurentBeck)和杰羅姆·吉詩(shī)(JeromeGuicheux)對(duì)于進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)提供的幫助。實(shí)施例1體內(nèi)動(dòng)物模型研究：進(jìn)行臨床前試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)含有軟骨素(chrondroitin)、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物對(duì)于小鼠的骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展的效果。使十八月齡C57BL/6雄性小鼠可以自由接近食物和水，并進(jìn)行12h/12h光/暗周期一周以適應(yīng)。在這種動(dòng)物模型中骨關(guān)節(jié)炎的患病率不是100％，因此測(cè)試了15只小鼠的組以獲得統(tǒng)計(jì)顯著性。研究了三個(gè)組：-15只用對(duì)照飲食喂養(yǎng)的6月齡小鼠的健康對(duì)照組。-15只用對(duì)照飲食喂養(yǎng)的18月齡小鼠的對(duì)照組。-15只用含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的混合物的飲食喂養(yǎng)的18月齡小鼠的測(cè)試組。為小鼠每日提供6g食物，其每日僅食用3g食物。每日加入飲食中的活性化合物的劑量為：-綠茶提取物：0.15％(146.5mg/kg體重/日)-水解膠原蛋白：0.5％(488.5mg/kg體重/日)-軟骨素：0.1％(97.5mg/kg體重/日)選擇小鼠作為模型是為了模擬犬的長(zhǎng)生命周期；小鼠的2個(gè)月相當(dāng)于犬的大約1年。為了將犬劑量轉(zhuǎn)換為小鼠劑量，使用來(lái)自美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)的以下方程式：小鼠的劑量(mg/Kg)＝犬的劑量(mg/Kg)x(犬體重(Kg)/小鼠體重(Kg))0.33對(duì)于該項(xiàng)研究，認(rèn)為犬體重為30Kg，小鼠體重為30g。評(píng)價(jià)：使用MX-20DC-12設(shè)備(飛科思創(chuàng)生物有限責(zé)任公司(FaxitronBioticsLLC)，圖森，亞利桑那州，USA)拍攝后肢的放射圖像(前后視圖和側(cè)視圖)，以評(píng)價(jià)小鼠關(guān)節(jié)中的結(jié)構(gòu)性損傷。通過(guò)腹膜內(nèi)注射75mg/Kg劑量的克他命(Ketamine)(克他命1000TM，維克(Virbac)，法國(guó))和5mg/Kg劑量的甲苯噻嗪(隆朋TM(RomunTM)，拜耳，法國(guó))的混合物。在研究開(kāi)始時(shí)以及直到自然死亡的每五周拍攝圖像。使用盲選程序，通過(guò)使用以下表1和表2列出的多項(xiàng)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)圖像中骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。表1放射學(xué)得分OA等級(jí)0-102-314-526-738-94表2使用CatWalkTM系統(tǒng)(諾達(dá)思(Noldus)信息技術(shù)公司，荷蘭)測(cè)定小鼠的步態(tài)，該系統(tǒng)利用光系統(tǒng)和高頻攝像機(jī)記錄了小鼠腳印。使用分析軟件CatWalkXTTM10，測(cè)定在骨關(guān)節(jié)炎中可能發(fā)生的小鼠步態(tài)的細(xì)微變化。步態(tài)分析在研究開(kāi)始時(shí)進(jìn)行，并且直到死亡的每五周進(jìn)行測(cè)定。使每個(gè)小鼠從通道的一側(cè)到另一側(cè)自由地步行。在爪與玻璃板每次接觸時(shí)，LE光通過(guò)玻璃地板向下反射，并通過(guò)照相機(jī)記錄。通過(guò)在實(shí)際步態(tài)分析前每日訓(xùn)練小鼠穿過(guò)通道7天來(lái)獲得可靠的記錄。結(jié)果：圖1示出在研究開(kāi)始時(shí)(18月齡小鼠)以及經(jīng)含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物處理或未經(jīng)處理的小鼠3個(gè)月后的關(guān)節(jié)炎的放射學(xué)得分(Radiologicalscoring)。含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物能夠預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。圖2示出使用CatWalkTM系統(tǒng)測(cè)定經(jīng)含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物處理或未經(jīng)處理的6月齡、9月齡、18月齡和21月齡的小鼠的可動(dòng)性。含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物能夠預(yù)防可動(dòng)性降低。圖3和圖4示出經(jīng)含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物處理或未經(jīng)處理的小鼠的死亡日期。含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物增加了小鼠的整體存活率。通常，隨著年齡的增長(zhǎng)，關(guān)節(jié)炎在關(guān)節(jié)中出現(xiàn)，這導(dǎo)致疼痛和可動(dòng)性減少。含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物延緩關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn)，預(yù)防可動(dòng)性降低并還延緩小鼠的自然死亡?；旌衔?cocktail)作用機(jī)制尚不清楚。我們假設(shè)綠茶多酚防止氧化而水解膠原蛋白，以及硫酸軟骨素防止軟骨分解代謝和/或增加軟骨合成。這是首次顯示含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物預(yù)防關(guān)節(jié)炎并延緩自然死亡。另一優(yōu)點(diǎn)是，組合物的成本相對(duì)低；實(shí)際上三種化合物比很多有效治療關(guān)節(jié)炎的已知化合物如姜黃素更便宜。另外，與本領(lǐng)域中已知的許多其他治療關(guān)節(jié)炎的化合物不同，這些化合物是熱穩(wěn)定的。本發(fā)明的預(yù)料不到的有益性是延長(zhǎng)動(dòng)物壽命的效果。實(shí)施例2體外研究：進(jìn)行體外研究，以評(píng)價(jià)含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的組合物對(duì)于兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(RAC)的效果。在含有5％CO2氣氛的37℃保溫箱中在補(bǔ)充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(Gibco，生命科技公司，瑞士)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中培養(yǎng)RAC。將RAC在96孔板中鋪板(105個(gè)細(xì)胞/cm2)。用含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物的每一種化合物或所有三種化合物的混合物的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，持續(xù)24小時(shí)，之后用IL-1β(10ng/ml)(默克密理博(MerckMillipore)，USA)刺激。IL-1β是與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原相關(guān)的促炎細(xì)胞因子。然后將RAC溫育24小時(shí)，之后測(cè)定作為關(guān)節(jié)炎標(biāo)記物的一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生量。在6孔板中對(duì)RAC鋪板(3x105個(gè)細(xì)胞/cm2)。用含有軟骨素、水解膠原蛋白和綠茶提取物每一種化合物或所有三種化合物的混合物的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，持續(xù)24小時(shí)，之后用IL-1β(10ng/ml)(默克密理博(MerckMillipore)，USA)刺激。然后將RAC溫育48小時(shí)，之后測(cè)定作為關(guān)節(jié)炎標(biāo)記物的環(huán)氧化酶-2(cyclooxgenase-2，COX-2)、可誘導(dǎo)的同工型一氧化氮合成酶(inducibleisoformNitricoxideSynthase，iNoS)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MatrixMetallopeptidase-13，MMP13)的RNA表達(dá)。評(píng)價(jià)：根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)使用MTS試驗(yàn)(CellTiter96TMMTS，普洛麥格，法國(guó))測(cè)定細(xì)胞存活率。還通過(guò)使用馬氏細(xì)胞(Malassezcell)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并使用臺(tái)盼藍(lán)排斥染色技術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率，其將死細(xì)胞著色為藍(lán)色。遵照制造商的方案使用開(kāi)曼化學(xué)品(CaymanChemicals)(貝爾坦醫(yī)藥公司(BertinPharma)，法國(guó))測(cè)定NO和PGE2的產(chǎn)生量。使用用亞硝酸鈉制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)格里斯反應(yīng)測(cè)定培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽的累積，由此通過(guò)分光光度法估算NO的產(chǎn)生量。使用高靈敏度的特定酶免疫測(cè)定試劑盒來(lái)估算PGE2。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，通過(guò)使用NucleoSpinTMRNAII試劑盒(馬克雷-納格爾(Macherey-Nagel)，赫爾德(Hoerdt)，法國(guó))提取RNA，來(lái)進(jìn)行RNA的提取。用SupersScriptIII(生命技術(shù)公司)對(duì)RNA反轉(zhuǎn)錄，并用SYBRSelectmix(生命技術(shù)公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。使用引物序列COX-2、iNoS和MMP13對(duì)相對(duì)RNA表達(dá)定量。使用用于GAPDH的引物序列作為參照基因。表3列出了實(shí)施例2中使用的引物序列。表3來(lái)自實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于下面的表4中。表4分別用不同化合物或混合在一起溫育兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(RAC)，以評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性。MTS測(cè)定和臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)試二者在用貫穿大范圍濃度(數(shù)據(jù)未示出)的綠茶提取物、軟骨素或水解膠原蛋白進(jìn)行24小時(shí)和48小時(shí)溫育后都不顯示任何細(xì)胞毒性。用綠茶提取物以及用綠茶提取物、軟骨素和水解膠原蛋白的混合物預(yù)處理導(dǎo)致顯著且劑量依賴(lài)性地抑制NO和PGE2的產(chǎn)生(表4)(P<0.05)。水解膠原蛋白降低不同基因的表達(dá)，而僅軟骨素似乎沒(méi)有作用。另一方面，綠茶提取物以及綠茶提取物、軟骨素和水解膠原蛋白的混合物抑制COX2和MMP13的表達(dá)，但對(duì)iNos的表達(dá)沒(méi)有作用(表4)。綠茶提取物、軟骨素和水解膠原蛋白的混合物逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)炎性細(xì)胞因子和分解代謝酶諸如NO、PGE2和MMP13的作用，由此示出其對(duì)疾病的體外模型的抗炎和抗分解代謝的性質(zhì)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3