本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防炎性疾病。具體地講，本發(fā)明涉及含氧脂酰甘油酯的用途以及利用含氧脂酰甘油酯進(jìn)行這種治療的方法。本發(fā)明還涉及根據(jù)受試者樣品中含氧脂酰甘油酯的含量確定受試者發(fā)展炎性疾病的風(fēng)險的方法。

背景技術(shù)：

炎癥是組織對有害刺激如病原體、受損細(xì)胞和/或刺激物的復(fù)雜生物學(xué)應(yīng)答，并且通常是生物體清除有害刺激并引發(fā)組織愈合過程的保護(hù)性嘗試。但是，不論個體的年齡如何，未得到恰當(dāng)調(diào)控的炎癥都可能導(dǎo)致多種疾病。

衰老通常與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)，例如伴隨體液免疫功能紊亂加劇的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的顯著下降(例如，對疫苗的低應(yīng)答)。此外，衰老常常與輕度炎癥狀態(tài)有關(guān)。特別是，很多老年受試者處于會有助于發(fā)病和死亡的感染性和非感染性疾病的高風(fēng)險狀態(tài)。

不期望的炎癥可通過正確藥物治療。但是，藥物可能導(dǎo)致不期望的副作用并通常需要醫(yī)療人員的監(jiān)督。

2型糖尿病(tiid)是最常見的糖尿病形式，其特征為慢性高血糖、胰島素抗性以及正常情況下會響應(yīng)餐后高血糖而分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞的相對功能紊亂。tiid與遺傳、環(huán)境和行為方面的風(fēng)險因素有關(guān)。

患有tiid的人群更容易出現(xiàn)各種形式的短期和長期并發(fā)癥。短期并發(fā)癥包括低血糖性糖尿病酮癥酸中毒(dka)和高血糖高滲狀態(tài)(hhs)。長期并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜病變、心臟病、腎病和神經(jīng)病變。這類并發(fā)癥可能導(dǎo)致過早死亡。

由于這種疾病患病率高、發(fā)病不明顯因而確診較晚，在患有tiid的患者身上觀察到發(fā)病率和死亡率有上升的趨勢。據(jù)估計(jì)，2011年tiid的全球發(fā)病率是3.66億人，到2030年這一數(shù)字將升至5.52億人(globalburdenofdiabetes.internationaldiabetesfederation.diabeticatlasfifthedition2011,brussels(《全球糖尿病負(fù)擔(dān)現(xiàn)狀》。國際糖尿病聯(lián)合會。2011年糖尿病阿特拉斯第5版，布魯塞爾)。見：http://www.idf.org/diabetesatlas.(2011年12月18日訪問))。

已知有多種生活方式因素與患上tiid有關(guān)。這些因素包括身體活動不足、久坐不動的生活方式、吸煙及飲酒。具體地講，已發(fā)現(xiàn)肥胖促成了大約55％的tiid病例(morbidityandmortalityweeklyreport；53(45):1066-1068(《發(fā)病率和死亡率周報》；第53卷第45期，第1066-1068頁))，同樣還存在很強(qiáng)的遺傳聯(lián)系。但是，已經(jīng)認(rèn)識到并非所有肥胖個體都會患上tiid。

tiid的特征為胰島素抗性導(dǎo)致的胰島素不敏感、胰島素產(chǎn)量下降以及最終胰腺β細(xì)胞衰竭。這會導(dǎo)致運(yùn)送到肝臟、肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中的葡萄糖減少。由于這種功能紊亂，空腹期間升高的胰高血糖素和肝葡萄糖水平無法通過進(jìn)餐抑制。在胰島素水平不足和胰島素抗性增大的情況下，導(dǎo)致高血糖。tiid的一個重要特征是胰腺β細(xì)胞變得功能紊亂，無法感測營養(yǎng)物質(zhì)以及營養(yǎng)因子，因此尤其無法響應(yīng)特異性地通過增加β細(xì)胞群和胰島素分泌水平來起作用的療法。

針對tiid的現(xiàn)有療法包括每日注射胰高血糖素樣肽1(glp1)受體激動劑以防止β細(xì)胞損失并刺激胰島素分泌。但是，使用glp1存在出現(xiàn)胰腺和心血管并發(fā)癥的風(fēng)險。更多傳統(tǒng)口服藥物如磺酰脲會使患者易于患上危及生命的低血糖。另外，目前尚缺少針對前驅(qū)糖尿病或高風(fēng)險個體的預(yù)防性療法，并且不存在用于鑒別tiid高風(fēng)險個體的方法。

因此需要可用于治療和/或預(yù)防炎癥病癥和障礙的替代化合物和組合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于測定與炎性疾病相關(guān)的含氧脂酰甘油酯水平。另外，本發(fā)明已表明，含氧脂酰甘油酯可影響細(xì)胞中直接與這類炎性疾病相關(guān)的生理應(yīng)答。

在第一方面，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防受試者的炎性疾病的含氧脂酰甘油酯。

含氧脂酰甘油酯可以是含氧花生四烯酸甘油酯。含氧脂酰甘油酯可以是前列腺素甘油酯。含氧脂酰甘油酯可以是前列四烯酸甘油酯。

前列四烯酸甘油酯可選自：11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯；9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-1-甘油酯；11-氧代-5z,9,12e,4e-前列四烯酸-2-甘油酯；11-氧代-15s-羥基-5z,9z,13e-前列三烯酸-1-甘油酯；以及9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-2-甘油酯。

前列四烯酸甘油酯可以是11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯、9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列腺二烯酸-1-甘油酯或者11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-2-甘油酯。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種或多種如本發(fā)明的第一方面所限定的含氧脂酰甘油酯，用于治療和/或預(yù)防受試者的炎性疾病。

該炎性疾病可選自：ii型糖尿病、胰島素抗性、肥胖癥和代謝疾病。

根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的含氧脂酰甘油酯或組合物可用于預(yù)防或延緩肥胖受試者ii型糖尿病的發(fā)病。

根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的含氧脂酰甘油酯或組合物可用于調(diào)節(jié)受試者的胰島素分泌。

含氧脂酰甘油酯可作用于選自下列的細(xì)胞：胰腺細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。

該細(xì)胞可以是胰腺β細(xì)胞。含氧脂酰甘油酯可升高由胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素的水平。含氧脂酰甘油酯可防止或減少胰腺β細(xì)胞的凋亡。

該細(xì)胞可以是內(nèi)分泌l細(xì)胞。

該細(xì)胞可以是星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元。

含氧脂酰甘油酯可減輕肝臟和/或脂肪組織的炎癥。

在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)或增加至少一種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯在體內(nèi)產(chǎn)生的方法。

可以升高肝細(xì)胞、白色脂肪組織或胰腺β細(xì)胞中含氧脂酰甘油酯的水平。

這種方法可包括下列步驟：

(a)將選自花生四烯酰甘油(ag)、二酰基甘油(1,2-dag)和/或三?；视?tag)的前體施用于受試者。

(b)誘導(dǎo)或增加選自下列的酶在受試者中的表達(dá)或活性：磷脂酶c(plc)、二?；视椭久?dagl)、磷脂酶a2(pla2)、n-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(nat)、n-酰基磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶d(nate-pld)、環(huán)氧合酶-2(cox-2)、前列腺素f合酶(pgfs)、前列腺素e合酶(前列腺素甘油酯s)、前列腺素i合酶(pgis)、前列腺素d合酶(pgds)和/或血栓素a(2)合酶(txas)。

在第四方面，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防受試者炎性疾病的方法，該方法包括向受試者施用如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯或者通過根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法誘導(dǎo)或增加至少一種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯在體內(nèi)產(chǎn)生的步驟。

該炎性疾病可選自：ii型糖尿病、胰島素抗性、肥胖癥和代謝疾病。

該炎性疾病可以是ii型糖尿病。

根據(jù)本發(fā)明第四方面的方法可用于預(yù)防或延緩肥胖受試者中ii型糖尿病的發(fā)病。

這種方法可用于調(diào)節(jié)受試者中胰島素的分泌。

在第五方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒別有發(fā)展炎性疾病風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括：

(a)確定受試者樣品中至少一種含氧脂酰甘油酯的水平；

(b)將樣品中含氧脂酰甘油酯的水平與參考值進(jìn)行比較；

其中與參考水平相比樣品中含氧脂酰甘油酯的水平較低指示具有發(fā)展炎性疾病的風(fēng)險。

用于鑒別有患上炎性疾病風(fēng)險的受試者的方法完成之后可能施加膳食干預(yù)來增加含氧脂酰甘油酯。

含氧脂酰甘油酯可以是含氧花生四烯酸甘油酯。含氧脂酰甘油酯可以是前列腺素甘油酯。含氧脂酰甘油酯可以是前列四烯酸甘油酯。

前列四烯酸甘油酯可選自：

11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯；

9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-1-甘油酯；

11-氧代-5z,9,12e,4e-前列四烯酸-2-甘油酯；

11-氧代-15s-羥基-5z,9z,13e-前列三烯酸-1-甘油酯；或者

9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-2-甘油酯。

樣品可以是血清、血漿、尿液或脂肪組織活檢樣品。

該炎性疾病可選自：ii型糖尿病、胰島素抗性、肥胖癥和代謝疾病。

在一個實(shí)施方案中，受試者肥胖，并且將該方法用于預(yù)測受試者發(fā)展ii型糖尿病的可能性。

在第六方面，本發(fā)明提供了一種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯，用于

i)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)；或者

ii)保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡。

附圖說明

圖1：從活化wat(白色脂肪組織)中分離的生物活性脂質(zhì)級分的乙醇儲備液和各種稀釋液的濃度。生物活性脂質(zhì)對葡萄糖刺激的胰島素分泌的協(xié)同效應(yīng)。將min6細(xì)胞在2mm葡萄糖中饑餓2小時之后，用20mm葡萄糖連同脂質(zhì)級分(1:50稀釋液)或溶媒(乙醇2％)刺激30分鐘。各生物活性脂質(zhì)級分的濃度如下。通過elisa測量分泌的胰島素。

圖2—生物活性脂質(zhì)級分劑量響應(yīng)和胰腺β細(xì)胞存活率。將min6細(xì)胞(70-80％融合度)用完全dmem培養(yǎng)基中的分離生物活性脂質(zhì)的各種稀釋液(1:1000至1:20稀釋液)(第二個顏色較淺方框)或用相應(yīng)乙醇稀釋液即溶媒對照(第一個顏色較深方框)處理48小時。用胰蛋白酶處理貼附的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。各種稀釋液的濃度示于圖1中。

圖3—生物活性脂質(zhì)對β細(xì)胞功能的長期效應(yīng)。(a)用接近生理范圍的濃度的生物活性脂質(zhì)(1:1000稀釋液)處理min6細(xì)胞72小時。在處理結(jié)束時，通過測量gsis評估β細(xì)胞功能。(b)在健康捐獻(xiàn)者的原代人胰島中測試生物活性級分3和5，持續(xù)72小時。生物活性脂質(zhì)級分5通過使人胰島β細(xì)胞響應(yīng)于葡萄糖刺激而分泌胰島素的能力加倍而實(shí)質(zhì)改善了β細(xì)胞功能。

圖4—生物活性脂質(zhì)急劇增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌(gsis)。在饑餓條件(2mm葡萄糖)下或在用20mm葡萄糖或20mm葡萄糖加上按1:100稀釋的生物活性脂質(zhì)刺激15分鐘之后，測量min6細(xì)胞中的胰島素分泌。通過elisa測量胰島素分泌。

圖5—將生物活性脂質(zhì)級分5進(jìn)一步分成5種亞級分(5-、5.1、5.2、5.3和5.4)在執(zhí)行g(shù)sis之前，用按1:1000稀釋的富集生物活性脂質(zhì)亞級分處理min6細(xì)胞72小時。

圖6—在存在或不存在生物活性脂質(zhì)級分(1:100稀釋液)的情況下，用炎性細(xì)胞因子混合物(50u/mlil1β、100u/mltnfα和100u/mlinfγ)處理β細(xì)胞48小時。在處理之后，通過蛋白質(zhì)印跡(a)評估nfkb信號通路(ikka/b磷酸化)和凋亡(裂解的半胱天冬酶3)，還使用caspaseglo試劑盒(普洛麥格公司(promega))測量細(xì)胞提取物(b)中的半胱天冬酶8活性。

圖7—用生物活性脂質(zhì)級分處理從wtwistar大鼠或從gatakakizaki(gk)大鼠中分離的胰島細(xì)胞，持續(xù)72小時。為了測量β細(xì)胞功能，然后用營養(yǎng)物質(zhì)混合物(20mm葡萄糖、1×氨基酸和0.1μmex-4)刺激胰島細(xì)胞1小時，并通過elisa評估胰島素分泌。

圖8—在存在或不存在生物活性脂質(zhì)級分的情況下，用低濃度(2mm)和高濃度(20mm)葡萄糖測試腸內(nèi)分泌l細(xì)胞系(nci-h716)的急性刺激。通過測量glp1分泌評估這種效應(yīng)。

圖9—通過在評估葡萄糖刺激后的glp1分泌之前，通過用生物活性脂質(zhì)預(yù)處理nci-h716細(xì)胞系72小時來確定生物活性脂質(zhì)對腸內(nèi)分泌l細(xì)胞功能的長期效應(yīng)。

圖10—在用生物活性脂質(zhì)級分處理72小時之后min6細(xì)胞中細(xì)胞應(yīng)激基因的調(diào)節(jié)。

圖11—用于鑒定生物活性脂質(zhì)的工作流程。

圖12—分離的級分5.4與合成的純級分5.4和5.3的功能效應(yīng)對比。用生物活性脂質(zhì)急性(1小時)和慢性(72小時)處理之后評估胰島素分泌。(a)人胰島細(xì)胞。(b)原代年輕大鼠胰島細(xì)胞。(c)ins1ep81和insep96。

圖13—使用生物活性脂質(zhì)的情況下葡萄糖刺激的胰島素分泌

從級分5.3中鑒定出的生物活性脂質(zhì)前列腺素d2甘油酯(pgd2g)在以50pm處理72小時之后，增加了小鼠胰島(a)或ins1e細(xì)胞(b)中的胰島素分泌。在pgd2g處理后，在krb溶液中在低濃度葡萄糖(2mm)和高濃度葡萄糖(20mm)條件下測量葡萄糖刺激的胰島素釋放量。胰島素釋放量表示為從ins1e細(xì)胞和小鼠胰島中的胰島素總含量中釋放的量。

圖14—用總蛋白質(zhì)含量歸一化的使用生物活性脂質(zhì)的情況下的胰島素分泌在用葡萄糖刺激之后從級分5.3中鑒定出的前列腺素d2甘油酯(pgd2g)急劇刺激胰島素分泌。在存在各種濃度的生物活性脂質(zhì)(470pm、2.3nm、230nm)的情況下，在低濃度葡萄糖(2mm)和高濃度葡萄糖(20mm)中測量葡萄糖刺激的胰島素釋放量。尤其是2.5nm至250nm濃度的生物活性脂質(zhì)提高了葡萄糖刺激的胰島素釋放量。結(jié)果表示為用總蛋白質(zhì)含量歸一化的胰島素釋放量。

圖15—使用生物活性脂質(zhì)的情況下人胰島中β細(xì)胞功能和腸促胰島素響應(yīng)的改善。

50pm從級分5.3鑒定出的生物活性脂質(zhì)前列腺素d2甘油酯(pgd2g)改善了來自捐獻(xiàn)者的人胰島中的β細(xì)胞功能和腸促胰島素響應(yīng)：處理72小時之后的(a)瘦2型糖尿病患者和(b)肥胖非糖尿病患者。在低濃度葡萄糖(2mm)、高濃度葡萄糖(20mm)和高濃度葡萄糖(20mm)+0.1μmexendin4中測量葡萄糖刺激的胰島素釋放量。

圖16—細(xì)胞因子誘導(dǎo)的功能紊亂之后葡萄糖刺激的胰島素釋放的改善

從級分5.3pgd2g中鑒定出的生物活性脂質(zhì)前列腺素d2甘油酯(pgd2g)保護(hù)人胰島不發(fā)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)的功能紊亂。用50pm的生物活性脂質(zhì)處理來自(a)瘦非糖尿病捐獻(xiàn)者、(b)瘦2型糖尿病捐獻(xiàn)者和(c)肥胖2型糖尿病捐獻(xiàn)者的人胰島72小時。在最后48小時期間，添加細(xì)胞因子混合物(il1β10ng/ml、tnfα25ng/ml和infγ10ng/ml)。在低濃度葡萄糖(2mm)和高濃度葡萄糖(20mm)條件下測量葡萄糖刺激的胰島素釋放量。在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的功能紊亂之后生物活性脂質(zhì)能夠提高葡萄糖刺激的胰島素釋放量。

圖17—生物活性脂質(zhì)增加glp-1分泌

從級分5.3鑒定出的生物活性脂質(zhì)前列腺素d2甘油酯(pgd2g)增加了glp1分泌。在從0.23nm至2.3nm各種濃度的生物活性脂質(zhì)的存在下使用人h716細(xì)胞進(jìn)行g(shù)lp-1分泌測定。前列腺素d2甘油酯顯著改善了h716細(xì)胞中g(shù)lp1的分泌(表示為用總蛋白質(zhì)含量歸一化的glp1釋放量)。

圖18—從級分5.4鑒定出的生物活性脂質(zhì)15-脫氧-δ12,14-pgj2-2-g以及從級分5.3鑒定出的前列腺素d2甘油酯(pgd2g)增加了胰島素分泌

在低濃度葡萄糖(2mm)和高濃度葡萄糖(20mm)條件下使用來自瘦非糖尿病捐獻(xiàn)者的人胰島進(jìn)行胰島素分泌測定。在存在和不存在白色脂肪組織(wat)級分(1/100稀釋液)的情況下從級分5.4(250pm)鑒定出的生物活性脂質(zhì)15-脫氧-δ12,14-pgj2-2-g增加了胰島素分泌。與對照組織相比，從級分5.3鑒定出的生物活性脂質(zhì)前列腺素d2甘油酯(pgd2g)也增加了胰島素分泌。

兩種生物活性脂質(zhì)均急劇地改善了葡萄糖刺激的胰島素釋放。結(jié)果以每10個胰島所分泌胰島素ng示出。

具體實(shí)施方式

在一個方面，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防受試者的炎性疾病的含氧脂酰甘油酯。

含氧脂酰甘油酯

在本文中含氧脂酰甘油酯也可被稱為―生物活性脂質(zhì)”。

含氧脂酰甘油酯是指包含通過酯鍵鍵合到至少一個含氧脂肪酸部分或其衍生物上的甘油的生物活性脂質(zhì)。含氧脂酰甘油酯可包含通過酯鍵鍵合到甘油部分任何碳上的一個、兩個或三個含氧脂肪酸部分或其衍生物。

例如，含氧脂酰甘油酯可具有下列結(jié)構(gòu)：

其中x1、x2和x3中的至少一者是通過酯鍵鍵合到碳上的含氧脂肪酸。

‘脂肪酸部分’是指具有長脂族尾鏈的羧酸。脂肪酸部分可包含4至28個碳原子。脂肪酸部分可以是飽和或不飽和的。短鏈脂肪酸具有不到六個碳，中鏈脂肪酸具有6-12個碳，長鏈脂肪酸具有13至21個碳，并且極長鏈脂肪酸具有大于22個碳。

脂肪酸可以是長鏈脂肪酸或極長鏈脂肪酸。

脂肪酸的示例包括但不限于花生四烯酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、順式-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸和二十碳五烯酸

‘含氧’意指脂肪酸部分在脂肪酸鏈內(nèi)包含至少一個含氧官能團(tuán)。也就是說，除將其連接至甘油部分的酯基團(tuán)之外，它還包含至少一個含氧官能團(tuán)。

含氧官能團(tuán)可以是例如羥基、環(huán)氧基、甲氧基或氧代官能團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，含氧官能團(tuán)是羥基。

‘其衍生物’是指可由含氧脂肪酸分子形成的任何分子。例如，其衍生物可指含氧花生四烯酸、前列腺素或前列四烯酸部分。

含氧花生四烯酸甘油酯

含氧花生四烯酸甘油酯是指其中至少一個含氧花生四烯酸部分通過酯鍵連接到甘油部分的甘油酯。

含氧花生四烯酸甘油酯可包括通過酯鍵連接到甘油部分的一個、兩個或三個花生四烯酸基團(tuán)。含氧花生四烯酸甘油酯可包括通過酯鍵連接到甘油部分的單個花生四烯酸基團(tuán)。單個花生四烯酸基團(tuán)可通過酯鍵連接到甘油部分的c1、c2或c3上。

前列腺素甘油酯

前列腺素甘油酯是指其中至少一個前列腺素部分通過酯鍵連接到甘油部分的甘油酯。

前列腺素甘油酯主要是通過經(jīng)由環(huán)氧合酶氧化2-花生四烯酰甘油而生成的，在合成特定的前列腺素甘油的過程中還涉及其他特異性酶如前列腺素d/e合酶。前列腺素通過酶促方法衍生自脂肪酰并含有20個碳原子(包括5碳環(huán))。

前列腺素的示例包括但不限于前列腺素a2(pga2)、pgb2、pgc2、pgd2、pge2(pge2)、pgf2α和pgg2。

前列腺素甘油酯可包含通過酯鍵連接到甘油部分的一個、兩個或三個前列腺素部分。前列腺素甘油酯可包含通過酯鍵連接到甘油部分的單個前列腺素基團(tuán)。單個前列腺素基團(tuán)可通過酯鍵連接到甘油部分的c1、c2或c3上。

前列四烯酸甘油酯

前列四烯酸甘油酯是指其中至少一個前列四烯酸部分通過酯鍵連接到甘油部分的甘油酯。

前列四烯酸甘油酯主要是通過經(jīng)由環(huán)氧合酶氧化2-花生四烯酰甘油而生成的。

根據(jù)本發(fā)明使用的前列四烯酸甘油酯選自：11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯；9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-1-甘油酯；11-氧代-5z,9,12e,4e-前列四烯酸-2-甘油酯；11-氧代-15s-羥基-5z,9z,13e-前列三烯酸-1-甘油酯；以及9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-2-甘油酯。

前列四烯酸甘油酯可以是11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯、9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列腺二烯酸-1-甘油酯或者11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-2-甘油酯。

組合物

在一個方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含一種或多種如本文所述的含氧脂酰甘油酯。

這種組合物可包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種含氧脂酰甘油酯。

這種組合物可包含一種或多種選自下列的前列四烯酸甘油酯：11-氧代-5z,9,12e,14e-前列四烯酸-1-甘油酯；9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-1-甘油酯；11-氧代-5z,9,12e,4e-前列四烯酸-2-甘油酯；11-氧代-15s-羥基-5z,9z,13e-前列三烯酸-1-甘油酯；以及9,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸-2-甘油酯。

藥物組合物

根據(jù)本發(fā)明使用的含氧脂酰甘油酯或組合物可作為藥物組合物提供。

該藥物組合物可包含一種或多種如本文所限定的含氧脂酰甘油酯以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑。可參照預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可包括以下物質(zhì)作為載體、賦形劑或稀釋劑或除了載體、賦形劑或稀釋劑之外還包括以下物質(zhì)：任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑和其他載體劑。

施用

可采用任何使活性成分生物可利用的途徑完成含氧脂酰甘油酯的施用。例如，可通過口服或經(jīng)由局部遞送例如通過導(dǎo)管或支架的腸胃外給藥途徑(腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、肌內(nèi)注射)施用含氧脂酰甘油酯。

治療和/或預(yù)防

本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防受試者的炎性疾病的含氧脂酰甘油酯。

預(yù)防炎性疾病的用途涉及含氧脂酰甘油酯的預(yù)防性用途。在本文中可將含氧脂酰甘油酯施用于尚未感染炎性疾病和/或未出現(xiàn)該疾病的任何癥狀的受試者，以預(yù)防或削弱該疾病的起因或者以降低或防止至少一種與該疾病相關(guān)的癥狀的發(fā)展。所述受試者可能具有發(fā)展炎性疾病的傾向，或者認(rèn)為所述患者有發(fā)展炎性疾病的風(fēng)險。

治療炎性疾病的用途涉及含氧脂酰甘油酯的治療性用途。在本文中，可將含氧脂酰甘油酯施用于患有現(xiàn)有疾病或病癥的受試者，以便減少、減輕或改善與該疾病相關(guān)的至少一種癥狀和/或減慢、減緩或阻斷炎性疾病的進(jìn)展。

受試者

受試者可以是人或動物受試者。受試者可以是哺乳動物受試者。在一個實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，優(yōu)選人。或者，受試者可以是非人哺乳動物，包括例如馬、牛、綿羊或豬。在一個實(shí)施方案中，受試者是伴侶動物，諸如狗或貓。

受試者可患有如本文所述的炎性疾病?！加醒仔约膊　侵甘茉囌呔哂兄辽僖环N與病癥相關(guān)的癥狀。

受試者可具有患上如本文所述的炎性疾病的風(fēng)險中?！哂谢忌涎仔约膊〉娘L(fēng)險中’是指受試者尚未感染炎性疾病和/或未出現(xiàn)該疾病的任何癥狀。所述受試者可能具有發(fā)展炎性疾病的傾向，或者認(rèn)為所述患者有發(fā)展炎性疾病的風(fēng)險。

炎性疾病

在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的含氧脂酰甘油酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的典型炎性疾病包括但不限于心血管疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎、自體免疫相關(guān)的病癥、肥胖癥、代謝疾病、胰島素抗性和ii型糖尿病在內(nèi)的疾病。

炎癥是組織對有害刺激如病原體、受損細(xì)胞和/或刺激物的復(fù)雜生物學(xué)應(yīng)答，并且通常是生物體清除有害刺激并引發(fā)組織愈合過程的保護(hù)性嘗試。但是，不論個體的年齡如何，未得到恰當(dāng)調(diào)控的炎癥都可能導(dǎo)致多種疾病。

炎性疾病可能與衰老有關(guān)。

衰老通常與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)，例如伴隨體液免疫功能紊亂加劇的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的顯著下降(例如，對疫苗的低應(yīng)答)。此外，衰老常常與輕度炎癥狀態(tài)有關(guān)。特別是，很多老年受試者處于會有助于發(fā)病和死亡的感染性和非感染性疾病的高風(fēng)險狀態(tài)。

肥胖癥

肥胖癥是由白色脂肪組織(wat)的過量積聚引起的。它與嚴(yán)重的代謝障礙相關(guān)(代謝綜合征，ms)并代表富裕社會中保健系統(tǒng)的重大問題之一。

―身體質(zhì)量指數(shù)”或―bmi”是指體重(千克)除以身高(米)的平方所得的比值?！俺亍北欢x為成人的bmi介于25和30之間?！胺逝职Y”是指儲存在動物(尤其是人和其他哺乳動物)脂肪組織中的天然能量儲備增至與某些健康狀況或死亡率上升有關(guān)的程度的一種病癥?！胺逝帧北欢x為成人的bmi大于30。

wat產(chǎn)生多個信號(包括細(xì)胞因子、激素、生長因子、補(bǔ)體因子和基質(zhì)蛋白)，這些信號不僅影響相鄰細(xì)胞而且還靶向其他周緣組織以及大腦。全身炎性反應(yīng)過程(包括先天免疫系統(tǒng)的激活)是由脂肪組織擴(kuò)張和缺氧觸發(fā)的。

因此肥胖癥與wat的慢性輕度炎癥相關(guān)，該炎癥繼而可影響脂肪細(xì)胞的代謝。這種慢性炎癥與各種炎性標(biāo)記物(包括但不限于il-6、il-8、il-18、tnf-α和c反應(yīng)性蛋白)相關(guān)。

與肥胖癥相關(guān)的慢性輕度炎癥是肥胖癥誘導(dǎo)的胰島素抗性的重要起因，并且是發(fā)展2型糖尿病(tiid)的風(fēng)險因素。雖然肥胖是tiid的主要風(fēng)險因素之一，但并非所有肥胖受試者都會患有糖尿病。同樣認(rèn)為與肥胖癥相關(guān)的慢性輕度炎癥是肥胖癥誘導(dǎo)的胰島素抗性的重要起因。

因此受試者可能是有發(fā)展胰島素抗性和/或tiid風(fēng)險的肥胖受試者。

胰島素抗性

可將胰島素抗性定義為靶細(xì)胞或整個生物體對其所暴露的胰島素濃度的響應(yīng)性減弱。這一定義通常用來指對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖處置的敏感性受損。

胰島素是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量供應(yīng)和常量營養(yǎng)物平衡、引導(dǎo)進(jìn)食狀態(tài)下合成代謝過程的樞轉(zhuǎn)激素。它是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖運(yùn)送到胰島素依賴性組織如肌肉和脂肪組織所必需的。在生理學(xué)方面，在整個機(jī)體水平上，胰島素的作用受其他激素相互作用的影響。胰島素雖然是驅(qū)動進(jìn)食狀態(tài)下的代謝過程的主要激素，但胰島素與生長因素和胰島素樣生長因子1(igf-1)協(xié)同作用；生長激素響應(yīng)于胰島素以及其他刺激而分泌，從而預(yù)防胰島素誘導(dǎo)的低血糖。其他反調(diào)節(jié)激素包括高血糖素、糖皮質(zhì)素和兒茶酚胺。這些激素驅(qū)動空腹?fàn)顟B(tài)下的代謝過程。

胰島素抗性可通過胰島素信號傳導(dǎo)中受體后缺陷在細(xì)胞水平出現(xiàn)?？赡艿臋C(jī)制包括胰島素受體irs蛋白或pip-3激酶的酪氨酸磷酸化的下調(diào)、不足或遺傳多態(tài)性，或者可涉及glut4功能異常(wheatcroftetal；diabetmed.2003；20:255–68(wheatcroft等人；《糖尿病藥物》，2003年；第20卷：第255-268頁))

胰島素抗性與身體質(zhì)量指數(shù)、腰圍以及尤其腰臀比增大相關(guān)。這些反映了積脂增多，尤其內(nèi)臟脂肪組織水平升高。內(nèi)臟脂肪組織是指腸周圍的腹內(nèi)脂肪，并與肝臟脂肪相關(guān)。內(nèi)臟脂肪組織具有不同于皮下脂肪的代謝特征。相比于游離脂酰的周轉(zhuǎn)，它具有更強(qiáng)的代謝活性；游離脂肪酰增大的通量有利于細(xì)胞水平上的胰島素抗性并促使肝vldl產(chǎn)生。

脂肪組織產(chǎn)生與胰島素抗性相關(guān)的多個細(xì)胞因子，包括具有促炎活性的那些，如tnfα、白介素和pai-1。

據(jù)信肥胖癥中存在的胰島素抗性主要涉及肌肉和肝臟，其中增加的源自脂肪細(xì)胞的游離脂肪酰促進(jìn)甘油三酯在這些組織中積聚。這種情況更可能在脂肪細(xì)胞具有胰島素抗性的情況下出現(xiàn)。內(nèi)臟脂肪組織中的游離脂肪酰通量更大，因此更可能出現(xiàn)在具有基因調(diào)控的脂肪細(xì)胞胰島素抗性的那些個體中。雖然積脂增多的效應(yīng)存在個體差異，但體重增長可惡化而體重減輕可改善那些有如此傾向的個體中的胰島素抗性。

因此胰島素抗性可能是肥胖癥誘導(dǎo)的胰島素抗性。

受試者可能是有發(fā)展tiid風(fēng)險的胰島素抗性受試者。

ii型糖尿病(tiid)

tiid是一種全球發(fā)病率日益增加的慢性代謝障礙。由于老齡人口增加，在世界上一些國家中受影響的人口數(shù)目預(yù)期在未來十年會加倍。

tiid的特征為胰島素抗性導(dǎo)致的胰島素不敏感、胰島素產(chǎn)量下降以及最終胰腺β細(xì)胞衰竭。這會導(dǎo)致運(yùn)送到肝臟、肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中的葡萄糖減少。與高血糖相關(guān)的脂肪分解增強(qiáng)。

由于這種功能紊亂，空腹期間升高的胰高血糖素和肝葡萄糖水平無法通過進(jìn)餐抑制。在胰島素水平不足和胰島素抗性增大的情況下，導(dǎo)致高血糖。

患有tiid的人群更容易出現(xiàn)各種形式的短期和長期并發(fā)癥，包括糖尿病酮癥酸中毒(dka)、高血糖高滲狀態(tài)(hhs)、視網(wǎng)膜病變、心臟病、腎病和神經(jīng)病。這些并發(fā)癥可能導(dǎo)致過早死亡。

本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，含氧脂酰甘油酯可增加胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌并減少胰腺β細(xì)胞中凋亡的水平。

因此在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)受試者的胰島素分泌的含氧脂酰甘油酯。調(diào)節(jié)胰島素分泌可涉及升高受試者中的胰島素分泌水平。例如，與等量未處理對照中的水平相比，含氧脂酰甘油酯可致使胰島素分泌水平升高1.5倍、2倍、5倍或10倍。

tiid的一個重要特征是胰腺β細(xì)胞功能變紊亂，對葡萄糖刺激不敏感，因此對特定地通過升高胰島素分泌水平而起作用的療法無響應(yīng)。如本文所述這樣使用的含氧脂酰甘油酯通過一系列功能發(fā)揮作用，這些功能包括調(diào)節(jié)全身性炎癥、線粒體功能和凋亡。因此本含氧脂酰甘油酯作為針對tiid的療法是有利的，因?yàn)樗鼈冋虻卣{(diào)節(jié)機(jī)制和路徑，已知這些機(jī)制和路徑除刺激胰島素分泌之外，還促成tiid中胰島素抗性的發(fā)展。

如上文所述，肥胖是發(fā)展tiid的主要風(fēng)險因素，但并不是所有的肥胖患者都會發(fā)展tiid。

因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或延緩肥胖受試者中的tiid發(fā)病的含氧脂酰甘油酯。

代謝疾病

代謝疾病或障礙是一種特征為代謝功能改變或紊亂的病癥。代謝障礙包括但不限于高血糖癥、前驅(qū)糖尿病、糖尿病(i型和ii型)、肥胖癥、胰島素抗性和代謝綜合征。

脂肪代謝障礙

本發(fā)明的含氧脂酰甘油酯可用于治療和/或預(yù)防脂肪代謝障礙，脂肪代謝障礙是特征為機(jī)體脂肪組織的異?；蛲诵行圆“Y的醫(yī)學(xué)狀況。具體地講，脂肪代謝障礙可以是當(dāng)人員在同一點(diǎn)重復(fù)執(zhí)行胰島素注射時形成的皮膚上的團(tuán)塊或小凹痕。

脂肪代謝障礙的副作用之一是對所注射的藥物排斥、藥物吸收的減緩或可引起出血，繼而排斥藥物的創(chuàng)傷。在這些情況的任一種中，不可能正確測量藥物(如針對糖尿病的胰島素)的劑量并且針對其施用藥物的疾病的治療受到影響，從而使得醫(yī)學(xué)狀況惡化。

細(xì)胞

根據(jù)本發(fā)明使用的含氧脂酰甘油酯可作用于選自下列的細(xì)胞上：胰腺細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語‘作用于’意指引起細(xì)胞生理活性發(fā)生變化。

含氧脂酰甘油酯可能例如刺激細(xì)胞分泌激素，如胰島素、高血糖素樣肽1(glp1)和/或腸抑胃多肽(gip)。含氧脂酰甘油酯可預(yù)防凋亡，具體地講與氧化應(yīng)激或炎性應(yīng)激相關(guān)的凋亡。含氧脂酰甘油酯可挽救細(xì)胞的胰島素分泌能力。

細(xì)胞可能對氧化應(yīng)激和/或炎性應(yīng)激敏感。

細(xì)胞可參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。

腸內(nèi)分泌細(xì)胞是胃腸道和胰腺專門的內(nèi)分泌性細(xì)胞。它們響應(yīng)于各種刺激胃腸激素或肽而產(chǎn)生激素并將其釋放到血流中以實(shí)現(xiàn)全身性效應(yīng)，將其作為局部信使擴(kuò)散或?qū)⑵鋫鬏斨聊c神經(jīng)系統(tǒng)以激活神經(jīng)響應(yīng)。

胰腺是產(chǎn)生在血液中循環(huán)的若干種重要激素(包括胰島素、高血糖素、生長激素抑制素和胰腺多肽)的內(nèi)分泌腺體。胰島是胰腺中含有其內(nèi)分泌細(xì)胞(即激素分泌細(xì)胞)的區(qū)域。由(至少)以下五種細(xì)胞在胰島中產(chǎn)生的激素被直接分泌到血流中：

產(chǎn)生高血糖素(總胰島細(xì)胞的15％-20％)的α細(xì)胞

產(chǎn)生胰島素和胰淀素(amylin)(65％–80％)的β細(xì)胞

產(chǎn)生生長激素抑制素(3％–10％)的δ細(xì)胞

產(chǎn)生胰腺多肽(3％–5％)的pp細(xì)胞(γ細(xì)胞)

產(chǎn)生饑餓素(ghrelin)(<1％)的ε細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明使用的含氧脂酰甘油酯可作用在胰腺β細(xì)胞上。胰腺β細(xì)胞是胰腺產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，并且是胰島中最豐富的細(xì)胞。

內(nèi)分泌細(xì)胞分泌激素。它們可能是例如腸、胃或胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。

腸內(nèi)分泌細(xì)胞不聚集在一起，而是作為單個細(xì)胞分散在整個腸道。所分泌的激素包括生長激素抑制素、胃動素、膽囊收縮素、神經(jīng)降壓素、血管活性腸肽和腸高血糖素。

根據(jù)本發(fā)明使用的含氧脂酰甘油酯可作用在k細(xì)胞或l細(xì)胞上。k細(xì)胞分泌腸抑胃多肽，一種腸促胰島素。l細(xì)胞分泌高血糖素樣肽1(也是一種腸促胰島素)和高血糖素樣肽2。

腸嗜鉻細(xì)胞是分泌血清素和組胺的內(nèi)分泌細(xì)胞。

胃內(nèi)分泌細(xì)胞可見于胃腺，多數(shù)在其底部。g細(xì)胞分泌促胃液素，迷走神經(jīng)的節(jié)后纖維在副交感神經(jīng)刺激期間可釋放促胃液素釋放肽以刺激分泌。

由胃內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的其他激素包括膽囊收縮素、生長激素抑制素、血管活性腸肽、p物質(zhì)、α和γ-腦內(nèi)啡。

上皮細(xì)胞覆蓋體腔(如胃和尿道)的內(nèi)、外壁。一些上皮細(xì)胞如腸壁上的那些通過使用位于其質(zhì)膜細(xì)胞頂面上的主動運(yùn)輸系統(tǒng)有助于濾過物質(zhì)的運(yùn)輸。例如，位于腸上皮細(xì)胞層的質(zhì)膜的某些域內(nèi)的葡萄糖na+共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使得細(xì)胞在其整個質(zhì)膜上產(chǎn)生na+濃度梯度，這提供了從腸腔攝取葡萄糖所需的能量。然后葡萄糖被釋放到下面的結(jié)締組織中并通過沿其濃度梯度由高到低的易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)到血液供應(yīng)中。

細(xì)胞可以是肝臟細(xì)胞，如肝細(xì)胞。肝臟參與碳水化合物代謝，因?yàn)樗商妓衔镄纬芍觉２⒂芍觉：透视秃铣筛视腿?。肝?xì)胞也合成脫輔基蛋白，然后它們用脫輔基蛋白組裝脂蛋白并運(yùn)出脂蛋白(vldl，hdl)。肝臟也是機(jī)體中發(fā)生糖異生、由前體如丙氨酸、甘油和草酰乙酸形成碳水化合物的主要部位。

肝臟也參與脂質(zhì)代謝，因?yàn)樗鼜捏w循環(huán)接收多種脂質(zhì)并代謝乳糜微粒殘留物。它也由乙酸鹽合成膽固醇并進(jìn)一步合成膽汁鹽。

脂肪細(xì)胞是主要構(gòu)成脂肪組織的細(xì)胞，專門將能量儲存為脂肪。主要存在兩種類型的脂肪組織，白色脂肪組織(wat)和棕色脂肪組織(bat)，也分別稱為白色脂肪和棕色脂肪，并包括兩種類型的脂肪細(xì)胞。肥胖癥的特征為通過脂肪細(xì)胞尺寸增加(肥大)并在較低程度上細(xì)胞增殖(增生)引起的脂肪量擴(kuò)大。在肥胖個體的脂肪細(xì)胞中，代謝調(diào)節(jié)劑如甘油、激素和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)量增加，從而導(dǎo)致發(fā)展胰島素抗性。

脂肪細(xì)胞中脂肪產(chǎn)量被促進(jìn)不飽和脂肪酰合成、葡萄糖攝取的胰島素強(qiáng)烈刺激，并激活刺激脂肪生成的基因的轉(zhuǎn)錄。

細(xì)胞可以是神經(jīng)細(xì)胞，諸如神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦和脊髓中的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。它們是人大腦中豐度最高的細(xì)胞。它們執(zhí)行多種功能，包括形成血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞的生物化學(xué)支持、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)到神經(jīng)組織、維持細(xì)胞外離子平衡以及在大腦和脊髓創(chuàng)傷損傷之后修復(fù)和疤痕形成過程中的作用。

方法

本發(fā)明還涉及一種用于誘導(dǎo)或增加至少一種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯在體內(nèi)產(chǎn)生的方法。

這種方法可誘導(dǎo)或增加至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、多達(dá)多種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯的產(chǎn)生。

該方法可引起受試者肝臟和/或白色脂肪組織中含氧脂酰甘油酯的水平升高。術(shù)語增加可指例如與在實(shí)施所述方法之前的水平相比，含氧脂酰甘油酯的水平升高1.5倍、2倍、5倍或10倍。在實(shí)施所述方法之前，含氧脂酰甘油酯可能不存在于受試者的肝臟和/或白色脂肪組織中。

這種方法可包括下列步驟：

a)向受試者施用選自花生四烯酰甘油(ag)、二?；视?1,2-dag)和/或三?；视?tag)的前體以及/或者

(b)誘導(dǎo)或增加選自下列的酶在受試者中的表達(dá)或活性：磷脂酶c(plc)、二?；视椭久?dagl)、磷脂酶a2(pla2)、n-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(nat)、n-酰基磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶d(nate-pld)、環(huán)氧合酶-2(cox-2)、前列腺素f合酶(pgfs)、前列腺素e合酶(pges)、前列腺素i合酶(pgis)、前列腺素d合酶(pgds)和/或血栓素a(2)合酶(txas)。

可以通過基因療法，刺激免疫應(yīng)答、局部浸潤免疫細(xì)胞或改變脂質(zhì)庫和/或脂筏來增強(qiáng)上述酶的表達(dá)。

前體的施用可采用使活性成分可生物利用的多種途徑中的任一種完成。例如，可通過口服或經(jīng)由局部遞送腸胃外給藥途徑(腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射)施用前體。

本發(fā)明還提供了一種用于治療和/或預(yù)防炎性疾病的含氧脂酰甘油酯前體。

治療方法

本發(fā)明還涉及一種用于治療和/或預(yù)防受試者炎性疾病的方法，這種方法包括向受試者施用至少一種如本發(fā)明第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯或者通過如上文所述的方法誘導(dǎo)或增加至少一種如第一方面中所限定的含氧脂酰甘油酯在體內(nèi)產(chǎn)生的步驟。

炎性疾病可以是如本文所限定的任何疾病。

診斷方法

在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中的炎性疾病或鑒別有發(fā)展炎性疾病風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括：

(a)確定受試者樣品中至少一種含氧脂酰甘油酯的水平；

(b)將樣品中含氧脂酰甘油酯的水平與參考值進(jìn)行比較；

其中與參考水平相比樣品中含氧脂酰甘油酯的水平較低指示患有炎性疾病或具有發(fā)展炎性疾病的風(fēng)險。

確定至少一種含氧脂酰甘油酯的水平

可通過任何合適的方法測量或確定樣品中含氧脂酰甘油酯的水平。例如，可以使用質(zhì)譜法(ms)。在可供選擇的實(shí)施方案中也可使用其他分光光度法、色譜法、標(biāo)記技術(shù)或定量化學(xué)方法?？赏ㄟ^質(zhì)譜法，尤其是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)測量樣品中含氧脂酰甘油酯的水平。

可采用液相色譜法(lc/ms/ms)測定含氧脂酰甘油酯。例如，可采用如masoodi等人(leukemia(2014)28,1381–1387(《白血病》，2014年，第28卷，第1381-1387頁))所述的lc/ms/ms方法確定含氧脂酰甘油酯的水平。

通常使用相同的分析方法確定樣品中的含氧脂酰甘油酯水平和參考值。

樣品

本方法包括確定得自受試者的樣品中至少一種含氧脂酰甘油酯的水平的步驟。因此，本發(fā)明的方法通常在人類或動物體外實(shí)施，例如對先前從待測受試者獲得的體液樣品實(shí)施。樣品可來源于血液，即該樣品可包括全血或血液級分。該樣品可包括血漿或血清。

用于采集血液樣品和分離血液級分的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。例如，可用針從患者采集靜脈血液樣品，并將其存入塑料管中。采集管可例如含有噴涂的二氧化硅和聚合物凝膠，用于血清分離?？赏ㄟ^在室溫下以1300rcf離心10分鐘來分離血清，并將其在-80℃下貯藏于塑料管中。

樣品可以是血清、血漿、尿液或脂肪組織活檢樣品。

與參考值的比較

本發(fā)明的方法還包括將測試樣品中至少一種含氧脂酰甘油酯的水平與一個或多個參考或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較的步驟。通常使用在本方法中測定的各個單獨(dú)的含氧脂酰甘油酯的具體參考值。參考值可以是該含氧脂酰甘油酯的正常水平，例如該含氧脂酰甘油酯在對照受試者同種類型樣品(例如血清或血漿)中的水平。對照受試者可能例如是正常健康受試者或者是肥胖但非糖尿病受試者。參考值可能例如基于含氧脂酰甘油酯在對照受試者群體例如5、10、100、1000或更多對照受試者(可能與測試受試者年齡和/或性別相匹配或不匹配)中的均值或中值水平。

受試者的含氧脂酰甘油酯生物標(biāo)記物水平和對應(yīng)參考值之間的差異程度也可用于確定哪些受試者將最受益于某些干預(yù)。

測試樣品中含氧脂酰甘油酯的水平與參考值相比可減少例如至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少100％。

在一些實(shí)施方案中，參考值是此前從相同受試者中得到的值。這使得能夠直接比較受試者當(dāng)前生活方式或治療策略與此前生活方式或預(yù)治療相比對含氧脂酰甘油酯生物標(biāo)記物水平產(chǎn)生的影響，以致可直接評估所取得的改善。

可采用確定測試樣品中含氧脂酰甘油酯水平的對應(yīng)方法確定參考值，例如使用從對照受試者中所取的一個或多個樣品。例如，在一些實(shí)施方案中，可在與測試樣品平行的測定法中確定對照樣品中的含氧脂酰甘油酯水平。或者，在一些實(shí)施方案中，各含氧脂酰甘油酯物質(zhì)在具體樣品類型(例如血清或血漿)中的水平的參考值可能已經(jīng)可利用，例如根據(jù)已公布的研究。因此在一些實(shí)施方案中，此前可能已經(jīng)確定或者可能計(jì)算或外推參考值，而不必相對于所得到的每個測試樣品在對照樣品上執(zhí)行相應(yīng)的測定。

炎性疾病

炎性疾病可以是如本文所述的任何炎性疾病。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可用于預(yù)測肥胖受試者發(fā)展tiid的可能性。如上文所述，雖然肥胖是發(fā)展胰島素抗性和潛在tiid的主要風(fēng)險因素，但并不是所有肥胖患者都會患上胰島素抗性和tiid。本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地確定，含氧脂酰甘油酯水平減少與發(fā)展胰島素抗性和tiid有關(guān)。因此，在本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，如果來自受試者的樣品中含氧脂酰甘油酯的水平與參考值相比例如減少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少100％，則可以預(yù)測肥胖受試者發(fā)展tiid的可能性增加。

本發(fā)明方法還可包括通過采用如本文所限定的方法誘導(dǎo)或增加至少一種含氧脂酰甘油酯的產(chǎn)生來治療通過本發(fā)明方法確定為患有炎性疾病或有患上炎性疾病風(fēng)險的受試者的步驟。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明第一方面的含氧脂酰甘油酯，用于

i)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)；或者

ii)保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡。

炎性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)

炎癥由多種炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)，這些細(xì)胞因子可分成兩組：參與急性炎癥的那些和負(fù)責(zé)慢性炎性響應(yīng)的那些。炎癥，例如響應(yīng)于組織損傷，在急性期中表征為血流和血管通透性增加以及流體、白細(xì)胞和炎癥介質(zhì)(如細(xì)胞因子)積聚。在亞急性/慢性期(在下文中稱為慢性期)，其表征為發(fā)展針對例如存在于組織損傷位點(diǎn)處的病原體的特定體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性和慢性炎癥過程兩者中，多種可溶性因子通過細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和趨化作用增強(qiáng)而參與白細(xì)胞募集。這些可溶性介質(zhì)中的許多介質(zhì)調(diào)節(jié)駐留細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞)和新募集炎性細(xì)胞(如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)的活化，并且這些介質(zhì)中的一些介質(zhì)導(dǎo)致對炎癥過程的全身性響應(yīng)。幾種細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)中起到重要作用，即il-1、tnf-α、il-6、il-11、il-8以及其他趨化因子gcsf和gm-csf。已知介導(dǎo)慢性炎癥過程的細(xì)胞因子可分成：參與體液炎癥的那些，如il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-9、il-10、il-13，和轉(zhuǎn)化生長因子-b(tgf-b)；以及有助于細(xì)胞炎癥的那些，如il-1、il-2、il-3、il-4、il-7、il-9、il-10、il-12、干擾素(ifn)、ifn-γ誘導(dǎo)因子(igif)、tgf-β以及tnf-α和tnf-β。

含氧脂酰甘油酯可調(diào)節(jié)細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)。具體地講，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞對炎性細(xì)胞因子如il-1β、tnfα和/或ifnγ的響應(yīng)。

含氧脂酰甘油酯可下調(diào)通過細(xì)胞炎癥響應(yīng)活化的nfkb信號通路。

凋亡

細(xì)胞響應(yīng)于應(yīng)激如熱、輻射、營養(yǎng)缺乏、病毒感染或缺氧而引發(fā)胞內(nèi)凋亡信號。在細(xì)胞死亡過程發(fā)生之前，凋亡信號必須引起調(diào)節(jié)蛋白引發(fā)凋亡途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這種過程的兩種主要方法：靶向線粒體功能，或經(jīng)由tnf路徑或fas路徑直接轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病中β細(xì)胞功能紊亂的主要起因。本發(fā)明人已經(jīng)表明，本發(fā)明的生物活性脂質(zhì)可降低已經(jīng)用炎性細(xì)胞因子混合物(實(shí)施例4)處理過的β細(xì)胞中的凋亡信號。生物活性脂質(zhì)通過降低由細(xì)胞炎癥響應(yīng)激活的nfkb信號通路來保護(hù)β細(xì)胞不凋亡。

現(xiàn)將通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例意在幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1—用生物活性脂質(zhì)級分急性刺激min6細(xì)胞

在完全dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)70％至80％融合度的min6細(xì)胞。為了測量生物活性脂質(zhì)級分對葡萄糖刺激的胰島素分泌(gsis)的急性效應(yīng)，在低濃度葡萄糖培養(yǎng)基(krebsringerbufferhepes(krbh)加上2mm葡萄糖)中使細(xì)胞饑餓2小時，然后在生物活性脂質(zhì)級分(krbh20mmglc中的1:50稀釋液)的存在下用20mm葡萄糖刺激細(xì)胞30分鐘。將生物活性脂質(zhì)對gsis的效應(yīng)與對照葡萄糖加上溶媒(2％乙醇)進(jìn)行比較。使用胰島素elisa試劑盒(mercodia公司)測量胰島素分泌。

這些數(shù)據(jù)表明，生物活性脂質(zhì)對gsis存在協(xié)同效應(yīng)(圖1)。

實(shí)施例2—用脂質(zhì)級分長期處理對β細(xì)胞功能和存活率的影響

為了確定用生物活性脂質(zhì)長期處理是否影響β細(xì)胞功能和存活率，在dmem培養(yǎng)基中用濃度不斷增大的生物活性脂質(zhì)(1:1000至1:20稀釋液)處理min6β細(xì)胞系48小時(見表1)。在長期處理實(shí)驗(yàn)中，在預(yù)處理結(jié)束時從培養(yǎng)基中除去生物活性脂質(zhì)，并在用葡萄糖刺激之后評估細(xì)胞功能。通過對與歸一化為100％的溶媒處理細(xì)胞的基線值相比的細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)來評估細(xì)胞存活率和增殖。

表1

在最高濃度的生物活性脂質(zhì)時，只有級分1和5對細(xì)胞存活率有影響(圖2)。

為了確定生物活性脂質(zhì)對β細(xì)胞功能的長期效果，用接近生理范圍的濃度的生物活性脂質(zhì)(1:1000稀釋液)處理min6細(xì)胞72小時。在處理結(jié)束時，通過測量gsis評估β細(xì)胞功能(圖3a)。生物活性脂質(zhì)級分5通過使min6細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌胰島素的能力加倍而實(shí)質(zhì)上改善了β細(xì)胞功能。

在健康捐獻(xiàn)者的原代人胰島中進(jìn)一步測試級分3和5。級分5顯著增加了已經(jīng)健康的胰島響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌的胰島素(圖3b)。

實(shí)施例3—進(jìn)一步確定生物活性脂質(zhì)對β細(xì)胞功能的效應(yīng)

通過使用液相色譜進(jìn)一步分級分離，從脂質(zhì)級分5中分離純生物活性脂質(zhì)物質(zhì)。分離5種亞級分并進(jìn)行測試以確定在葡萄糖的存在下它們是否急性刺激胰島素分泌。

在饑餓條件(2mm葡萄糖)下或在用20mm葡萄糖或20mm葡萄糖加上按1:100稀釋的生物活性脂質(zhì)刺激15分鐘之后，測量min6細(xì)胞中的胰島素分泌。通過elisa測量胰島素分泌。

在葡萄糖的存在下，級分5協(xié)同增加了胰島素分泌，但是亞級分5.3使胰島素分泌增強(qiáng)幾乎超過單獨(dú)葡萄糖的三倍(圖4)。

為了確定長期處理的效果，在執(zhí)行g(shù)sis之前，用按1:1000稀釋的富集生物活性脂質(zhì)亞級分處理min6細(xì)胞72小時(圖5)。所有亞級分均顯著改善了β細(xì)胞功能；但是，亞級分5.4是β細(xì)胞功能更強(qiáng)大的調(diào)節(jié)物。

實(shí)施例4—生物活性脂質(zhì)的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病中β細(xì)胞功能紊亂的主要起因。為了確定所分離的生物活性脂質(zhì)級分在β細(xì)胞死亡中是否起作用，在存在或不存在生物活性脂質(zhì)級分(1:100稀釋液)的情況下，用炎性細(xì)胞因子混合物(50u/mlil1β、100u/mltnfα和100u/mlinfγ)處理β細(xì)胞48小時。在處理之后，從粗細(xì)胞提物中測量半胱天冬酶8活性(凋亡的早期標(biāo)記物)。級分3和級分5兩者均降低了凋亡信號，表明級分3和級分5兩者都具有細(xì)胞保護(hù)特性(圖6a)。

在上述細(xì)胞因子處理之后，在min6細(xì)胞中進(jìn)一步評估亞級分5.3和5.4與級分1、3和5相比的細(xì)胞保護(hù)特性。通過降低由細(xì)胞炎性應(yīng)答激活的nfkb信號通路，級分5和亞級分5.4兩者均顯著降低了裂解的半胱天冬酶3(凋亡)(圖6b)。

實(shí)施例5—生物活性脂質(zhì)在β細(xì)胞功能紊亂中的生理相關(guān)性

詳細(xì)研究了生物活性脂質(zhì)亞級分5.4對從gk(gatakakizaki)大鼠分離的原代胰島的功能的影響，該大鼠為與人2型糖尿病非常相似的2型糖尿病模型。成年gk大鼠的特征為顯著的炎癥、胰島細(xì)胞纖維化以及β細(xì)胞功能降低。為了確定生物活性脂質(zhì)級分5.4是否挽救gk大鼠的胰島功能紊亂，在評估用由20mm葡萄糖、1×氨基酸和0.1μmex-4(一種glp1同工型)組成的促分泌素混合物刺激1小時后的胰島功能之前，用溶媒或5.4級分處理分離的胰島72小時。

這些數(shù)據(jù)表明，級分5.4能夠使gk大鼠的胰島素分泌能力恢復(fù)到與正常wistar大鼠對照相當(dāng)?shù)乃?圖7)。

實(shí)施例6—生物活性脂質(zhì)在高血糖素樣肽1(glp1)的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌中的作用

在存在或不存在生物活性脂質(zhì)級分的情況下，用低濃度(2mm)和高濃度(20mm)葡萄糖急性刺激腸內(nèi)分泌l細(xì)胞系(nci-h716)。這些數(shù)據(jù)表明，級分4與刺激性葡萄糖具有最顯著的協(xié)同作用來增加glp1分泌(圖8)。

為了確定生物活性脂質(zhì)對腸內(nèi)分泌l細(xì)胞功能的長期影響，用生物活性脂質(zhì)處理nci-h716細(xì)胞系72小時。在用20mm葡萄糖刺激之后級分5預(yù)處理實(shí)質(zhì)上增加了glp1分泌(圖9)。

實(shí)施例7—生物活性脂質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激基因

生物活性脂質(zhì)級分能夠降低與炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)激基因的表達(dá)(圖10)。具體地講，級分5效果最好。

實(shí)施例8—鑒定生物活性脂質(zhì)

如masoodi等人(leukemia(2014)28,1381–1387(《白血病》，2014年，第28卷，第1381-1387頁))中所述那樣進(jìn)行色譜分析。以0.5ml/min使用梯度(a：10mm醋酸銨+0.1％甲酸；b：acn:h2o:甲酸(90:10:0.1)+10mm醋酸銨)，在c18反相(rp)色譜柱(phenomenexluna，3μm顆粒，150mm×2mm)上分離類花生酸類物質(zhì)和相關(guān)代謝物，并在(phenomenexkinetex-xb-c18，2.6μm顆粒，100mm×2mm)上分離脂肪酰乙醇酰胺/甘油酯。起始條件由35％b組成并保持2分鐘。然后在1分鐘內(nèi)將梯度增加至55％b，接著在7分鐘內(nèi)增加至95％b保持2分鐘，最后返回初始條件保持2分鐘使其達(dá)到平衡。

使用ltqelite線性離子阱(lit)-軌道阱進(jìn)行質(zhì)譜分析。將離子噴霧電壓調(diào)節(jié)至4000v。使用全掃描模式下分辨能力60000和ms/ms模式下15000。對于自動數(shù)據(jù)處理，將數(shù)據(jù)采集文件轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放*.mzxml文件標(biāo)準(zhǔn)，并使用開源bioconductor包xcms(1.22.1版)2以及內(nèi)部開發(fā)的另外r包進(jìn)行分析。在質(zhì)心峰上進(jìn)行峰檢測，并使用質(zhì)量數(shù)內(nèi)標(biāo)以及常見完整脂質(zhì)進(jìn)行樣品依賴性質(zhì)量重新校準(zhǔn)。在質(zhì)量公差為5ppm的整組樣品上將峰分組。采用最大質(zhì)量偏差3ppm，用內(nèi)部開發(fā)的分等級、基于相關(guān)性的方法進(jìn)行峰去同位素(de-isotoping)。

使用這種方法鑒定出的代表性生物活性脂質(zhì)為：

9α,15s-二羥基-11-氧代-5z,13e-前列二烯酸1-甘油酯或9α,15s-二羥基-11-氧代-前列-5z,13e-二烯-1-酸1-甘油酯或前列腺素d2甘油酯(來自級分5.3)

11-氧代-5z,9,12e,4e-前列四烯酸-2-甘油酯或11-氧代-前列-5z,9,12e,14e-四烯-1-酸,2-甘油酯或15-脫氧-δ12,14-pgj2-2-甘油酯(來自級分5.4)

然后經(jīng)純化的生物活性脂質(zhì)用于后續(xù)體外測試。

實(shí)施例9—分離的級分5.4與合成的純級分5.4和5.3的功能效應(yīng)對比

在用生物活性脂質(zhì)和葡萄糖急性處理(1小時)和慢性處理(16或72小時，1:500稀釋液)之后在原代大鼠和人胰島中測量胰島素分泌(圖12)。

從脂肪/大腦組織中純化級分5.4wat。級分5.4和5.3是合成的純級分(10μg/μl儲備液)。生物活性脂質(zhì)的濃度為20pg/μl。對照樣為乙醇。如圖12所示，可見合成化合物具有與級分5.3/5.4相似的化學(xué)和生物效應(yīng)。