本發(fā)明公開了一種白介素-12和鞭毛蛋白的新用途，具體的說，是白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

背景技術(shù)：

全球有20億人群感染乙肝病毒，其中2.4億是慢性乙肝病毒表面抗原(hbsag)攜帶者。慢性乙肝(chb)有一部分人是不活躍的，但有一部分人可導(dǎo)致肝硬化、肝癌。

近年來，應(yīng)用干擾素及核苷類似物治療chb，取得很大進(jìn)展，大多數(shù)患者經(jīng)過治療后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酸(alt)、hbvdna、hbeag在外周血可以恢復(fù)正?；蜣D(zhuǎn)為陰性，但外周血中hbsag仍持續(xù)陽性，很難達(dá)到血清轉(zhuǎn)換(呈現(xiàn)抗-hbs陽性)。這些年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)提出慢性乙肝功能性治愈的概念，也就是說，治療慢性乙肝除了要求alt、hbvdna、hbeag長期穩(wěn)定正常以外，尚要求外周血hbsag消除，并出現(xiàn)乙型肝炎表面抗體，即血清由hbsag陽性轉(zhuǎn)換為陰性，并出現(xiàn)抗-hbs這也是對慢性乙肝治療的終點(diǎn)或目標(biāo)。達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，就是chb功能性治愈。慢性乙型肝炎患者由于hbv特異性免疫功能降低和cd8+t細(xì)胞耗竭，使其自身不能完全清除hbv，但其體內(nèi)對hbv抗原產(chǎn)生應(yīng)答的主要是th1型細(xì)胞，因此，應(yīng)用有效的免疫佐劑提高慢性乙肝患者的細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)并維持以hbv特異性ctl為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對于hbv的徹底清除十分重要。

鞭毛蛋白(piliatedpseudomonasaeruginosa，ppa)能調(diào)整人體體液免疫及 細(xì)胞免疫的不平衡狀態(tài)，增加巨噬細(xì)胞和nk細(xì)胞的活性，維持t細(xì)胞的數(shù)量與比例。鞭毛蛋白同時(shí)含有ⅰ、ⅱ、ⅳ型菌毛及鞭毛蛋白，鞭毛蛋白啟動的先天固有免疫應(yīng)答由tlr5介導(dǎo)，產(chǎn)生各種生物學(xué)反應(yīng)，是先天性固有免疫應(yīng)答和后天獲得性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵蛋白。tlr5作為tlr家族的成員之一，已證明主要在肺臟和肝臟表達(dá)。

白細(xì)胞介素-12(il-12)作為免疫網(wǎng)絡(luò)中的核心細(xì)胞因子，是連接先天固有免疫與后天獲得性免疫的橋梁，能夠顯著誘導(dǎo)th1型細(xì)胞免疫，增強(qiáng)cd8+t細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并抑制th2型細(xì)胞免疫。這些特性使其在抑制hbv復(fù)制的過程中發(fā)揮重要作用。il-12具有促進(jìn)t細(xì)胞活化、增殖、裂解效應(yīng)的功能，有望成為有效的免疫增強(qiáng)劑，以輔助cd8+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

現(xiàn)在慢性乙型肝炎治療中，hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)難以清除表面抗原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種解決檢測指標(biāo)為hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎hbsag難以清除的問題，提供白介素-12和鞭毛蛋白作為制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：

一種白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

進(jìn)一步的，上述的白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途，所述的慢性乙型肝炎的檢測指標(biāo)為：hbsag+，滴度＜1000iu/ml，hbeag-，bv-dna-。

進(jìn)一步的，上述的白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途，所述的鞭毛蛋白劑量為每劑含菌1.0×10⁹-3.0×10⁹；所述的白細(xì)胞介素-12劑量為5-10μg/劑。

與現(xiàn)有相比，本發(fā)明提供色技術(shù)方案采用白細(xì)胞介素-12與鞭毛蛋白制劑聯(lián)合使用作為治療hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎的藥物；其中，鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12能顯著提高健康人和慢性乙型肝炎患者pbmcs產(chǎn)生ifn-γ的水平，增強(qiáng)其細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)慢性乙型肝炎表面抗原的清除。

附圖說明

圖1是不同濃度鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)ifn-γ的水平；

圖2是鞭毛蛋白聯(lián)合不同濃度rhil-12誘導(dǎo)ifn-γ的水平；

圖3鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的水平；

圖4鞭毛蛋白聯(lián)合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag的作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供的白細(xì)胞介素-12作為一種藥物用于hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎的治療，使用時(shí)與鞭 毛蛋白制劑聯(lián)合使用，鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12能顯著提高健康人和慢性乙型肝炎患者pbmcs產(chǎn)生ifn-γ的水平，增強(qiáng)其細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)慢性乙型肝炎表面抗原的清除。

具體實(shí)驗(yàn)例如下：

鞭毛蛋白最適劑量的選擇：鞭毛蛋白組(0.0075～14ng/ml)、rhil-12(1ng/ml)、不同濃度鞭毛蛋白+rhil-12、陰性對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmcs)，細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中ifn-γ的含量。

結(jié)果：鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)健康人pbmcs中ifn-γ的產(chǎn)生，在一定范圍內(nèi)隨鞭毛蛋白濃度的升高而增加，最適稀釋度范圍為1.75-14ng/ml，見圖1。單獨(dú)鞭毛蛋白組基本不能誘導(dǎo)ifn-γ的產(chǎn)生，與陰性對照組相似；單獨(dú)應(yīng)用rhil-12(1ng/ml)也能產(chǎn)生一定的刺激作用。

rhil-12最適劑量的選擇：rhil-12(濃度分別為0.1、0.5、1.0和2.0ng/ml)、鞭毛蛋白(3.5ng/ml)、鞭毛蛋白+不同濃度rhil-12組、陰性對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmcs)，細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中ifn-γ的含量。

結(jié)果：rhil-12最適劑量的選擇：鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)健康人pbmcs中ifn-γ的產(chǎn)生，在一定范圍內(nèi)隨rhil-12濃度的升高而增加，最適濃度范圍為0.1-1.0ng/ml；單獨(dú)應(yīng)用rhil-12也能產(chǎn)生刺激作用。見圖2。

鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的產(chǎn)生：rhil-12(濃度分別為0.1、0.5、1.0和2.0ng/ml)、鞭毛蛋白(3.5ng/ml)、鞭毛 蛋白+不同濃度rhil-12組、陰性對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmcs)，細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中ifn-γ的含量。

結(jié)果：鞭毛蛋白聯(lián)合rhil-12誘導(dǎo)慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的產(chǎn)生：鞭毛蛋白組只誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的ifn-γ，rhil-12組誘導(dǎo)產(chǎn)生ifn-γ的水平較陰性對照組顯著提高；而鞭毛蛋白+rhil-12組誘導(dǎo)產(chǎn)生ifn-γ的水平顯著高于鞭毛蛋白和rhil-12組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

鞭毛蛋白聯(lián)合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag滴度的影響:32只乙肝水動力模型小鼠隨機(jī)分入生理鹽水組、rmil-12(100ng/只)、鞭毛蛋白(μg/只)及鞭毛蛋白+rmil-12組，每組8只。rmil-12每周給藥兩次，第一次給藥72h后再給藥一次，連續(xù)給藥三周；鞭毛蛋白每周給藥一次，連續(xù)給藥三周。注射部位為小鼠頸背部皮下。分別于給藥前、給藥后每周采血測血清中hbsag的滴度，停藥后繼續(xù)觀察三周，每周采血測血清中hbsag的滴度。

結(jié)果：鞭毛蛋白聯(lián)合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag的作用：鞭毛蛋白組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較呈低水平的下降；rmil-12組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較顯著下降，停藥后hbsag開始反跳；而鞭毛蛋白+rmil-12組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較低于鞭毛蛋白和rmil-12組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且停藥后hbsag持續(xù)下降，未見反跳。見圖4。

結(jié)果表明：hbsag特異性p肽聯(lián)合il-12有顯著促使hbsag血清轉(zhuǎn)換作用。

本發(fā)明提供一種白細(xì)胞介素-12聯(lián)合鞭毛蛋白治療hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎，其可以有效地啟動先天固有性免疫和后天獲得性免疫，恢復(fù)耗竭的cd8+t細(xì)胞，外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmcs)產(chǎn)生ifnγ的水平，清除hbsag。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。