本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法和用途。

背景技術(shù)：

甘油三酯(TG)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能量?jī)?chǔ)存的主要形式。當(dāng)能量攝入超過能量消耗，多余的能量將會(huì)以甘油三酯的形式儲(chǔ)存于脂肪細(xì)胞以及含有脂肪細(xì)胞的組織和肝臟等器官中，長(zhǎng)期以來(lái)會(huì)最終導(dǎo)致脂肪細(xì)胞能量積累以及肥胖。動(dòng)物脂肪細(xì)胞的脂解是個(gè)復(fù)雜過程，其受各種激素和生理信號(hào)共同調(diào)控，這種調(diào)控的失衡可導(dǎo)致肥胖和相關(guān)疾病。脂肪細(xì)胞中甘油三酯的降解是一個(gè)精細(xì)的調(diào)節(jié)過程，與維持細(xì)胞或者機(jī)體能量的動(dòng)態(tài)平衡和代謝健康密切相關(guān)。脂解活性降低可促進(jìn)脂肪組織甘油三酯的積累，過度脂解可能導(dǎo)致脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征，脂肪組織甘油三酯的降低或重新分配，導(dǎo)致循環(huán)脂肪酸濃度高和甘油三酯的異位貯存。甘油三酯的脂解作用至少被三種酶催化：脂肪細(xì)胞甘油三酯酶(ATGL)主要催化甘油三酯的第一個(gè)酯鍵水解，產(chǎn)生的二?；视捅患に孛舾絮ッ?HSL)催化產(chǎn)生單?；视?，單?；视捅粏熙；视王ッ?MGL)催化(Jaworski K等人，2007，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 293:1-4)。脂肪細(xì)胞中ATGL和HSL是最重要的脂解酶，共同控制小鼠白色脂肪組織中甘油三酯95％的水解活性(Schweiger M等人，2006，J Biol Chem 281:40236-40241)。脂解生成的脂肪酸可釋放入血，與白蛋白結(jié)合形成脂酸白蛋白運(yùn)輸至其它組織被利用。脂肪酸的分解是以氧化的形式進(jìn)行的，而氧化的方式有α-氧化，β-氧化和ω-氧化，其中β-氧化是主要的方式。

HSL作為經(jīng)典脂肪分解限速酶，作用底物幾乎包括了除磷脂以外大多數(shù)酯，包括甘油三酯、二?；视?、單?；视汀⒛懝檀减ズ鸵朁S酯，其被認(rèn)為是脂解作用調(diào)控酶，水解甘油三酯產(chǎn)生單?；视停瑔熙；视驮谄渌饷缸饔孟聫氐姿狻Ａ姿峄腍SL是其活性形式，其激活依賴于cAMP-PKA途徑。HSL基因敲除鼠并未表現(xiàn)出肥胖，并且其脂肪組織具有甘油三酯水解活性(Fortier M等人，2004，Am J Physiol Endocrinol Metab 287：282-288；Haemmerle G等人，2002，J Biol Chem 277:4806-4815)。水解產(chǎn)物二?；视驮诎咨窘M織、棕色脂肪組織、肌肉和睪丸中積累(Haemmerle G等人，2002，J Biol Chem 277:4806-4815)。這些結(jié)果表明，HSL是脂肪組織和肌肉中二酰基甘油水解的限速酶。脂解反應(yīng)發(fā)生時(shí)，ATGL催化的反應(yīng)對(duì)TG第一個(gè)脂肪酸的水解具有專一性，并產(chǎn)生DG，DG的利用依賴于細(xì)胞的代謝狀態(tài)(Lass A等人，2006，Cell Metabolism 3(5)：309-31)。在需能的情況下，兒茶酚胺與β-腎上腺素受體結(jié)合，G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)活化腺苷酸環(huán)化酶。高水平的環(huán)腺苷酸(cAMP)活化PKA，PKA進(jìn)一步磷酸化HSL和Perilipin A。磷酸化的Perilipin A通過改變構(gòu)象促進(jìn)磷酸化HSL從胞液易位至脂滴表面，磷酸化的HSL靠近磷酸化的Perilipin A，能與脂肪滴中的TG和DG底物結(jié)合。DG進(jìn)一步被HSL水解為單?；视?MG)和脂肪酸(FA)，MG在單酰甘油酯酶作用下水解為甘油和FA，脂肪酸和甘油離開脂肪細(xì)胞并進(jìn)入循環(huán)。大量研究表明，營(yíng)養(yǎng)和激素等因子調(diào)控著脂肪組織中脂肪的降解(Jaworski K等人，2007，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 293:1-4；Lass A等人，2006，Cell Metabolism 3(5)：309-31)。在飼喂?fàn)顟B(tài)下，胰島素通過引起HSL脫磷酸化和磷酸二酯酶活化，降低cAMP水平，進(jìn)而抑制脂解(Carmen GY等人，2006，Cell Signal 18:401-408；Langin D等人，2006，Pharmacol Res 53(6)：482-491)。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)作為一種核受體，可調(diào)控多種核內(nèi)基因的表達(dá)，其編碼的蛋白質(zhì)和其他的核受體具有相似的功能區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PPARs存在三種不同的亞型，分別命名為PPARα、PPAPβ以及PPARγ。該三種亞型的結(jié)構(gòu)相似，但組織分布具有差異性，其中PPARα亞型主要分布在脂肪酸氧化率較高的心臟、肝臟、腎臟和骨骼肌細(xì)胞中(Issemann I等人，1990，Nature 347(6294):645-650)。PPARα對(duì)脂肪酸代謝具有重要調(diào)控作用，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、活化和β氧化。PPARα及其激動(dòng)劑具有消除脂代謝障礙、改善胰島素抵抗和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚等作用，具有保護(hù)心血管的作用?；罨蟮腜PARα后與PPRE相結(jié)合，可激活乙酰輔酶A合成酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，并活化肉毒堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)，提高脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化等方面的效率，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸的β氧化，提高脂代謝，為機(jī)體提供更多能量。PPARα基因缺失的小鼠出現(xiàn)肥胖及脂肪細(xì)胞變大等表型(Costet P等人，1998，J Biol Chem 273(45):29577-29585；Knauf C等人，2006，Endocrinology 147:4067-4078)。

細(xì)胞脂代謝異常是導(dǎo)致肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝綜合癥的主要病理因素。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家,肥胖的流行正在全世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)。因此，針對(duì)脂代謝過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或者催化酶，有效促進(jìn)甘油三酯的脂解過程，提高脂肪酸的氧化速度，將是治療肥胖癥及其相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)之一和治療關(guān)鍵及難點(diǎn)。

FADD(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的重要銜接蛋白，介導(dǎo)Fas及其它死亡受體引起的凋亡信號(hào)通路。1995年，Dixit和Wallach兩個(gè)研究小組利用酵母雙雜交系統(tǒng)，幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了人和小鼠FADD/MORT1基因(Chinnaiyan AM等人，1995，Cell 81(4):505-512；Boldin MP等人，1995，J Biol Chem 270(14)：7795-7798)。人源的FADD基因約3.6kb，包含兩個(gè)外顯子(分別為286bp和341bp)和一段2kb的相隔其間的內(nèi)含子。該基因位于11號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上(11q13.3)(Kim PK等人，1996，J Immunol 157(12):5461-5466)，F(xiàn)ADD與同位于11q13的1型糖尿病易感位點(diǎn)(IDDM4)共定位(Eckenrode S等人，2000，Hum Genet 106(1):14-18；Nakagawa Y等人，1998，Am J Hum Genet 63(2):547-556)，因此，F(xiàn)ADD基因的突變可能會(huì)影響胰島素依賴的糖尿病的發(fā)生。人和小鼠FADD基因分別編碼208個(gè)和205個(gè)氨基酸組成的FADD蛋白。人和小鼠FADD蛋白68％氨基酸殘基完全相同，在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)上同源程度高達(dá)80％。人和小鼠FADD蛋白均分別包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effect domain,DED)，和C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)。死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DED由約76個(gè)氨基酸殘基組成，靠近N-末端，可寡聚化并通過疏水作用招募含DED的蛋白，共同組成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death inducing signal complex,DISC)，從而向下游傳導(dǎo)死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)。死亡結(jié)構(gòu)域DD由約70個(gè)氨基酸殘基組成，靠近C-末端并與CTD結(jié)構(gòu)域部分重疊，可與Fas的DD結(jié)構(gòu)域相互作用，接受凋亡信號(hào)。C-末端結(jié)構(gòu)域CTD由約20個(gè)氨基酸殘基組成，含有易于磷酸化的Ser和Thr殘基，可能與FADD介導(dǎo)的細(xì)胞的非凋亡功能相關(guān)(Hua ZC等人，2003，Immunity 18:513-521)。

將蛋白質(zhì)中易于磷酸化的Ser和Thr殘基突變成為天冬氨酸或者谷氨酸是國(guó)際上已經(jīng)廣泛認(rèn)可和使用的研究蛋白質(zhì)磷酸化的方法。如Kim Y等人在其研究中將WAVE1蛋白310位的絲氨酸突變成為天冬氨酸來(lái)模擬其磷酸化狀態(tài)(Kim Y 等人，2006，Nature 442(7104):814-817)；Paroo Z等人在其研究中將TRBP蛋白142、152、283、286位的絲氨酸突變?yōu)樘於彼醽?lái)模擬其磷酸化狀態(tài)(Paroo Z等人，2009，Cell 139:112-122)；Papinski D等人在其研究中將Atg9蛋白絲氨酸殘基(S802，S831，S948和S969)突變成天冬氨酸來(lái)模擬其磷酸化狀態(tài)(Papinski D等人，2014，Mol Cell 53(3):471-483)；Bajorek M等人在其研究中將RSV基質(zhì)蛋白220位的絲氨酸突變?yōu)樘於彼醽?lái)模擬其磷酸化狀態(tài)(Bajorek M等人，2014，J Virol 88(11):6380-6393)；Pozo-Guisado E等人在其研究中將STIM1蛋白575,608和621位的絲氨酸替換為谷氨酸來(lái)模擬其磷酸化(Pozo-Guisado E等人，2013，J Cell Sci 126(Pt 14):3170-3180)；Bin L等人在其研究TnI蛋白時(shí)將144位的蘇氨酸突變成天冬氨酸、谷氨酸來(lái)模擬其磷酸化(Liu B等人，2014，PLoS One 9(1):e86279)。用天冬氨酸或者谷氨酸模擬絲氨酸磷酸化，無(wú)論在電荷上、還是在碳鏈長(zhǎng)度上、或是在功能上，許多實(shí)驗(yàn)都已證明天冬氨酸或者谷氨酸完全可以與絲氨酸磷酸化相一致。因此，將FADD蛋白191位絲氨酸突變成為天冬氨酸來(lái)研究其磷酸化功能是一種常規(guī)的、可行的方法。

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的可能調(diào)控FADD磷酸化狀態(tài)的激酶有37kD大小的CKIα蛋白(Alappat EC等人，2005，Mol Cell 19：321-332)及130kD大小的FIST-HIPK3蛋白(Rochat-Steiner V等人，2000，J Exp Med 192：1165-1174)等，磷酸酶有AK2蛋白(Kim H等人，2014，Nat Commun 5：3351)。這些調(diào)控FADD磷酸化狀態(tài)的靶點(diǎn)是已知的、已廣為研究的，利用常規(guī)的分子設(shè)計(jì)方法進(jìn)行這些酶的底物類似物的分子設(shè)計(jì)、化學(xué)合成及活性評(píng)價(jià)，通過調(diào)節(jié)上述酶的活性、便可很容易獲得具有調(diào)控FADD磷酸化狀態(tài)功能的物質(zhì)?；谶@些理念，早在2010年國(guó)際上就已有高通量篩選調(diào)控FADD磷酸化的化合物的方法，這些方法已被證明是可大規(guī)模進(jìn)行重復(fù)篩選的，是常規(guī)的、可行的(Khan AP等人，2010，J Biomol Screen 15(9):1063-1070)。因此，對(duì)于篩選調(diào)控FADD磷酸化狀態(tài)的物質(zhì)而言，無(wú)論在相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白、還是高通量篩選方法，這些技術(shù)方法都是完全可行的，能夠?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所容易熟練掌握的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)節(jié)細(xì)胞脂解和脂肪酸氧化代謝的方法，其特征在于：表達(dá)模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因，或者以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度為指證篩選提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，上述方法的共同目的是提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化。

進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)細(xì)胞脂解和脂肪酸氧化代謝的方法，其特征在于：調(diào)節(jié)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，提高激素敏感酯酶HSL的磷酸化程度及活性；調(diào)節(jié)PPARα轉(zhuǎn)錄活性，提高參與脂肪酸β氧化過程的酶的活性，包括過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶1(Acox1)、三羥酰輔酶A脫氫酶(Ehhadh)、極長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶(Acadvl)、長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶(Acadl)和中鏈?；o酶A脫氫酶(Acadm)。

進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法在制備治療脂代謝紊亂疾病藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法在制備治療脂代謝疾病藥物中的應(yīng)用，與現(xiàn)有脂代謝紊亂疾病治療藥物和技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。

進(jìn)一步的，一種藥物組合物，其特征在于：圍繞一種調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法、利用藥學(xué)上常規(guī)的載體或賦形劑或稀釋劑進(jìn)行的組合配方。

進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法在制備治療脂代謝紊亂疾病藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法，其特征在于通過調(diào)節(jié)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂解和脂肪酸氧化代謝的調(diào)節(jié)。

所述調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法，不僅能夠提高激素敏感酯酶HSL的磷酸化程度及活性，增強(qiáng)PPARα轉(zhuǎn)錄活性，而且能夠提高參與脂肪酸β氧化過程的酶的活性。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種通過篩選能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)的方法，其特征是以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度的變化為指證篩選能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂解和脂肪酸氧化代謝的調(diào)節(jié)。

所述的一種通過篩選能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)的方法，其特征是以調(diào)控Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的已知的調(diào)控蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)，通過設(shè)計(jì)、合成或者通過常規(guī)方法篩選能夠調(diào)控Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度的物質(zhì)，篩選過程中以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度的變化為篩選指證。

所述的能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，包括了能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化水平的大分子物質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂肪酸、維生素及其納米分子等；也包括了能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化水平的小分子物質(zhì)，例如，天然產(chǎn)物、化學(xué)合成或者化學(xué)改造的產(chǎn)物、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)分子等。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種通過引入模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因進(jìn)行表達(dá)，從而調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法。

所述的模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因，其特征是指人Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的第194位絲氨酸突變?yōu)樘於彼峄蛘吖劝彼岬娜薋as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白突變基因。上述模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因可用于基因治療。

在本發(fā)明的第四方面，提供了如上述的調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法在制備脂代謝紊亂疾病治療藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括了通過篩選獲得的能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)或者模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因單獨(dú)用于制備脂代謝治療藥物，或與現(xiàn)有的脂代謝治療藥物組成組合物，或與現(xiàn)有化學(xué)藥物治療、中藥治療、生物治療、物理治療等方法在脂代謝治療中聯(lián)合運(yùn)用。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法。

在本發(fā)明的第六方面，提供了如上述的調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化代謝的方法在制備脂代謝紊亂疾病治療藥物中的具體應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚地理解，下面根據(jù)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中：

圖1.FADD磷酸化上調(diào)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株中脂肪酸氧化代謝速度

圖1A.FADD磷酸化的細(xì)胞株中脂肪酸氧化速度增加。通過t-test進(jìn)行顯著性分析，*P<0.05。

圖1B.FADD磷酸化的細(xì)胞株中線粒體數(shù)量增多。標(biāo)尺＝500nm。

圖2.肥胖人與正常人、ob/ob肥胖小鼠與正常小鼠脂肪組織中FADD磷酸化水平比較

圖2A.取外科手術(shù)中正常人及肥胖人的白色脂肪組織制樣做Western Blot，檢測(cè)FADD磷酸化水平。

圖2B.取標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的20周齡大小的ob/ob小鼠及正常對(duì)照小鼠的白色脂肪組織制樣做Western Blot，檢測(cè)FADD磷酸化水平。

圖3.FADD磷酸化對(duì)ob/ob肥胖小鼠體重及脂肪含量的影響

圖3A.上：標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的20周齡大小的ob/ob小鼠及FADD磷酸化的ob/ob小鼠照片；下：ob/ob小鼠及FADD磷酸化的ob/ob小鼠的肝臟及附睪脂肪照片。

圖3B.左：標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的ob/ob小鼠及FADD磷酸化的ob/ob小鼠體重生長(zhǎng)曲線；右：標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的ob/ob小鼠及FADD磷酸化的ob/ob小鼠每日進(jìn)食量。

圖3C.標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)下ob/ob小鼠及FADD磷酸化的ob/ob小鼠體內(nèi)各組織脂肪塊的重量：1.附睪；2.腎臟；3.腹股溝。

通過t-test進(jìn)行顯著性分析，*P<0.05，**P<0.01。

圖4.FADD磷酸化對(duì)正常小鼠體重及脂肪含量的影響

圖4A.左：標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的10周齡大小的正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠解剖照片；右：正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠的白色脂肪組織及肝臟組織照片。

圖4B.左：標(biāo)準(zhǔn)飲食或髙脂飲食喂養(yǎng)的正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠的體重生長(zhǎng)曲線；右：正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠單位體重每日進(jìn)食量：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖4C.左：髙脂飲食喂養(yǎng)下正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)各組織脂肪塊的重量占體重的百分比：1.附睪；2.腎臟；3.腹股溝。中：髙脂飲食喂養(yǎng)下正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)褐色脂肪組織塊的重量占體重的百分比：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。右：髙脂飲食喂養(yǎng)下正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)肝臟重量占體重的百分比：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖4D.核磁共振掃描正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)脂肪的分布。

圖4E.小鼠白色脂肪組織、褐色脂肪組織切片后進(jìn)行HE染色觀察各組織細(xì)胞大小及形態(tài)。肝臟組織切片后進(jìn)行油紅O染色觀察肝臟中甘油三酯的含量。

通過t-test進(jìn)行顯著性分析，**P<0.01，***P<0.001。

圖5.FADD磷酸化對(duì)小鼠各組織及血清甘油三酯等代謝指標(biāo)的影響

圖5A.髙脂飲食喂養(yǎng)的正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠肝臟及肌肉中甘油三酯的含量：1.肝臟；2.肌肉。

圖5B.髙脂飲食喂養(yǎng)的正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠血清中游離脂肪酸及甘油三酯的含量：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖5C.標(biāo)準(zhǔn)飲食或髙脂飲食喂養(yǎng)下正常對(duì)照小鼠及FADD磷酸化的小鼠血清中瘦素的含量：1.標(biāo)準(zhǔn)飲食；2.髙脂飲食。

通過t-test進(jìn)行顯著性分析，*P<0.05，**P<0.01。

圖6.FADD磷酸化對(duì)小鼠體內(nèi)甘油三酯的脂解速度的影響

圖6A.取禁食過夜的小鼠附睪白色脂肪組織塊，在基礎(chǔ)條件或者異丙腎上腺素的刺激下每隔兩小時(shí)測(cè)定甘油或者游離脂肪酸的釋放量，繪制脂解速度曲線圖。

圖6B.髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織中cAMP的含量：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖6C.取髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織制樣做Western Blot，檢測(cè)p-HSL,HSL和α-tubulin的蛋白表達(dá)量。右圖為對(duì)Western Blot結(jié)果的定量分析：1.HSL；2.p-HSL。

通過t-test進(jìn)行顯著性分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖7.FADD磷酸化對(duì)小鼠體內(nèi)脂肪酸的氧化速度的影響

圖7A.從髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織中分離白色脂肪細(xì)胞，利用脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒測(cè)定其脂肪酸氧化速度：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖7B.取髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織制樣做Western Blot，檢測(cè)PPARα的蛋白表達(dá)量。下圖是對(duì)Western Blot結(jié)果的定量分析：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠。

圖7C.取髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織,石蠟包埋切片，用PPARα的抗體做免疫組化分析(每組4只小鼠)，標(biāo)尺＝50μm。

圖7D.取高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織，檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。1.PPARα；2.Acox1；3.Ehhadh；4.Acadvl；5.Acadm；其中，白色為正常對(duì)照小鼠，深灰色為FADD磷酸化的小鼠；每組 4-6只小鼠，每個(gè)樣三個(gè)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)；

圖7E.取髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪組織制樣做Western Blot，檢測(cè)脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括VLCAD，LCAD，MCAD和PTL，以α-tubulin作為內(nèi)標(biāo)：1.正常對(duì)照小鼠；2.ob/ob小鼠；3.FADD磷酸化的小鼠；4.FADD磷酸化的ob/ob小鼠；

圖7F.取髙脂飲食飼養(yǎng)的小鼠附睪白色脂肪細(xì)胞，進(jìn)行ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)試驗(yàn)，檢測(cè)PPARα(左)與FADD(右)與PPRE(過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件)調(diào)控區(qū)的結(jié)合能力：1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化的小鼠；通過t-test進(jìn)行顯著性分析，*P<0.05，**P<0.01。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

FADD磷酸化上調(diào)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株中脂肪酸氧化代謝速度

構(gòu)建FADD永久磷酸化(FADD-D，將191位絲氨酸突變成為天冬氨酸)和FADD永久非磷酸化(FADD-A，將191位絲氨酸突變成為丙氨酸)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株。培養(yǎng)細(xì)胞，用脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司)測(cè)定比較FADD磷酸化細(xì)胞株、FADD非磷酸化細(xì)胞株、野生型細(xì)胞株中脂肪酸氧化代謝速度，并用電鏡觀察三個(gè)細(xì)胞株中線粒體的形狀和數(shù)量。

脂肪酸氧化速度測(cè)定發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化細(xì)胞株中脂肪酸的氧化代謝速度顯著高于FADD非磷酸化細(xì)胞株和野生型細(xì)胞株，而FADD非磷酸化細(xì)胞株中脂肪酸氧化代謝速度與野生型細(xì)胞株無(wú)顯著差異(圖1A)。線粒體是能量代謝的主要場(chǎng)所，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的細(xì)胞株中線粒體的數(shù)量也高于FADD非磷酸化細(xì)胞株和野生型細(xì)胞株(圖1B)，說(shuō)明了FADD磷酸化細(xì)胞株中能量代謝更加活躍。

實(shí)施例2

比較肥胖人與正常人、ob/ob肥胖小鼠及正常小鼠脂肪組織中FADD磷酸化水平

人組織樣品制備：從醫(yī)院外科手術(shù)中獲得體重正常人群及肥胖人群的白色脂肪組織樣品，制樣進(jìn)行western blot分析其組織中FADD磷酸化的水平。

小鼠組織樣品制備：所有的實(shí)驗(yàn)小鼠都是在通風(fēng)無(wú)菌，恒溫恒濕的SPF級(jí)別環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖的。小鼠可以自由獲取水和飼料。ob/ob小鼠及正常對(duì)照小鼠各選4只，標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)小鼠，待其生長(zhǎng)到20周齡大小，處死小鼠解剖并取其白色脂肪組織制樣做western blot分析其組織中FADD磷酸化的水平。

Western Blot：組織在細(xì)胞裂解液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,250mM NaCl,50mM NaF,5mM EDTA,5mM磷酸甘油,1mM Na3VO4,1％NP40)中勻漿后12,000rpm離心，收集上清，并用Bradford方法檢測(cè)蛋白濃度。等量(約50μg)蛋白用12％的SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。然后用FADD的抗體進(jìn)行檢驗(yàn)。

FADD在細(xì)胞內(nèi)以非磷酸化及磷酸化兩種形式存在，用FADD抗體可以檢測(cè)到兩條條帶，其中上面那條的是磷酸化形式的FADD，下面那條是非磷酸化形式的FADD[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]。Western blot結(jié)果顯示，肥胖人白色脂肪組織中磷酸化形式的FADD條帶比正常人要弱(圖2A)；標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)的20周齡的ob/ob小鼠白色脂肪組織中磷酸化形式的FADD條帶明顯弱于正常對(duì)照小鼠(圖2B)。這些結(jié)果說(shuō)明磷酸化形式的FADD的表達(dá)水平降低可以導(dǎo)致小鼠或者人的肥胖，即磷酸化形式的FADD可以致小鼠或者人變瘦。

實(shí)施例3

Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)磷酸化對(duì)ob/ob肥胖小鼠體重及體內(nèi)脂肪含量的影響

所有的實(shí)驗(yàn)小鼠都是在通風(fēng)無(wú)菌，恒溫恒濕的SPF級(jí)別環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖的。小鼠可以自由獲取水和飼料。將FADD磷酸化的小鼠按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式與OB/ob小鼠交配繁殖[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]，獲得FADD磷酸化的ob/ob小鼠。通過PCR方法進(jìn)行基因型的鑒定。

每種基因型小鼠選6只，標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)小鼠，從小鼠6周開始，每周稱量小鼠的體重，直到小鼠35周，繪制小鼠體重生長(zhǎng)曲線，并用代謝籠計(jì)算小鼠的每日進(jìn)食量。比較20周齡大小的ob/ob小鼠和FADD磷酸化的ob/ob小鼠的體型、附睪白色脂肪組織及肝臟大小。稱量比較小鼠附睪、腎臟、及腹股溝部位的白色脂肪塊的重量。

由于正常狀態(tài)下，F(xiàn)ADD以非磷酸化為主，磷酸化形式只在特定的生理及病理狀態(tài)下才存在。為了觀察FADD磷酸化對(duì)脂代謝的影響，本專利構(gòu)建了模擬FADD磷酸化的基因改造小鼠(將小鼠FADD基因191位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，以此模擬磷酸化的FADD，該種模型已經(jīng)為國(guó)際公認(rèn))[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:513-521]，并將該小鼠與OB/ob小鼠交配繁殖獲得FADD磷酸化的ob/ob小鼠。標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)的20周齡的FADD磷酸化的ob/ob小鼠體型明顯比ob/ob小鼠瘦，其附睪白色脂肪含量也明顯比ob/ob小鼠少，肝臟大小差不多，但是ob/ob小鼠的肝臟呈現(xiàn)出明顯的脂肪肝，而FADD磷酸化的ob/ob小鼠肝臟沒有脂肪肝現(xiàn)象(圖3A)。比較FADD磷酸化的ob/ob小鼠與ob/ob小鼠的體重生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD磷酸化的ob/ob小鼠體重生長(zhǎng)明顯低于ob/ob小鼠，并且與正常野生型小鼠相似，也就是說(shuō)，F(xiàn)ADD磷酸化可以逆轉(zhuǎn)ob/ob小鼠的肥胖表型(圖3B，左)。代謝籠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)盡管FADD磷酸化的ob/ob小鼠體重遠(yuǎn)比ob/ob小鼠低，但是每日進(jìn)食量還比ob/ob小鼠略高，說(shuō)明體重的降低不是因?yàn)檫M(jìn)食量的減少而引起的(圖3B，右)。本專利也檢測(cè)了小鼠體內(nèi)三個(gè)組織的白色脂肪塊重量，包括附睪、腎臟及腹股溝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的ob/ob小鼠體內(nèi)各組織白色脂肪塊的重量也明顯低于ob/ob小鼠(圖3C)，說(shuō)明FADD磷酸化可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)脂肪含量下降而引起小鼠體重的降低，逆轉(zhuǎn)了ob/ob小鼠的肥胖表型。

根據(jù)本實(shí)施例的結(jié)果，體內(nèi)實(shí)現(xiàn)“FADD蛋白的第194位絲氨酸突變?yōu)樘於彼帷钡鞍椎谋磉_(dá)可以逆轉(zhuǎn)肥胖表型，達(dá)到治療肥胖癥及肥胖相關(guān)代謝綜合征的目的。

從世界范圍來(lái)講，基因治療已進(jìn)入高速發(fā)展的快車道。無(wú)論是病毒載體還是非病毒載體轉(zhuǎn)入外源基因的方法已經(jīng)非常成熟，因此，通過基因治療手段在體內(nèi)進(jìn)行“FADD蛋白的第194位絲氨酸突變?yōu)樘於彼帷钡鞍椎谋磉_(dá)是非常簡(jiǎn)易、方便和經(jīng)濟(jì)的。

此外，由于FADD基因和蛋白在哺乳動(dòng)物當(dāng)中是高度保守的，人和小鼠FADD蛋白68％的氨基酸殘基完全相同，在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)上同源程度高達(dá)80％，在其他哺乳動(dòng)物(包括人)中FADD也具有類似的功能(Chinnaiyan AM等人，1995，Cell 81(4):505-512；Boldin MP等人，1995，J Biol Chem 270(14):7795-7798.)。

而且由實(shí)施例2中的結(jié)果(圖2A和2B)可知：肥胖人白色脂肪組織中磷酸化形式的FADD條帶比正常人要弱(圖2A)；標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)的20周齡的ob/ob小鼠白色脂肪組織中磷酸化形式的FADD條帶明顯弱于正常對(duì)照小鼠(圖2B)。這些結(jié)果說(shuō)明磷酸化形式的FADD的表達(dá)水平降低可以導(dǎo)致小鼠或者人的肥胖，即磷酸化形式的FADD可以致小鼠或者人變瘦。

因此，再結(jié)合本實(shí)施例的結(jié)果，可以肯定通過上調(diào)FADD磷酸化來(lái)下調(diào)肥胖小鼠體內(nèi)脂肪含量及體重的方法同樣適用于其他哺乳動(dòng)物、尤其是人。

實(shí)施例4

FADD磷酸化對(duì)正?；蛐托∈篌w重及體內(nèi)脂肪含量的影響

除了研究FADD磷酸化對(duì)ob/ob小鼠體重的影響，本發(fā)明還檢測(cè)了FADD磷酸化對(duì)正常野生型小鼠體重及體內(nèi)脂肪含量的影響。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]，獲得FADD磷酸化的小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，一組為同窩正常對(duì)照小鼠，一組為FADD磷酸化的小鼠。通過PCR方法進(jìn)行基因型的鑒定。標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)斷奶的小鼠到10周齡大小，解剖小鼠，拍照，比較正常對(duì)照小鼠與FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)附睪脂肪含量及肝臟大小。另外，每種基因型小鼠各選6只，標(biāo)準(zhǔn)飲食或者髙脂飲食飼養(yǎng)小鼠，從小鼠5周開始，每周稱量小鼠的體重，直到小鼠20周，繪制小鼠體重生長(zhǎng)曲線，并用代謝籠計(jì)算小鼠的每日進(jìn)食量。檢測(cè)比較高脂喂養(yǎng)的20周齡的小鼠附睪、腎臟、及腹股溝部位的白色脂肪塊的重量及褐色脂肪占體重的比例。利用核磁共振儀(Bruker Medical，Germany)掃描小鼠體內(nèi)脂肪分布。取小鼠白色脂肪組織、褐色脂肪組織，在10％的磷酸緩沖福爾馬林中，石蠟包埋后，切成5μm厚度的薄片，并對(duì)白色脂肪組織及褐色脂肪組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色，顯微鏡下觀察比較各細(xì)胞的大小及形態(tài)變化。取小鼠肝臟組織，快速冰凍切片，并對(duì)冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，比較肝臟組織中甘油三酯的含量。

與實(shí)施例3類似，F(xiàn)ADD磷酸化同樣可以使正常小鼠變瘦。與正常小鼠相比，F(xiàn)ADD磷酸化的小鼠附睪脂肪含量顯著減少(圖4A),體重生長(zhǎng)速度也明顯低于正常對(duì)照小鼠(圖4B，左)；代謝籠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)盡管FADD磷酸化的小鼠體重遠(yuǎn)低于正常對(duì)照小鼠，但是單位體重每日進(jìn)食量甚至于高于正常對(duì)照小鼠，說(shuō)明體重的降低不是因?yàn)檫M(jìn)食量的減少而引起的(圖4B，右)。本專利同樣檢測(cè)了小鼠體內(nèi)三個(gè)組織的白色脂肪塊重量，包括附睪、腎臟及腹股溝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠體內(nèi)各組織白色脂肪塊的重量也明顯低于正常對(duì)照小鼠(圖4C，左)，褐色脂肪含量也顯著下降(圖4C，中)，而肝臟大小變化不大(圖4C，右)。核磁共振掃描發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠不管是皮下脂肪還是內(nèi)臟脂肪均顯著低于正常對(duì)照小鼠(圖4D)。組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠白色脂肪細(xì)胞及褐色脂肪細(xì)胞均顯著小于正常對(duì)照小鼠；肝臟油紅O染色結(jié)果也表明FADD磷酸化的小鼠肝臟中甘油三酯的含量顯著低于正常對(duì)照小鼠(圖4E),這些結(jié)果說(shuō)明FADD磷酸化可以抑制髙脂飲食或年齡增長(zhǎng)引起的小鼠肥胖。

實(shí)施例3和實(shí)施例4的結(jié)果說(shuō)明FADD磷酸化不僅可以使ob/ob肥胖小鼠變瘦，還可以抑制髙脂飲食或年齡增長(zhǎng)引起的正?；蛐托∈蟮姆逝郑虼?，可以以FADD磷酸化程度的變化為指證，篩選能夠提高FADD磷酸化的物質(zhì)的方法來(lái)進(jìn)行肥胖癥及相關(guān)代謝綜合征的治療。這些物質(zhì)主要包括能夠提高FADD蛋白磷酸化水平的大分子物質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂肪酸、維生素及其納米分子等；也包括了能夠提高FADD磷酸化水平的小分子物質(zhì)，例如，天然產(chǎn)物、化學(xué)合成或者化學(xué)改造的產(chǎn)物、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)分子等。再結(jié)合實(shí)施例2的結(jié)果，以上方法對(duì)人同樣適用。

實(shí)施例5

FADD磷酸化對(duì)小鼠各組織及血清內(nèi)甘油三酯等代謝指標(biāo)的影響

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]，獲得FADD磷酸化的小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，一組為同窩正常對(duì)照小鼠，一組為FADD磷酸化的小鼠。通過PCR方法進(jìn)行基因型的鑒定。小鼠高脂喂養(yǎng)。肌肉和肝臟組織中的甘油三酯和膽固醇含量分別用甘油三酯檢測(cè)試劑盒(上海盈公生物技術(shù)有限公司)、膽固醇檢測(cè)試劑盒(上海必優(yōu)生物科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。血清中游離脂肪酸含量、甘油三酯含量分別用游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒及甘油三酯檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自Sigma公司)進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。血清中的瘦素水平通過懸液芯片進(jìn)行檢測(cè)(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)。

為了進(jìn)一步研究FADD磷酸化對(duì)脂代謝的影響，本專利還進(jìn)一步檢測(cè)了肝臟及肌肉組織中的甘油三酯含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠肝臟及肌肉組織中甘油三酯的含量顯著小于正常對(duì)照小鼠(圖5A，左)，F(xiàn)ADD磷酸化的小鼠肝臟中膽固醇含量稍低于正常對(duì)照小鼠，肌肉中膽固醇二者含量相當(dāng)(圖5A，右)。高脂喂養(yǎng)后，F(xiàn)ADD磷酸化的小鼠血清中游離脂肪酸及甘油三酯的含量顯著低于正常對(duì)照小鼠(圖5B)，血清中瘦素的含量也顯著低于正常對(duì)照小鼠(圖5C)。這些結(jié)果表明FADD磷酸化促進(jìn)了甘油三酯的分解。FADD磷酸化小鼠血清中游離脂肪酸濃度也下降，說(shuō)明了FADD磷酸化可能也促進(jìn)了脂肪酸的氧化代謝。

實(shí)施例6FADD磷酸化對(duì)小鼠體內(nèi)甘油三酯的脂解速度的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠：按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]，獲得FADD磷酸化的小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，一組為同窩正常對(duì)照小鼠，一組為FADD磷酸化的小鼠。通過PCR方法進(jìn)行基因型的鑒定。

脂解速度測(cè)定：取小鼠白色脂肪塊，制備組織勻漿，利用游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒(Sigma)及甘油檢測(cè)試劑盒(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司)在不同時(shí)間點(diǎn)(0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí))分別測(cè)定基礎(chǔ)狀態(tài)下或者刺激條件(加100nM異丙腎上腺素)下游離脂肪酸、甘油濃度，然后繪制脂解速度圖。

cAMP含量測(cè)定：cAMP含量用競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)(R&D)進(jìn)行測(cè)定。

Western Blot：Western blot實(shí)驗(yàn)方法參見實(shí)施例2，分別用HSL、phospho-HSL的抗體進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)Western Blot圖進(jìn)行Image J灰度掃描并進(jìn)行定量分析。

數(shù)據(jù)分析：所有的數(shù)據(jù)結(jié)果都表示成平均值±SEM。用Prism software(GraphPad,San Diego,CA)中的two-tailed Student’s t-test進(jìn)行兩種基因型之間的差異性分析。當(dāng)P值小于0.05時(shí)被認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

白色脂肪組織是脂代謝的主要場(chǎng)所。為了研究FADD磷酸化對(duì)甘油三酯的代謝影響，本發(fā)明觀察了小鼠白色脂肪組織的脂解速度。不論在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是在異丙腎上腺素刺激下，F(xiàn)ADD磷酸化的小鼠白色脂肪組織中的甘油三酯分解速度均顯著高于正常對(duì)照小鼠(圖6A)。cAMP是經(jīng)典脂解信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，本發(fā)明繼續(xù)檢測(cè)了白色脂肪組織中的cAMP含量，結(jié)果表明FADD磷酸化的小鼠白色脂肪組織中cAMP含量明顯高于正常對(duì)照小鼠(圖6B)。cAMP會(huì)促進(jìn)下游的激素敏感酯酶HSL的磷酸化，磷酸化的HSL被活化從而促進(jìn)甘油三酯的分解。因此，本專利繼續(xù)觀察了HSL的磷酸化水平是否受到FADD磷酸化的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)ADD磷酸化的小鼠白色脂肪組織中HSL的磷酸化水平明顯高于正常對(duì)照小鼠(圖6C)，說(shuō)明HSL被活化，促進(jìn)了甘油三酯的分解，這與前面我們觀察到的FADD磷酸化加速了甘油三酯的分解現(xiàn)象一致。這些結(jié)果表明，F(xiàn)ADD磷酸化增加了白色脂肪組織中cAMP含量，激活了脂解信號(hào)通路，促進(jìn)了甘油三酯的分解，降低了體內(nèi)脂肪的含量，導(dǎo)致小鼠體重變低，這與前面我們觀察到的結(jié)果吻合。

實(shí)施例7FADD磷酸化對(duì)小鼠體內(nèi)脂肪酸的氧化速度的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠：按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]，獲得FADD磷酸化的小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，一組為同窩正常對(duì)照小鼠，一組為FADD磷酸化的小鼠。通過PCR方法進(jìn)行基因型的鑒定。

脂肪酸氧化速度測(cè)定：小鼠髙脂飲食飼養(yǎng)。取小鼠白色脂肪組織，膠原蛋白酶消化組織，分離白色脂肪細(xì)胞，用脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司)測(cè)定比較FADD磷酸化小鼠及正常對(duì)照小鼠的脂肪酸氧化速度。

Western Blot：檢測(cè)方法同實(shí)施例2。

RNA提取及定量實(shí)時(shí)PCR：用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)處理組織后根據(jù)附帶的說(shuō)明書提取RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Otsu,Shiga,Japan)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)在ABI機(jī)器(Applied Biosystems,Foster City.CA,USA)上進(jìn)行。引物如下：PPARα：正向引物：5’-TCGCGGGAAAGACCAGCAACAA-3’；反向引物：5’-GCCAGGCCGATCTCCACAGC-3’；Acox1：正向引物：5’-CGCCGCCACCTTCAATCCAGAG-3’；反向引物：5’-TCCAGGCCGGCATGAAGAAAC-3’；Ehhadh：正向引物：5’-TCCCCCACTACCATCGCCACAG-3’；反向引物：5’-ACCAAATCGCCCAGCTTCACAGAG-3’；Acadvl：正向引物：5’-CCCATGGGCTCCCTGAAAAGAAGA-3’；反向引物：5’-GGCCGCCTCCGAGCAAAAGAT-3’；Acadm：正向引物：5’-TCGCCCCGGAATATGACAAAA-3’；反向引物：5’-AGAACGTGCCAACAAGAAATACCA-3’；GAPDH：正向引物：5’-ACTGAGGACCAGGTTGTC-3’；反向引物：5’-TGCTGTAGCCGTATTCATTG-3’。所有的結(jié)果都是3次實(shí)驗(yàn)的平均值，以GAPDH作為內(nèi)參。

ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)：小鼠高脂喂養(yǎng)，取小鼠白色脂肪組織，膠原蛋白酶消化組織，分離白色脂肪細(xì)胞，用10厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)。

第一天：

1.棄培液后，沿壁加入3毫升冷的PBS，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使PBS充分沖洗細(xì)胞后，倒去PBS，用槍頭吸干凈。

2.每個(gè)皿加4毫升4％的多聚甲醛，混勻鋪滿皿后，在搖床上邊搖邊固定10分鐘。

3.直接在搖床上邊晃動(dòng)邊滴加1.25M的Glycine溶液，450微升/皿，繼續(xù)搖晃5分鐘。

4.倒去所有的液體，用冷的PBS洗兩次，每次至少3毫升，再用1毫升PBS 刮收細(xì)胞。3000rpm，離心5分鐘收集細(xì)胞。PBS再洗一遍，棄盡上清。

5.每管加100微升Nuclei Lysis Buffer(PI 1：100)，吹散細(xì)胞后冰上放10分鐘。

6.每管再加900微升IP dilution Buffer(PI 1：100)，準(zhǔn)備好冰水混合物，開始超聲。

7.12000rpm，4度離心10分鐘，取上清加抗體(PPARα抗體或者FADD抗體)，抗體用量至少要2微克，4度垂直混合器上混合過夜。

第二天：

8.用fish sperm DNA封閉protein G，4度孵育2小時(shí)。

9.在樣品中加入封閉好的protein G之后，繼續(xù)在4度垂直混合器上孵育2小時(shí)。

10.5000rpm離心1分鐘，收集protein G。每個(gè)樣保存400的上清，之后用作對(duì)照，上清在-20度暫時(shí)保留。

11.其余的上清棄去，使用以下的buffer依次清洗protein G。清洗順序如下：

A.Low Salt Immune Complex Wash Buffer,洗一次

B.High Salt Immune Complex Wash Buffer,洗一次

C.LiCl Immune Complex Wash Buffer,洗一次

D.TE buffer，洗兩次。

12.配制新鮮的Elution Buffer(1％SDS，0.1M NaHCO3)

13.在每個(gè)管子里加入Elution Buffer 200微升，室溫下，在渦旋震蕩器上邊震蕩邊混合15分鐘，洗脫15分鐘后5000rpm離心1分鐘，吸取上清。之后再用200微升Elution Buffer再洗脫一遍，同樣是15分鐘，再離心收上清，把兩次的上清混合在一起后，總共400微升的洗脫產(chǎn)物。

14.這時(shí)每個(gè)樣都有400微升的洗脫上清了，還有之前保留的400微升的對(duì)照上清，接下來(lái)兩批樣同時(shí)平行處理。

15.每個(gè)樣加16微升5M NaCl，65度水浴孵育4小時(shí)，然后就可以凍-20度，待用。

第三天：

16.樣品化凍以后，每個(gè)樣中加8微升0.5M EDTA，16微升1M Tris-HCl,PH6.5和4微升100×的proteinase K后，50度水浴孵育1小時(shí)。

17.每400微升的樣品中加入280微升飽和NaCl，與700微升的氯仿，混合均勻。

18.10000rpm，4度離心10分鐘，小心吸取上清至2毫升離心管中，每個(gè)樣加入20微克的魚精DNA作為載體DNA，混勻后開始提基因組。

19.加入1.3毫升的無(wú)水乙醇，在冰上放10分鐘后，可以微微看到白色的渾濁。20.12000rpm，4度離心10分鐘，小心吸去上清后，沉淀用75％的乙醇洗樣晾干。

21.用20微升的DDW溶解沉淀后，進(jìn)行PCR。PCR引物：CPT1b,5’-CCTGTGCTGGTCCCCAACTCACAGC-3’與5’-CTCCTGGTGACCTTTTCCCTACATT-3’(279bp)。

血清中游離脂肪酸主要來(lái)源于儲(chǔ)存在脂肪組織中的甘油三酯的分解。盡管FADD磷酸化的小鼠脂解速度增加，血清中游離脂肪酸濃度卻低于正常對(duì)照小鼠，因此我們推測(cè)FADD磷酸化的小鼠脂肪酸氧化速度也同樣增加。與我們推測(cè)的一致，本專利發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠白色脂肪組織中脂肪酸的氧化速度顯著高于正常對(duì)照小鼠(圖7A)，這與前面發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化的小鼠血清中游離脂肪酸含量低于正常對(duì)照小鼠結(jié)果吻合。PPARα對(duì)脂肪酸代謝具有重要調(diào)控作用，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、活化和β氧化。本發(fā)明還檢測(cè)了轉(zhuǎn)錄因子PPARα在脂肪組織中的表達(dá)，Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)均表明FADD磷酸化的小鼠脂肪組織中PPARα的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常對(duì)照小鼠(圖7B和7C)。PPARα的表達(dá)增加會(huì)激活其調(diào)控的參與脂肪酸氧化代謝的靶基因的表達(dá)。與此一致，本專利發(fā)現(xiàn)FADD磷酸化小鼠白色脂肪組織中PPARα及幾個(gè)參與脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵酶的mRNA水平表達(dá)增加，包括過氧化物酶?；o酶A氧化酶1(Acox1)、三羥酰輔酶A脫氫酶(Ehhadh)、極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶(Acadvl)和中鏈?；o酶A脫氫酶(Acadm)(圖7D)。Acadvl、Acadm、長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶(Acadl)、過氧化物酶3-酮脂酰CoA硫解酶(PTL)蛋白表達(dá)水平也顯著提高(圖7E)。這些酶的高表達(dá)促進(jìn)了脂肪酸氧化速度的上調(diào)。為了進(jìn)一步考察PPARα的轉(zhuǎn)錄活性及對(duì)脂肪酸氧化速度的調(diào)控，本專利還利用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PPARα對(duì)脂肪酸代謝途徑中重要的酶之一肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1b(CPT1b)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD磷酸化可以促進(jìn)PPARα結(jié)合到CPT1b基因調(diào)控區(qū)的PPRE元件上去，增強(qiáng)了CPT1b基因的表達(dá)，促進(jìn)了脂肪酸的氧化代謝(圖7F)。

FADD的磷酸化可以增加脂肪組織中cAMP的濃度，激活了經(jīng)典脂解通路，增強(qiáng)了HSL的磷酸化水平，促進(jìn)了甘油三酯分解為游離脂肪酸及甘油。FADD磷酸化還可以增強(qiáng)PPARα的轉(zhuǎn)錄水平，從而增加了PPARα調(diào)控的參與脂肪酸代謝的酶的表達(dá)，促進(jìn)了脂肪酸的氧化代謝。因此，本發(fā)明FADD磷酸化為治療包括肥胖在內(nèi)的脂代謝疾病提供了一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)。利用FADD磷酸化水平作為篩選標(biāo)志就可以獲得可以調(diào)控FADD磷酸化的物質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂代謝的藥物。

本發(fā)明通過轉(zhuǎn)入一個(gè)模擬FADD磷酸化的FADD突變基因，直接實(shí)現(xiàn)了對(duì)激素敏感酯酶(HSL)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶?；o酶A氧化酶1(Acox1)、三羥酰輔酶A脫氫酶(Ehhadh)、極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶(Acadvl)、長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶(Acadl)和中鏈?；o酶A脫氫酶(Acadm)這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或酶的表達(dá)的調(diào)控，從而有效地調(diào)節(jié)了脂代謝速度。因此，模擬FADD磷酸化的FADD突變基因的基因治療必然成為調(diào)節(jié)脂代謝疾病的一種有效手段。

因此，通過FADD磷酸化調(diào)節(jié)脂解和脂肪酸氧化速度的方法能夠直接應(yīng)用于脂代謝疾病治療藥物的發(fā)現(xiàn)、制備，和治療。該方法并且能夠與現(xiàn)有化學(xué)藥物治療、中藥治療、生物治療、物理治療等脂代謝治療方法聯(lián)合運(yùn)用，產(chǎn)生更好的治療效果。