專利名稱：一種利用脂肪酰acp還原酶生物合成脂肪醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及改造異養(yǎng)微生物自身脂肪酸代謝途徑從而生產(chǎn)脂肪醇的方法。
背景技術(shù)：
脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆劑用表面活性劑的原料之一,在洗漆劑、護(hù)膚品、化妝品、藥品中有大量運(yùn)用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經(jīng)磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開發(fā)利用來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，水解所得脂肪酸再還原為醇，統(tǒng)稱為天然脂肪醇。石油化學(xué)工業(yè)發(fā)展后，以石油產(chǎn)品為原料，生產(chǎn)的脂肪醇稱為合成脂肪醇。全世界總的脂肪醇消費(fèi)量大約在250萬噸左右。至20世紀(jì)末，天然醇與合成醇的比例大致為4. 9 5.1。近年來由于石油原料價(jià)格持續(xù)高漲，加上美洲和亞洲地區(qū)對(duì)脂肪醇的需求增加，以及人們對(duì)天然原料脂肪醇的偏好， 增加了對(duì)天然脂肪醇的需求。脂肪醇的價(jià)格已高達(dá)2000美元每噸，目前全球有許多國家依然需要依靠進(jìn)口滿足脂肪醇的需求。但是依靠石油產(chǎn)品為原料的脂肪醇也大量消耗石油的儲(chǔ)備量，在資源日益稀缺的今天，這種發(fā)展方式將會(huì)逐漸淘汰，因此，需要一種更環(huán)保、可再生的生產(chǎn)方式。如果能夠通過在改造后的脂肪酸代謝通路中異源表達(dá)脂肪醇合成酶，即脂肪酰載體蛋白還原酶，即可以通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000 年純化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并證明
該基因-jojoba far能將脂肪酸還原成為脂肪醇,該工作發(fā)表在“Plant Physiology”
(James G. Metz, Michael R. Pollard 1，LanaAndersonj Thomas R. Hayes, and MichaelW.Lassner. 2000. Purification of ajojoba embryo fatty acyl-Coenzyme A reductaseand expression ofits cDNA in high erucic acid rapeseed. Vol.122:635 - 644)。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的藍(lán)細(xì)菌Syn-LY2菌株中分別表達(dá)了來自于jojoba，鼠，擬南芥等的脂肪酰輔酶A還原酶FAR，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)jojoba及其中一種擬南芥FAR的藍(lán)細(xì)菌能夠合成脂肪醇，而異源表達(dá)其他的幾種FAR的藍(lán)細(xì)菌不能產(chǎn)生脂肪醇。該工作發(fā)表在 “Metabolic Engineering，，上(Tan X，Yao L，Lu X. et al. 2010. Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons incyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。劉天里教授等人開發(fā)了一個(gè)“cell free”體系，將脂肪酸代謝途徑中的限速步驟進(jìn)行了研究，指導(dǎo)如何提高微生物體內(nèi)的脂肪酸含量，該工作發(fā)表于“Metabolic Engineering” (Tiangang Liu，HarmitVorajChaitan Khosla. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acidbiosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering 12:378 - 386)。2011 年，石開究人員克隆并鑒定了一個(gè)參與單子葉植物水稻花藥及花粉外壁發(fā)育的脂肪?；d體蛋白還原酶DPW，研究揭不，DPW蛋白定位于質(zhì)體中，重組蛋白可以脂肪酉先基載體蛋白為底物，將碳十六脂肪酸還原為其相應(yīng)的脂肪醇，從而參與花藥及花粉外壁的合成，并且通過遺傳互補(bǔ)等實(shí)驗(yàn)證明DPW在雙子葉植物擬南芥中具有保守的生物學(xué)功能(Shi J, Tan H，YuXH，Liu Y，Liang Wj Ranathunge K，et al. Defective pollen wall is required foranther and microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrierprotein reductase.The Plant cell 2011;23:2225-46)。 2010 年，Andreas Schirmer等在Science上發(fā)表一項(xiàng)工作，其中證明了來自于藍(lán)細(xì)菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orfl594 (AAR 基因)和 PCC7942_orfl593 共表達(dá)可以產(chǎn)生脂肪烷烴(SchirmerA, Rude MAj Li X，Popova Ej del Cardayre SB. Microbial biosynthesis of alkanes.Science 2010;329:559-62)。脂酰載體蛋白還原酶基因便于進(jìn)行優(yōu)化，目前可以進(jìn)行遺傳操縱的微生物種類繁多，脂肪酸合成代謝途徑又是每種微生物生存的必需條件，并且目前的研究已經(jīng)對(duì)該條途徑認(rèn)識(shí)較為深刻，其限速步驟基本清楚，利于進(jìn)行改造。眾所周知，由于異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞生長迅速并且需要外源補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，這就便于通過補(bǔ)充培養(yǎng)基或者增加某些營養(yǎng)成分來提高其生產(chǎn)能力，使其在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。并且由于其必須依賴人工補(bǔ)給養(yǎng)料，所以可以嚴(yán)格控制其生產(chǎn)的各個(gè)階段，防止其肆意生長而造成無法控制的局面。目前工業(yè)上已經(jīng)有許多利用異養(yǎng)微生物生產(chǎn)發(fā)酵獲得產(chǎn)品的成功實(shí)例，利用脂酰載體蛋白還原酶基因在異養(yǎng)微生物體內(nèi)通過改造其自身代謝途徑生產(chǎn)脂肪醇有很大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，在異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)改造其脂肪酸代謝途徑以及表達(dá)外源蛋白以生產(chǎn)重要的化工原料一脂肪醇。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)氘愷B(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，并誘導(dǎo)表達(dá)。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白質(zhì)?；蛘呔幋aSEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為DPW基因和AAR基因。本發(fā)明所述異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。此外，本發(fā)明方法還包括通過改造異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞的代謝途徑或者根據(jù)其密碼子的偏愛性對(duì)脂酰載體蛋白還原酶基因進(jìn)行優(yōu)化，以提高脂肪醇的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明方法還包括對(duì)轉(zhuǎn)化脂酰載體蛋白還原酶基因異養(yǎng)微生物進(jìn)行耐受性篩選，獲得優(yōu)勢菌株，從而提高脂肪醇的產(chǎn)量。其中，所述改造的異養(yǎng)微生物代謝途徑是該微生物體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑，包括提高脂肪酸產(chǎn)量或者降低脂肪酸產(chǎn)量用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑，例如在大腸桿菌中導(dǎo)入PMSD8質(zhì)粒,過量表達(dá)fatty acetyl-CoA carboxylase,提高用以生產(chǎn)脂肪醇的脂肪酸含量；改變該微生物體內(nèi)脂肪酸代謝途徑中間物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑，例如敲除大腸桿菌中的fadE基因以積累更多脂肪酸代謝途徑中間物的脂肪酰載體蛋白，從而獲得更多的脂肪醇；改變該微生物體內(nèi)脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。其中，所述的菌種改造包括利用脂肪醇耐受性篩選改造獲得的耐受型菌株。
本發(fā)明還提供一種異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞，其是轉(zhuǎn)化脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。以及通過上述改造途徑得到的優(yōu)選異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白質(zhì)?；蛘呔幋aSEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選為DPW基因和AAR基因。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在異養(yǎng)微生物中引入外源基因改造其自身的脂肪酸代謝途徑以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工業(yè)原料脂肪醇的目的，不需要通過過多的化學(xué)合成反應(yīng)，減少了環(huán)境的污染，也減少了對(duì)石油儲(chǔ)量的消耗。同時(shí)，由于大部分異養(yǎng)微生物生長速度快，便于進(jìn)行遺傳操作，其抗污染性能優(yōu)異，且人工可以調(diào)節(jié)其生長速度和防止其肆意生長破壞環(huán)境，種種因素表明改造異養(yǎng)微生物進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)是切實(shí)可行的。


圖I為設(shè)計(jì)構(gòu)建的pRL108表達(dá)載體示意圖。圖2為設(shè)計(jì)構(gòu)建的pFASR表達(dá)載體示意圖。圖3為大腸桿菌RL6經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ；C16:0 表不 hexadecanol。圖4為大腸桿菌RL7經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖5為大腸桿菌RL8經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖6為大腸桿菌RL9經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖7為大腸桿菌RLlO經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖8為大腸桿菌RLll經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖9為大腸桿菌RL12經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖10為大腸桿菌RL13經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖11為大腸桿菌RL14經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖12為大腸桿菌RL15經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖13為大腸桿菌RL16經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖14為大腸桿菌RL17經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪醇提取后的GC-MS結(jié)果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖15為大腸桿菌RL15和RL17經(jīng)分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)后的結(jié)果。 圖16基因敲除質(zhì)粒pRL103上下游PCR擴(kuò)增示意圖。圖17基因敲除菌RL100構(gòu)建示意圖。圖18為挑取的疑似正確的重組菌RL100進(jìn)行的PCR驗(yàn)證結(jié)果圖，其中泳道f 10是挑取的不同菌，3、4、6、7、9為經(jīng)PCR驗(yàn)證的RL100重組菌，marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的通過以下措施來達(dá)到在異養(yǎng)微生物體內(nèi)弓丨入外源基因——脂肪酰載體蛋白還原酶，從而催化自身的脂肪酰載體蛋白還原形成脂肪醇。引入的脂肪酰載體蛋白還原酶還原酶就是來源于水稻的DPW基因和來源于藍(lán)細(xì)菌PCC7942的AAR基因。大腸桿菌作為異源微生物的一種，遺傳操作背景清楚，生長速度快，培養(yǎng)條件溫和，是進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的首選菌株之一，實(shí)施例中選用一種大腸桿菌BL21 (DE3)或MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA作為生產(chǎn)菌株，選取其表達(dá)質(zhì)粒pET28，并將其改造為可以表達(dá)DPff基因的pRL108載體和可以表達(dá)AAR基因的pFASR載體。以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I將已公布的DPW基因序列(SEQ ID No. 1，由金斯瑞生物科技有限公司合成)，并通過EcoR I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將其克隆于pET28載體上，構(gòu)建好的質(zhì)粒被命名為pRL108o將BL21 (DE3)中的脂酰載體蛋白脫氫酶fadE基因敲除，可以減少脂肪酰輔酶A的消耗，從而積累更多的脂肪酰載體蛋白和脂肪酰載體蛋白用于生產(chǎn)脂肪醇。該實(shí)例中將敲除fadE基因的大腸桿菌BL21(DE3)命名為TL101。將TL101中的脂肪酰輔酶A合成酶fadD基因敲除，可以中斷脂肪酰輔酶A的形成，使細(xì)胞體內(nèi)只合成脂肪酰載體蛋白。該實(shí)例中按照同源重組的原理，構(gòu)建一敲除質(zhì)粒用于敲除TL101中的fadD基因。通過兩條引物 pRLl-S(TTAAGCATGC GAAGATTTTA CTGCGGATAT T (Sph I ))和 pRLl-AS(ATATGGATCCGCGTTAAGTC AGTCGTC(BamH I ))PCR擴(kuò)增一段Ikb左右的左臂——即fadD基因的上游序列，通討另兩備引物 DRL2-S(ATATGGATCC TTCTTCACCT CTAAAATGCG T(BamH I ))和
PRL2-AS (ATATGAGCTC GATGAAAACG GTATCTGGC (Sac I ))擴(kuò)增一段 Ikb 左右的右臂-即
fadD基因的下游序列，將兩條基因序列拼接并克隆于溫敏質(zhì)粒PMAK705上，成功構(gòu)建敲除質(zhì)粒pRL103。將構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒PRL103導(dǎo)入大腸桿菌TLlOl感受態(tài)細(xì)胞，由于敲除質(zhì)粒PRL103上含有跟大腸桿菌基因組同源的序列，利用同源重組的原理，這段序列能跟大腸桿菌基因組上的fadD基因前后的相同序列發(fā)生兩次同源重組，從而可以敲除fadD基因。并且利用敲除質(zhì)粒PRL103的溫度敏感性質(zhì)進(jìn)行反復(fù)溫度改變培養(yǎng)，讓其既進(jìn)行重組又可以自行丟失，從而利用抗生素敏感試驗(yàn)篩選出疑似正確的重組菌。用兩條引物對(duì)(KS AAGCGAAACCCCATGACATC ；KAS :GTCGATGTGAACGGITTTC)進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證，由于在 RL100 中，fadD基因被敲除，因此其PCR片段比TL101PCR片段小約I. 7kb，恰好為fadD基因大小(圖18)。將在大腸桿菌TLlOl基礎(chǔ)上成功敲除fadD的大腸桿菌命名為RL100并進(jìn)行保種。John Cronan教授曾構(gòu)建的質(zhì)粒pMSD8可以在大腸桿菌中過量表達(dá)fatty acetyl-CoA carboxylase(Mark S.Davis, Jose' Solbiati, and John E.Cronan, Jr. 2000.Overproduction of Acetyl-CoA Carboxylase Activity Increases the Rate ofFatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli. THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY. 275(37) :28593-28598.)。在本實(shí)例中，本發(fā)明使用該質(zhì)粒提高脂肪醇的產(chǎn)量。用包含有十二醇(dodecanol)、十四醇(tetradecanol)和十六醇(hexadecanol)的LB培養(yǎng)基對(duì)TL101進(jìn)行脂肪醇耐受性篩選，從80mg/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度逐步增加到終濃度為I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)對(duì)TL101進(jìn)行篩選，最終在最高濃度為I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度的條件下連續(xù)進(jìn)行一周的篩選,將最終存活的細(xì)胞保種，并命名為RL101。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為 RL6。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA,利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL7。將PRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入TL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL8。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL9。將pRL108轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL100，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLlO。將pMSD8和pRL108共轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLlI。將RL6、RL8、RL10三種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5mLLB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)約12h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300mLLB培養(yǎng)基中在37°C繼續(xù)培養(yǎng)約90min后，待其OD達(dá)到0. 6時(shí)，加入0. 25mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)37°C培養(yǎng)12h后，再轉(zhuǎn)入30°C培養(yǎng)6小時(shí)。將RL7、RL9、RL11三種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5mLLB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)約12h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300mLLB培養(yǎng)基中在30°C繼續(xù)培養(yǎng)約120min后，待其OD達(dá)到O. 6時(shí)，加入O. 25mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)30°C培養(yǎng)18小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)18h后,取IOOmL培養(yǎng)物進(jìn)行fatty alcohols提取。RL6、RL8、RLlO的提取方法為向IOOmL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10mg/mL的碳十五醇作為內(nèi)參，使其終濃度為10mg/L，并加入2mL正癸烷。隨后加入200mL的有機(jī)液A(hexane: isopranol=3:2),劇烈萃取10分鐘后，靜置10分鐘，去除下層水溶液后，再加入ISOmL硫酸鈉溶液B，繼續(xù)劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為50°C水浴，壓力為50psi。待有機(jī)液體正己烷和異丙醇被蒸發(fā)完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，將溶有產(chǎn)物的正癸烷溶液其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。RL7、RL9和RLll提取方法為在IOOmL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol 作為內(nèi)參，再加入 200mT,的溶液 A(hexane: isopranol=3:2),劇烈萃取 IOmin后，靜置IOmin,去除下層水溶液后,再加入180mL的溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取lOmin，再靜置IOmin中，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500mL的圓底 燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為40°C水浴，壓力為250psi。待有機(jī)液體被蒸發(fā)完后，分別3次用3mL的正己烷溶解圓底燒瓶內(nèi)壁的產(chǎn)物，再將這9mL液體轉(zhuǎn)移到一個(gè)25mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。待有機(jī)層蒸發(fā)完畢后，用300 μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產(chǎn)物溶出，將其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。將處理好的樣品進(jìn)行GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測。GC-MS為安捷倫的5975C/7890A系統(tǒng)，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速lmL/min，進(jìn)樣量I μ L，分流比為10:1，RL6、RL8和RLlO的程序溫度為150°C 2分鐘，每分鐘升高5°C至240°C，保持5分鐘。RL7、RL9和RLll程序溫度為50°C 2min，每分鐘升高10°C至240°C，保持lOmin。實(shí)驗(yàn)結(jié)果六株菌中均產(chǎn)生了脂肪醇，產(chǎn)物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇和碳十八烯醇，在大腸桿菌RLll中產(chǎn)量達(dá)到最高，約為10. 5mg/L。該實(shí)例充分證明了利用DPW蛋白生產(chǎn)脂肪醇的可行性。實(shí)施例2將已公布的AAR基因序列經(jīng)優(yōu)化后進(jìn)行全合成(SEQ ID No. 3，由金維智生物科技有限公司合成)，并通過Nco I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將其克隆于pET28載體上，構(gòu)建好的質(zhì)粒被命名為PFASR。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL12。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入MG1655 (DE3) Λ RECA Λ ENDA，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLl3。將將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入TL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL14。將pFASR轉(zhuǎn)化進(jìn)入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL15。將pFASR和pMSD8共轉(zhuǎn)化進(jìn)入TLlOI，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RL16。將pFASR和pMSD8共轉(zhuǎn)化進(jìn)入RLlO I，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉(zhuǎn)化子，將其命名為RLl7。將以上六種菌分別接種于含有相應(yīng)抗生素的5mLLB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)約12h后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的300mLLB培養(yǎng)基中在30°C繼續(xù)培養(yǎng)約120min后，待其OD達(dá)到
O.6時(shí)，加入O. 25mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)30°C培養(yǎng)18小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)18h后,取IOOmL培養(yǎng)物進(jìn)行fatty alcohols提取。提取方法為在IOOmL培養(yǎng)物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol作為內(nèi)參，再加入200mL的溶液A (hexane:isopranol=3:2),劇烈萃取IOmin后，靜置IOmin,去除下層水溶液后，再加入180mL的溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取lOmin，再靜置IOmin中，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為40°C水浴，壓力為250psi。待有機(jī)液體被蒸發(fā)完后，分別3次用3mL的正己烷溶解圓底燒瓶內(nèi)壁的產(chǎn)物，再將這9mL液體轉(zhuǎn)移到一個(gè)25mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)。待有機(jī)層蒸發(fā)完畢后，用300μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產(chǎn)物溶出，將其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。將處理好的樣品進(jìn)行GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測。GC-MS為安捷倫的5975C/7890A系統(tǒng)，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速lmL/min，進(jìn)樣量I μ L，分流比為10:1，程序溫度為50°C 2min，每分鐘升高10。。至240°C，保持IOmin0挑取約為10個(gè)成功轉(zhuǎn)化子RLlOl/pFASR或RL101/pMSD8/pFASR培養(yǎng)于5mL的含有相應(yīng)抗生素的M9培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)入IOOOmL含有相應(yīng)抗生素M9培養(yǎng)基中繼續(xù)在30°C培養(yǎng)24小時(shí)后，將IOOOmL的菌液分批轉(zhuǎn)入無菌的80mL離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，最后將所有菌體用50mL含有相應(yīng)抗生素M9培養(yǎng)基懸浮均勻作為種子液上罐發(fā)酵，發(fā)酵的規(guī)模為4L。當(dāng)罐中OD長到6左右時(shí)，以0. 24mL/min的速率補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基，當(dāng)OD長到13左右時(shí)，加入終濃度0. 25mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后每隔4小時(shí)提取90mL的培養(yǎng)物用液氮迅速冷凍后，保存于_80°C冰箱。在補(bǔ)料前保持融氧為80%以上，補(bǔ)料后由于菌體大量生長融氧自然下降，盡量保持融氧較高。發(fā)酵產(chǎn)物提取脂肪醇方法將培養(yǎng)物從_80°C冰箱中取出，自然融化，向40mL培養(yǎng)物中加入40 μ L 100mg/mL的碳十五醇作為內(nèi)參，使其終濃度為100mg/L，并加入2mL正癸烷。隨后加入200mL的溶液A (heXane:iS0pran0l=3:2)，劇烈萃取10分鐘后，靜置10分鐘,去除下層水溶液后,再加入180mL硫酸鈉溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續(xù)劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)入500mL的圓底燒瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。條件為50°C水浴，壓力為50psi。待有機(jī)液體正己烷和異丙醇被蒸發(fā)完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，將溶有產(chǎn)物的正癸烷溶液其轉(zhuǎn)移入一個(gè)帶有內(nèi)置管的樣品瓶中。發(fā)酵產(chǎn)物脂肪醇檢測方法將提取好的樣品進(jìn)行GCMS (氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測，GCMS為安捷倫5975C/7890A系統(tǒng)。氣相色譜柱為HP-INNOwax柱，氦氣流速為lmL/min，分流比為10: I。進(jìn)樣量為I μ L0程序溫度為50°C 2分鐘，每分鐘升高10°C至240°C，保持10分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果六株菌中均產(chǎn)生了脂肪醇，產(chǎn)物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇、碳十六烯醇和碳十八烯醇。將大腸桿菌RL15和RL17進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明RL15的產(chǎn)量最高達(dá)到0. 8g/L，產(chǎn)率達(dá)到I. 6g/L/day，RL17的產(chǎn)量最高達(dá)到0. 65g/L，產(chǎn)率達(dá)到2gL/day。該實(shí)例充分證明了利用AAR蛋白生產(chǎn)脂肪醇的可行性，并且該蛋白有很大的工業(yè)化生產(chǎn)脂肪醇的潛力。 序列表說明SEQ ID No. I和2分別為DPff基因序列和蛋白序 列；SEQ IDNo. 3和4分別為經(jīng)優(yōu)化后的AAR基因序列和蛋白序列；SEQ ID No. 5&6是擴(kuò)增fadD左臂的引物；SEQID No. 7&8是擴(kuò)增fadD右臂的引物；SEQ ID No. 9&10是檢驗(yàn)為RLlOO陽性克隆的引物。
權(quán)利要求
1.一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞體內(nèi)，并使該基因在該宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，將脂肪酰載體蛋白還原酶基因克隆于表達(dá)載體上，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主體內(nèi)或插入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，并誘導(dǎo)表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括通過改造宿主細(xì)胞脂肪酸合成和降解的代謝途徑或者根據(jù)宿主細(xì)胞密碼子的偏愛性對(duì)脂肪酰載體蛋白還原酶基因進(jìn)行優(yōu)化，以提高脂肪醇的產(chǎn)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化脂肪酰載體蛋白還原酶 基因異養(yǎng)微生物進(jìn)行耐受性篩選，獲得優(yōu)勢菌株，從而提高脂肪醇的產(chǎn)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是該宿主細(xì)胞體內(nèi)的有關(guān)脂肪酸合成和代謝的相關(guān)途徑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是該宿主細(xì)胞體內(nèi)提高脂肪酸的產(chǎn)量或者降低脂肪酸的產(chǎn)量用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細(xì)胞代謝途徑是改變宿主細(xì)胞體內(nèi)脂肪酸代謝途徑中間物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，改造的異養(yǎng)微生物代謝途徑是改變該異養(yǎng)微生物體內(nèi)脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產(chǎn)脂肪醇的途徑。
11.一種異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞，其是接受轉(zhuǎn)脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的異養(yǎng)微生物，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因?yàn)閖/f基因或基因，其編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，該方法是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞體內(nèi)，并使該基因在該宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)，從而改造異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑以生產(chǎn)脂肪醇。本發(fā)明還進(jìn)一步通過代謝改造，提高脂肪醇的產(chǎn)量。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在微生物體內(nèi)通過生物合成的方法合成脂肪醇，該技術(shù)是一種可再生的、低消耗的技術(shù)，且這種環(huán)保的生產(chǎn)方式能夠減少對(duì)稀缺資源石油的消耗，也不需要再進(jìn)行化學(xué)改造就可以直接生產(chǎn)脂肪醇，在工業(yè)上有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102827880SQ201210330969
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者劉天罡, 劉然, 付愛思 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)