本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是利用大孔徑平行聚己內(nèi)酯電紡棉構(gòu)建自體組織工程血管。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的幾種血管移植替代物尚存在不具有生長(zhǎng)性、或異體組織易導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)等缺陷。因此，構(gòu)建具備生長(zhǎng)性，且有自體組織或細(xì)胞的新型組織工程血管具有重要意義。

一般地，構(gòu)建組織工程血管首先需要解決三個(gè)問(wèn)題：(1)組織支架，(2)種子細(xì)胞來(lái)源和(3)組織構(gòu)建方法。“組織支架”是細(xì)胞賴以粘附和生長(zhǎng)的環(huán)境。由于人工構(gòu)建的組織在形成初期尚缺乏植入細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，因此需要人為地為細(xì)胞提供附著的支架；從另一方面講，組織支架還決定了所構(gòu)建組織的最終形態(tài)、種子細(xì)胞的選擇及定植方法，因此，制備出合適的組織支架是組織工程血管構(gòu)建成功的關(guān)鍵。

在各種組織工程血管支架制備方法中，較普遍采用的是利用靜電紡技術(shù)制備出的纖維支架。將親細(xì)胞、可生物降解的高分子聚合材料，如聚己內(nèi)酯(PCL)，聚乳酸(PLA)等配制成一定濃度的溶液，裝入連接有微泵的注射器。從注射器針頭擠出的聚合物溶液在電場(chǎng)力的作用下會(huì)拉成細(xì)絲，并以一定的方式聚集于接收裝置，最終得到靜電紡纖維支架。

之前，發(fā)明人已就靜電紡纖維膜在構(gòu)建組織工程血管中的應(yīng)用進(jìn)行了探索，并建立了一種組織工程血管構(gòu)建方法：即以平滑肌，一種廣泛存在于大中血管中膜層的細(xì)胞作為種子細(xì)胞；將平滑肌細(xì)胞在體外預(yù)先種植在納米纖維電紡膜上，待細(xì)胞在其表面粘附生長(zhǎng)后，卷曲纏繞于圓柱管，再移植到動(dòng)物皮下形成血管狀組織。由于該方法類(lèi)似“三明治”的制作過(guò)程，因此也被稱(chēng)為“三明治夾心法”。

之所以采用這種“種子細(xì)胞體外種植-卷曲包裹-皮下移植”的構(gòu)建方式的原因是，我們先前研制出的納米級(jí)靜電紡纖維直徑細(xì)小、纖維之間排列致密緊實(shí)，因此直接皮下移植或血管原位移植后自體細(xì)胞難以長(zhǎng)入電紡膜內(nèi)部并實(shí)現(xiàn)電紡膜的組織化——這與Gore-Tex管道或牛頸靜脈管道移植后的結(jié)果無(wú)太大差別。然而，這還帶來(lái)了另外的問(wèn)題：(1)種子細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)擴(kuò)增的過(guò)程復(fù)雜，極易發(fā)生細(xì)胞污染、老化；(2)結(jié)合“三明治法”將載有種子細(xì)胞電紡膜卷曲移植后，種子細(xì)胞首先需要克服皮下?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足的環(huán)境，這帶來(lái)了構(gòu)建成功率低的問(wèn)題；(3)體外種植細(xì)胞還容易發(fā)生細(xì)胞流失。因此，利用上述“三明治法”較難構(gòu)建出滿意的組織工程血管。圖1展示了一例“三明治法”組織工程血管構(gòu)建失敗的案例，可見(jiàn)分層的、未組織化的材料。因此，需要從根本上改進(jìn)靜電紡支架的性質(zhì)。

本發(fā)明希望解決傳統(tǒng)方法紡出的靜電紡納米纖維膜細(xì)密緊實(shí)，細(xì)胞不易長(zhǎng)入的問(wèn)題。以PCL為基本原料的大孔徑、粗纖維PCL電紡棉及其在自體組織工程血管中的應(yīng)用目前還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有靜電紡纖維膜(即傳統(tǒng)“電紡膜”)技術(shù)中的不足，提供一種電紡棉。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種電紡棉的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一的目的是，提供一種組織工程支架的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種用于制備組織工程血管的電紡棉，所述的電紡棉為聚己內(nèi)酯電紡棉。

所述的電紡棉為大孔徑平行聚己內(nèi)酯電紡棉，電紡棉的孔徑為20μm～100μm。

所述的電紡棉為30～40％的聚己內(nèi)酯的三氟乙醇溶液通過(guò)靜電紡絲獲得的電紡棉。

所述的電紡棉通過(guò)如下方法制得：配置質(zhì)量體積比為35％的聚己內(nèi)酯的三氟乙醇溶液，然后以鏤空的滾筒為收集裝置進(jìn)行靜電紡絲，在短距離接收條件下獲得電紡棉。

為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的電紡棉在制備組織工程血管的支架的應(yīng)用。

一種組織工程血管支架，所述的組織工程血管支架為利用電紡棉構(gòu)建的管狀支架。

所述的電紡棉為大孔徑平行聚己內(nèi)酯電紡棉。

所述的組織工程血管支架的制備方法為：以圓柱體為內(nèi)支撐，將大孔徑聚己內(nèi)酯電紡棉沿同一方向包繞于圓柱體表面，制成組織工程血管支架。

所述的組織工程血管支架的制備方法為：配置質(zhì)量體積比為35％的聚己內(nèi)酯的三氟乙醇溶液，然后以鏤空四骨架滾筒為收集裝置進(jìn)行靜電紡絲獲得電紡棉，以橡膠圓柱管為內(nèi)支撐將電紡棉沿同一方向包繞于橡膠圓柱管表面，制成組織工程血管支架。

為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的組織工程血管支架在制備組織工程血管中的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、大孔徑聚己內(nèi)酯電紡棉具有良好的力學(xué)性能和細(xì)胞相容性，且有利于細(xì)胞快速長(zhǎng)入。

2、最終得到的組織工程血管組織細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源于自體，不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

3、平行排列的聚己內(nèi)酯電紡棉纖維引導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)定向環(huán)形排列，能模擬天然血管的組織學(xué)構(gòu)造。

附圖說(shuō)明

附圖1：以傳統(tǒng)電紡膜為支架材料，通過(guò)“三明治”法構(gòu)建組織工程血管。利用明膠/PCL(50:50,m/m)納米纖維電紡膜作為血管支架，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于電紡膜，并卷曲纏繞于圓柱管上(“三明治法”)，再移植到裸鼠皮下構(gòu)建組織工程血管。移植9個(gè)月后取材依然可見(jiàn)層疊的明膠/PCL電紡膜(B)，表明電紡膜未降解、組織形成差。組織切片HE染色(A，C和D)可見(jiàn)6層電紡膜相互分離，中間幾乎沒(méi)有細(xì)胞長(zhǎng)入。最外層的電紡膜在對(duì)稱(chēng)的兩個(gè)部位有少量細(xì)胞長(zhǎng)入(圖A黑色星號(hào)標(biāo)記區(qū)域)，分別為皮下緊貼皮膚和緊貼體壁的區(qū)域。由于這些部位血供充足，促進(jìn)了細(xì)胞長(zhǎng)入和部分移植細(xì)胞的存活。C圖放大顯示細(xì)胞長(zhǎng)入電紡膜的區(qū)域(對(duì)應(yīng)A圖實(shí)線方框部位)；D圖放大顯示電紡膜細(xì)胞長(zhǎng)入交界區(qū)域(對(duì)應(yīng)A圖虛線方框區(qū)域)。E圖為細(xì)胞長(zhǎng)入電紡膜區(qū)域的Masson染色，僅見(jiàn)下層少量藍(lán)染的膠原纖維。外層藍(lán)染部位為取材時(shí)未除盡的組織表面疏松結(jié)締組織。紅色箭頭指示第二層電紡膜下尚殘留的種子細(xì)胞核。標(biāo)尺：A＝1.0mm；C-E＝100μm。

附圖2：靜電紡PCL纖維膜(棉)的制備及其形態(tài)。10％PCL電紡絲用表面貼附有鋁箔的滾筒裝置接收最終得到細(xì)密的電紡絲(A)。電紡絲間緊密排列成PCL電紡膜(B)。透光可見(jiàn)PCL電紡膜細(xì)密緊實(shí)的結(jié)構(gòu)，肉眼難以觀察到纖維質(zhì)地(C)。35％PCL電紡絲用鏤空裝置接收后可得到排列取向一致的粗纖維(D)。這種纖維多層疊加后可得到結(jié)構(gòu)疏松的PCL電紡棉(E)，透光可見(jiàn)定向排列的粗纖維(F)。

附圖3：PCL電紡膜(棉)掃描電子顯微鏡觀察。傳統(tǒng)PCL納米纖維電紡膜(對(duì)照)及大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)掃描電子顯微鏡圖。在相同放大倍率條件下，PCL電紡膜纖維細(xì)小，纖維之間留出的孔洞很小(A，B)；而PCL電紡棉纖維粗，纖維之間形成的孔洞大(B，D)。標(biāo)尺：A,C＝100μm；B,D＝10μm。

附圖4：靜電紡纖維的排列及直徑分布特征。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件測(cè)量電鏡圖片中150根纖維相對(duì)平面坐標(biāo)x軸的成角及纖維直徑(A，B)。PCL納米纖維電紡膜(對(duì)照)的平均直徑約0.67±0.34μm，而大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)的直徑約3.90±1.85μm，其纖維直徑的頻數(shù)分布圖分別為C和D。

附圖5：PCL電紡膜(棉)的力學(xué)性能。材料在不同方向上收到拉力時(shí)具有不同的形態(tài)特征，也具有不同的可拉伸長(zhǎng)度(緊實(shí)PCL電紡膜：A和B，大孔徑PCL電紡棉：C和D)。用拉力機(jī)測(cè)量材料的在收到拉力條件時(shí)的受力情況，其單位面積上的受力用MPa為單位，相對(duì)測(cè)量前的原始長(zhǎng)度變化用百分?jǐn)?shù)表示，得到兩種材料在順纖維方向(E)和垂直纖維方向(F)的拉力-拉伸比例曲線。楊氏模量是評(píng)價(jià)材料順應(yīng)性的指標(biāo)，即受力-拉長(zhǎng)曲線上線性上升段的斜率。大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)在兩個(gè)方向上的楊氏模量均明顯小于傳統(tǒng)PCL電紡膜(對(duì)照)(G和H,*p<0.05.)。

附圖6：PCL電紡膜(棉)的親水角檢測(cè)。將5μL水滴于電紡膜(棉)，并分別檢測(cè)水滴在材料不同纖維延展方向上的親水角。滴加水滴后50s水滴于材料所成親水角顯示于圖A～D，每圖中右上角為檢測(cè)方向模式圖：A,C顯示檢測(cè)相機(jī)與材料纖維方向平行；B,D顯示材料與纖維方向垂直。每種材料不同方向上0s,20s和50s所成的親水角總結(jié)于圖E(*p<0.05)。

附圖7：人平滑肌細(xì)胞在PCL電紡膜(棉)上的生長(zhǎng)。人平滑肌細(xì)胞在PCL電紡膜(對(duì)照，A)和PCL電紡棉(本發(fā)明，B)體外培養(yǎng)6天后的細(xì)胞形態(tài)。C圖展示單個(gè)細(xì)胞在單根PCL電紡棉纖維上的生長(zhǎng)狀態(tài)(箭頭所指)。圖中細(xì)胞骨架均染成紅色，DAPI套染的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。PCL纖維自發(fā)綠色熒光。標(biāo)尺：A,B＝200μm，C＝100μm。

附圖8：無(wú)細(xì)胞電紡膜(棉)組織工程血管支架皮下移植前后大體觀。血管支架分別由傳統(tǒng)PCL電紡膜(對(duì)照)或大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)包繞于橡膠管制成(A和H)。血管支架作動(dòng)物皮下移植用于構(gòu)建具有自體組織的組織工程血管。其中緊密電紡膜血管支架皮下移植后4w(B,C和D)和6w(E，F(xiàn)和G)取材；對(duì)應(yīng)地，疏松電紡棉血管支架皮下移植后4w(I，J和K)和6w(L，M和N)后取材。最右側(cè)一欄顯示對(duì)應(yīng)移植物抽離橡膠管支撐物后的橫切面(D，G，K和N)。

附圖9：無(wú)細(xì)胞PCL電紡膜(棉)組織工程血管支架大鼠皮下移植4w后組織切片。無(wú)細(xì)胞緊實(shí)PCL電紡膜和無(wú)細(xì)胞大孔徑PCL電紡棉組織工程血管支架移植到大鼠皮下，4w后取材。電紡膜(對(duì)照組)冰凍切片HE染色可見(jiàn)電紡膜外層的結(jié)締組織包裹。電紡膜間無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)沉積(A和B)。Masson染色未見(jiàn)藍(lán)色的膠原纖維(C)。電紡棉(本發(fā)明)石蠟切片見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)入電紡膜全層，細(xì)胞外基質(zhì)開(kāi)始沉積(D和E)，Masson染色可見(jiàn)少量藍(lán)色的膠原纖維(F)。標(biāo)尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附圖10：電紡膜(棉)大鼠皮下移植6w形成血管組織切片。無(wú)細(xì)胞緊實(shí)PCL電紡膜和無(wú)細(xì)胞大孔徑PCL電紡棉組織工程血管支架移植到大鼠皮下，6w后取材。電紡膜(對(duì)照組)冰凍切片HE染色見(jiàn)電紡膜外包裹結(jié)締組織，電紡膜內(nèi)無(wú)自體細(xì)胞長(zhǎng)入，也無(wú)細(xì)胞外基質(zhì)沉積(A和B)。Masson染色僅見(jiàn)電紡膜外結(jié)締組織極少量的膠原沉積(C)。電紡棉(本發(fā)明)石蠟切片HE染色可見(jiàn)全層大量細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(D和E)，Masson染色見(jiàn)藍(lán)色膠原纖維沉積增多，細(xì)胞外基質(zhì)呈類(lèi)似天然血管壁的環(huán)向排列(F)。標(biāo)尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附圖11：組織工程血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物免疫熒光染色。用大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)構(gòu)建的組織工程血管(大鼠皮下4w)冰凍切片免疫熒光染色。每行圖片成一組，每組中細(xì)胞骨架被標(biāo)記為紅色熒光(A，E和I)，組織中大部分細(xì)胞SM22標(biāo)記物呈陽(yáng)性(B)，組織中負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)供給的新生血管管壁表達(dá)SMA或Calponin(F和J)。細(xì)胞核用DAPI套染為藍(lán)色(C，G和K)，每組圖片疊加結(jié)果分別為D，H和L。所有圖片標(biāo)尺＝50μm。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一、材料和方法

1動(dòng)物

150g雄性清潔級(jí)SD大鼠為本實(shí)驗(yàn)所涉及的動(dòng)物，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)操作均通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理小組審查批準(zhǔn)。

2儀器

3試劑和材料

4方法

4.1相關(guān)溶液的配制

(1)10％和35％聚己內(nèi)酯(PCL)靜電紡溶液

以TFE為溶劑，用電子天平稱(chēng)取PCL顆粒，按10％和35％(m/v)的溶質(zhì)比例稱(chēng)量后轉(zhuǎn)入溶解瓶。按1.386g/ml的密度用電子天平量取相應(yīng)體積的TFE轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)溶解瓶中。室溫下反復(fù)翻轉(zhuǎn)溶解瓶促進(jìn)PCL均勻溶解。持續(xù)翻轉(zhuǎn)溶解4d后用于靜電紡。配制好的溶液應(yīng)于1w內(nèi)用完。

(2)平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液

平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液以原裝High-glucose DMEM培養(yǎng)液一瓶為單位配制。以500ml/瓶High-glucose DMEM培養(yǎng)液為例，加入55ml胎牛血清(FBS)和5.5ml青霉素鏈霉素雙抗(PS)?；靹蚝笈涑珊?0％FBS和1％PS的High-glucoseDMEM平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液開(kāi)封配成后，置于4℃冰箱保存，應(yīng)于2w內(nèi)用完。

4.2靜電紡PCL纖維的制備

(1)粗纖維PCL電紡棉的制備(本發(fā)明)

用注射器吸取35％PCL靜電紡溶液，換14G平口點(diǎn)膠針頭。將注射器裝載于微量注射泵，并安置使之懸于鏤空四骨架滾筒接收裝置的上方。調(diào)節(jié)高度，使針尖與接收裝置之間的距離為6cm。將高壓電源地級(jí)端連接于滾筒接收裝置，電源高壓端夾于針頭金屬部分。調(diào)節(jié)高壓電源，使高壓輸出為16kV。調(diào)節(jié)微量注射泵注射速率為5ml/h。調(diào)節(jié)滾筒控制器，使?jié)L筒旋轉(zhuǎn)速率為2000rpm。靜電紡初期，由于出絲尚不穩(wěn)定，這部分電紡絲可搜集于滾筒一端。待出絲穩(wěn)定后，于滾筒中部接收電紡絲。接收過(guò)程中應(yīng)不斷緩慢左右移動(dòng)滾動(dòng)，使電紡絲在滾筒上以均勻的密度分布。

(2)傳統(tǒng)細(xì)纖維PCL電紡膜的制備(對(duì)照組材料)

參考我們之前制備納米纖維電紡膜的方法制備細(xì)密PCL電紡模：用注射器抽取10％PCL靜電紡溶液，換用18G平口點(diǎn)膠針頭。類(lèi)似PCL粗纖維的制備，以同樣的方式安裝于微量注射泵。以表面包裹有鋁箔的實(shí)心滾筒為接收裝置。調(diào)節(jié)針頭與滾筒間的接收距離為12cm，微量注射泵的注射速度為3ml/h，高壓電源電壓為12kV，滾筒轉(zhuǎn)速為2000rpm。收集到的電紡膜作為下列實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。

4.3PCL電紡膜(棉)的形態(tài)觀察

(1)大體觀察

分別觀察兩種不同的靜電紡纖維在收集裝置上的形態(tài)，注意纖維粗細(xì)，纖維之間排列的平行度等指標(biāo)。多層粗纖維PCL電紡棉層疊可以得到“大孔徑PCL電紡棉”(簡(jiǎn)稱(chēng)“電紡棉”，即本發(fā)明)；剝離下鋁箔表面聚集的纖維得到“傳統(tǒng)PCL電紡膜”(簡(jiǎn)稱(chēng)“電紡膜”，為本發(fā)明的對(duì)照組)。觀察電紡膜(棉)形態(tài)。

(2)掃描電子顯微鏡觀察和分析

將兩種PCL電紡膜(棉)置于真空冷凍干燥箱中干燥過(guò)夜。初步干燥后的電紡膜(棉)再經(jīng)過(guò)臨界點(diǎn)干燥、噴鍍金屬處理，置于掃描電子纖維鏡中觀察。得到的圖片用ImageJ 1.50i圖像分析軟件處理，隨機(jī)測(cè)量圖像中150根纖維相對(duì)平面坐標(biāo)x軸的角度和直徑，再統(tǒng)計(jì)角度分布、纖維直徑分布和纖維平均直徑等指標(biāo)(n＝3)。兩種材料的纖維直徑按平均直徑±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)差異性使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

4.4PCL電紡膜(棉)的力學(xué)檢測(cè)

用滾筒接收的PCL電紡膜(棉)纖維排列具有一定的取向特征，因此在分析其力學(xué)特征時(shí)，分順纖維方向力學(xué)特征和垂直纖維方向力學(xué)特征兩方面。按順纖維方向和垂直纖維方向?yàn)殚L(zhǎng)方形的長(zhǎng)，將電紡膜(棉)裁剪為10×40mm大小的長(zhǎng)方形片，分別測(cè)量其厚(每組材料n＝5)。測(cè)量時(shí)拉力機(jī)上下夾具夾住長(zhǎng)方形片每端各10mm，因此納入測(cè)量計(jì)量的纖維片長(zhǎng)、寬、高分別為：a＝20mm,b＝10mm,c＝游標(biāo)卡尺測(cè)量的厚度(mm)。拉力機(jī)啟動(dòng)后，將測(cè)量不同拉長(zhǎng)長(zhǎng)度下(l/mm)材料片所產(chǎn)生的拉力(f/kN)。

拉伸過(guò)程中，材料產(chǎn)生的拉力(壓強(qiáng))按下列公式計(jì)算：

$Stress\left(mPa\right)=\frac{f\left(kN\right)/1000}{b\left(mm\right)\&CenterDot;c\left(mm\right)}$

拉伸過(guò)程中，材料相對(duì)原始長(zhǎng)度的拉伸比例為：

$Strain\left(\%\right)=\frac{\mathrm{\&Delta;}l\left(mm\right)}{a\left(mm\right)}\&times;100\%$

拉伸過(guò)程中，“拉力-拉伸比例曲線”被用于衡量材料整體的變化，曲線線性上升段的斜率為材料的楊氏模量(Young’s modulus)，用于衡量材料對(duì)抗形變的能力(順應(yīng)性)。兩種材料的楊氏模量按“平均直徑±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，材料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

4.5PCL電紡膜(棉)的親水角檢測(cè)

親水角是檢測(cè)材料對(duì)某種液體親和性的方法。本研究中材料對(duì)水的親水角即材料與水的接觸角(contactangle)，后者是指氣、液、固三相交匯處所作的氣-液界面的切線與固-液交界之間的夾角。將上述經(jīng)真空冷凍干燥后的電紡膜(棉)按“纖維與攝像頭平行”或“纖維與攝像頭垂直”兩種放置方向分別置于親水角檢測(cè)儀上，再滴加純水水滴，記錄液滴接觸材料表面后0s，20s和50s的親水角(n＝5)。每次測(cè)量后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)親水角按“平均直徑±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每種材料不同放置方向上的親水角，材料間相同放置方向的親水角的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

4.6PCL電紡膜(棉)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

(1)材料準(zhǔn)備

分別裁剪合適大小的靜電紡膜(棉)置于6孔板內(nèi)(每組n＝3)，每個(gè)板孔用環(huán)形不銹鋼壓住材料四周，以免操作過(guò)程中材料在孔內(nèi)游走。以75％消毒酒精浸泡孔中的材料2h后，用滅菌蒸餾水洗滌3次。置于真空冷凍干燥箱內(nèi)凍干。臨用前于紫外燈下輻照表面滅菌30～60min。

(2)細(xì)胞準(zhǔn)備

取P2～4代人動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞。吸去培養(yǎng)皿中的平滑肌培養(yǎng)液，用PBS漂洗1～2次后，加入1ml胰酶/10cm培養(yǎng)皿。放置于37℃培養(yǎng)箱中消化2～3min。完成后加入3倍胰酶量的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，移入離心管。以1000rpm的速率離心5min。吸走上清液，再一定量的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

(3)細(xì)胞的種植

將(1)中處理后裝有兩種材料的6孔板用于平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞接種前預(yù)先在每孔中加入一定量的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液，使材料充分吸收培養(yǎng)液后，培養(yǎng)液可完全沒(méi)過(guò)材料。將重懸后的平滑肌細(xì)胞按5×10⁵/孔的密度緩慢均勻地滴加到每個(gè)孔中，靜置培養(yǎng)于含5％CO₂的37℃恒溫培養(yǎng)箱。每2d換液1次。

(4)細(xì)胞的熒光染色觀察

上述細(xì)胞接種培養(yǎng)6天后，吸走培養(yǎng)液，用PBS洗滌2～3次，再轉(zhuǎn)移至新的6孔板，避免原6孔板底部生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。用4％多聚甲醛固定30min。PBS漂洗2～3次。細(xì)胞骨架熒光染液與PBS按3.5:500(v/v)的比例配制并加入板孔中，于常溫染色30min，PBS漂洗3次。加入1:2000稀釋的DAPI染液套染細(xì)胞核10s，三蒸水漂洗3次。熒光顯微鏡鏡檢觀察。

5PCL電紡膜(棉)用于自體組織工程血管的構(gòu)建

5.1電紡膜(棉)組織工程血管支架的搭建

(1)大孔徑無(wú)細(xì)胞PCL電紡棉組織工程血管支架的搭建(本發(fā)明所述的組織工程血管支架)

粗纖維PCL電紡棉最初收集于鏤空四骨架滾筒。以橡膠圓柱管為內(nèi)支撐，將滾筒上的粗纖維沿同一方向包繞于橡膠管表面10圈，制成大孔徑無(wú)細(xì)胞PCL電紡棉組織工程血管支架。為了避免電紡棉纖維在纏繞后散開(kāi)，橡膠管兩端用7-0絲線固定。

(2)細(xì)密無(wú)細(xì)胞PCL電紡膜組織工程血管支架的搭建(對(duì)照)

類(lèi)似粗纖維組織工程血管支架的搭建方法。從鋁箔表面剝離細(xì)密靜電紡纖維膜，再纏繞于橡膠圓柱管表面10圈，制成細(xì)密無(wú)細(xì)胞PCL電紡膜組織工程血管支架。完成后兩端以7-0絲線固定。

5.2組織工程血管支架的動(dòng)物皮下移植和評(píng)價(jià)

移植前應(yīng)該按照上述細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中敘述的方法完成“75％乙醇消毒-蒸餾水沖洗-真空凍干-紫外滅菌的”的消毒滅菌步驟。同時(shí)，還應(yīng)該在移植前用含抗生素的生理鹽水浸泡。

以150g左右雄性SD大鼠為移植對(duì)象。稱(chēng)量待實(shí)驗(yàn)大鼠體重，以0.3ml/100g體重的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。待大鼠失去知覺(jué)后，用電動(dòng)剃刀剔除背部毛發(fā)。用絡(luò)合碘消毒手術(shù)部位及周?chē)?～5cm范圍內(nèi)的皮膚。以無(wú)菌紗布鋪單。切開(kāi)合適大小的皮膚，用止血鉗分離部分皮膚和皮下組織后，將包裹有電紡棉或電紡膜組織工程血管支架移植到皮下(每組n>3)。注意血管支架移植所在部位應(yīng)該遠(yuǎn)離皮膚切口。完成移植后用4-0帶線三角針縫合皮膚。用絡(luò)合碘消毒傷口3次。于手術(shù)完成后當(dāng)即，1d和2d肌肉注射抗生素預(yù)防感染。

5.3自體組織工程血管的評(píng)價(jià)

(1)大體觀察

組織工程血管支架大鼠皮下移植后4w和6w取材。過(guò)量麻醉處死大鼠后沿原手術(shù)切口剪開(kāi)皮膚。用止血鉗小心分離皮膚和皮下組織直至組織工程血管顯現(xiàn)。觀察組織工程血管組織與周?chē)M織的關(guān)系。完整剝離組織工程血管，抽出內(nèi)包裹的橡膠支撐，注意組織橫切面情況。用鑷子感受組織彈性。

(2)石蠟切片和染色

常規(guī)石蠟切片并染色，完成組織石蠟切片和HE染色、Masson三色染色。顯微鏡觀察切片部位血管組織形成情況。應(yīng)尤其注意組織深部是否有細(xì)胞長(zhǎng)入。

(3)冰凍切片平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物免疫熒光染色

常規(guī)冰凍切片和染色方法，以SM22，Calponin和SMA為平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物，并套染細(xì)胞骨架和細(xì)胞核，完成組織冰凍切片和染色。最后用熒光顯微鏡觀察拍照。

二、結(jié)果

1PCL電紡膜(棉)的制備

1ml濃度為35％的PCL溶液通過(guò)靜電紡絲并收集于鏤空滾筒上可以得到排列呈平行取向的粗纖維PCL電紡棉。光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)纖維彎曲如彈簧，大部分纖維排列取向一致。將鏤空骨架間的纖維沿同一方向繞于C形鐵絲兩臂之間，多層疊加后可得到結(jié)構(gòu)疏松的大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)。用3.5ml濃度為10％的PCL溶液通過(guò)靜電紡絲收集于實(shí)心滾筒上可得到細(xì)密的纖維。從鋁箔表面揭下收集到的纖維膜，即“傳統(tǒng)PCL電紡膜”(對(duì)照)，可明顯感受到細(xì)密的纖維堆積成的緊實(shí)結(jié)構(gòu)(圖2)。

2PCL電紡膜(棉)的掃描電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微鏡是觀察兩種電紡膜微觀結(jié)構(gòu)最有效的工具之一。在相同倍率條件下，10％PCL靜電紡溶液按照一定條件紡出的PCL電紡膜具有傳統(tǒng)電紡膜的特征：纖維細(xì)小(直徑約0.67±0.34微米)，且纖維間形成的孔洞小；相反，本研究用35％PCL靜電紡溶液在鏤空滾筒上接收到的PCL纖維絲粗大(直徑約3.90±1.85μm)，纖維架構(gòu)出的孔徑也明顯大于前者(約數(shù)十微米)。由于采用滾筒收集，因此兩種纖維排列還呈明顯的取向特征(圖3、圖4)

3PCL電紡膜(棉)的力學(xué)性能

由于PCL電紡膜(棉)的纖維具有一定的取向排列，因此，材料的拉伸性能可分為順纖維方向和垂直纖維方向兩種情況。(1)在順纖維方向上，材料在單位面積上所受的拉力與拉伸比例在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，之后出現(xiàn)一拐點(diǎn)，單位面積拉力隨材料拉長(zhǎng)而降低。纖維緊實(shí)的PCL電紡膜曲線拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)材料斷裂的時(shí)刻，因此拐點(diǎn)之后的曲線陡降至“0”MPa；而纖維疏松的PCL電紡棉在拐點(diǎn)之后其受力緩慢降低，實(shí)際表現(xiàn)為棉片纖維單根陸續(xù)斷裂，而非整體斷裂。(2)在垂直纖維方向上，在一定范圍內(nèi)兩種材料同樣存在拉力-拉長(zhǎng)比例的線性關(guān)系及拐點(diǎn)。然而，拐點(diǎn)的出現(xiàn)位置較順纖維方向上更低，離坐標(biāo)原點(diǎn)距離更遠(yuǎn)，表明纖維垂直方向具有更高的順應(yīng)性和更小的斷裂受力。值得注意的是，垂直方向的曲線形態(tài)呈鋸齒狀。楊氏模量是評(píng)價(jià)材料抵抗形變能力的物理量(順應(yīng)性)，即材料拉力-拉伸比例曲線線性上升段的斜率。可見(jiàn)不論在順纖維方向還是垂直纖維方向上，多孔的PCL電紡棉的楊氏模量均顯著小于緊實(shí)的PCL電紡膜(圖5)。

4PCL電紡膜(棉)的親水角檢測(cè)

親水角可以用于衡量被測(cè)材料與水的親和性，親和角越小，被測(cè)材料與水的親和性越高。PCL電紡膜和PCL電紡棉雖然屬于疏水材料，但由于制備技術(shù)和材料微觀結(jié)構(gòu)的不同，兩種材料間以及材料本身不同方向的親水角依然不相同。緊實(shí)PCL電紡膜在“纖維與攝像頭垂直放置方向”以及“纖維與攝像頭平行方向”的親水角均明顯大于“多孔的PCL電紡棉”。對(duì)于多孔PCL電紡膜，在“纖維與攝像頭垂直方向”，其親水角明顯小于“纖維與攝像頭平行方向”。在緊實(shí)PCL電紡膜，雖然“纖維與材料垂直方向”上的親水角有低于“纖維與材料平行方向”上親水角的趨勢(shì)，但兩者對(duì)比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，還可以觀察到多孔PCL電紡膜“纖維與攝像頭垂直”方向上的親水角隨時(shí)間不斷減少的趨勢(shì)(圖6)。

5PCL電紡膜(棉)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

人血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于PCL電紡膜或PCL電紡棉6d后，細(xì)胞骨架熒光染色可觀察到在PCL電紡膜上的細(xì)胞均勻地鋪展于纖維膜表面，但由于電紡膜的平面結(jié)構(gòu)，細(xì)胞不具有三維空間位置差異。電紡膜上的細(xì)胞可沿纖維取向排列，但不甚明顯。平滑肌細(xì)胞同樣可在PCL電紡棉中生長(zhǎng)。由于電紡棉疏松，且呈三維分布，因此細(xì)胞位置依纖維的空間位置排列高低錯(cuò)落。平滑肌細(xì)胞粘附在電紡棉纖維上后，胞體可沿纖維表面伸展延長(zhǎng)(圖7)。

6PCL電紡膜(棉)用于構(gòu)建組織工程血管

大孔徑PCL電紡棉包繞至橡膠管后，可見(jiàn)無(wú)細(xì)胞電紡棉血管支架表面蓬松，而細(xì)密PCL電紡膜血管支架材料表面光滑緊密。大鼠皮下移植4w后取材，可見(jiàn)“電紡棉血管支架組”組織已完全包裹電紡棉支架。表面為一層疏松結(jié)締組織，透過(guò)表層可見(jiàn)下層肉紅色質(zhì)地緊密的類(lèi)血管組織。橡膠管支撐物可較輕松地與組織分離。分離后的組織工程血管橫切面肉眼難以見(jiàn)到原有的靜電紡纖維棉，管腔面光滑平整。移植4w的“電紡膜血管支架組”取材可見(jiàn)，表面有疏松結(jié)締組織覆蓋，可透見(jiàn)下層蒼白色“組織”。然而，在取出橡膠支撐物過(guò)程中，包繞的電紡膜發(fā)生分離，不能得到完整的組織工程血管?！半娂徝扪苤Ъ堋痹谄は乱浦?w后取材結(jié)果從大體看與4周取材結(jié)果基本類(lèi)似，表面有疏松結(jié)締組織包裹，下層為致密的肉紅色組織工程血管。電紡膜血管支架組皮下移植6w后，大體觀與4w取材結(jié)果類(lèi)似，依然無(wú)法取出完整的血管組織(圖8)。

7PCL電紡膜(棉)組織工程血管的組織學(xué)觀察

無(wú)細(xì)胞電紡棉血管支架皮下移植4w后形成的組織工程血管HE染色顯示，細(xì)胞已長(zhǎng)入電紡棉內(nèi)部。部分區(qū)域細(xì)胞具有環(huán)形排列的特征。然而，組織細(xì)胞中空洞較多。Masson染色顯示有松散的藍(lán)色的膠原纖維沉積，沉積部位組織明顯比無(wú)沉積部位致密。電紡膜支架移植后形成的血管由于支架與圓柱管難以剝離，因此取剝離出最具代表性的外層組織作冰凍切片?？梢?jiàn)該組織工程血管僅最外層有疏松結(jié)締組織包裹，內(nèi)層電紡膜完全無(wú)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，Masson染色表明組織中無(wú)膠原纖維沉積(圖9)。

電紡棉支架皮下6w后形成的組織工程血管HE切片可見(jiàn)細(xì)胞已完全長(zhǎng)入電紡棉內(nèi)側(cè)，血管壁全層組織緊密，尤其是橡膠支架側(cè)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)密度較4w時(shí)明顯增加。細(xì)胞外基質(zhì)排列呈環(huán)形，基本形似天然血管中層的排列構(gòu)象。Masson三色染色可見(jiàn)藍(lán)色染色的膠原纖維沉積明顯增厚且致密。緊實(shí)電紡膜支架組冰凍切片染色結(jié)果與4w無(wú)太大差異(圖10)。

8組織平滑肌標(biāo)記物檢測(cè)

為了檢測(cè)皮下形成的組織工程血管是否具有平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物陽(yáng)性的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織冰凍切片免疫熒光染色平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物SM22，Calponin和SMA。結(jié)果表明，材料大鼠皮下移植4w后，構(gòu)建的組織工程血管中存在大量細(xì)胞，其中多數(shù)細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物SM22。Calponin+和SMA+細(xì)胞呈環(huán)形排列，是血管壁中負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)供給的微血管壁染色(圖11)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。