本發(fā)明屬于藥物新組合及其新用途領域，具體說的是一種小檗堿和地衣芽孢桿菌組合物在制備用于預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物中的應用。

背景技術(shù)：

輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬呼腸孤病毒科，是導致嬰幼兒嚴重腹瀉的最主要的病原體，兒童感染RV后具有很高的發(fā)病率和死亡率，全世界每年5歲以下的嬰幼兒有大約45.3萬人因感染RV死亡。RV感染不僅引起腸炎腹瀉，年齡較小的患兒常發(fā)生合并心肌及肝臟損傷，由于RV的主要發(fā)病人群為兒童，住院治療費用和家庭疾病負擔較高，而且，流行病學研究表明，經(jīng)濟水平的提高和衛(wèi)生條件的改善并不能降低RV感染性腹瀉的發(fā)病率。雖然目前已有多支輪狀病毒疫苗開發(fā)，但是其嚴重的副作用和昂貴的使用費用限制了應用。

RV感染引起腹瀉的機制有多種原因，對于嬰幼兒和幼畜來說，感染RV后小腸上皮細胞脫落或者分布不規(guī)則，D-木糖醇吸收障礙以及雙糖酶缺乏都可能造成腸細胞營養(yǎng)吸收障礙。RV首先感染宿主的腸上皮細胞，因此腸上皮細胞就成為了對抗輪狀病毒的第一層物理屏障。腸上皮細胞除了屏障功能之外，還存在著各種免疫功能，這種免疫功能可以減少病毒和細菌感染的風險，腸上皮細胞的這些免疫機制包括粘液分泌、產(chǎn)生細胞因子/趨化因子以及Toll樣受體(TLR)的表達。細菌性腸道致病菌可以引起小腸上皮細胞分泌包括白細胞介素-8(IL-8)在內(nèi)的多種炎性細胞因子，感染RV后，IL-8mRNA的表達和IL-8分泌的增加。而血清中白細胞介素-6(IL-6)水平能夠反映人或者悉生仔豬感染輪狀病毒的嚴重程度。炎癥因子白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-α(IFN-α)能夠抵抗人類和其他動物感染性疾病，這些細胞因子可能是宿主保護性免疫的重要組成部分，可以介導機體抗病毒能力，并且?guī)椭颊邚腞V感染中恢復過來?？傊?，這些細胞因子可以反映出輪狀病毒感染后的臨床癥狀或者疾病的嚴重程度，對于追蹤評價輪狀病毒的發(fā)生發(fā)展起著很重要的作用。

益生菌是有益于宿主的非病原微生物，可以通過刺激腸道內(nèi)的免疫機能，將過低或過高的免疫活性調(diào)節(jié)至正常狀態(tài)，同時還可以抑制有害菌在腸內(nèi)的繁殖，促進腸道消化系統(tǒng)的健康。地衣芽孢桿菌為一種益生菌，中國專利92113318.9報道了地衣芽孢桿菌63516株及其治療腹瀉的用途。小檗堿是中藥黃連、黃柏根莖中提取出的一種季銨型異喹啉類生物堿，具有治療腸道感染和細菌性痢疾等作用。

目前臨床上的抗輪狀病毒治療常采用利巴韋林等抗病毒藥，但易產(chǎn)生耐藥性，且不能長期用藥。因此，研制開發(fā)一種新的高效低毒的預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物是目前亟待解決的新問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種小檗堿和地衣芽孢桿菌組合物在制備用于預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物中的應用，該藥物組合物具有高效低毒等特點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種小檗堿和地衣芽孢桿菌組合物在制備用于預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物中的應用；所述小檗堿選自小檗堿、小檗堿鹽或小檗堿苷中的一種或幾種，所述的小檗堿鹽選自鹽酸小檗堿、硫酸小檗堿、硝酸小檗堿、鞣酸小檗堿中的一種或幾種，所述的小檗堿苷選自芒果苷小檗堿；所述的地衣芽孢桿菌選自地衣芽孢桿菌63516株；所述的地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌原菌粉，所述地衣芽孢桿菌原菌粉含活菌數(shù)為10-1000億CFU/克；所述的原菌粉為地衣芽孢桿菌63516菌泥加入稀釋劑，經(jīng)脫水干燥制成的單位質(zhì)量高活菌數(shù)菌粉，所述的稀釋劑選自無水碳酸鈣、乳糖或微晶纖維素中的一種或幾種；所述的輪狀病毒包括輪狀病毒株Wa株；所述地衣芽孢桿菌原菌粉含活菌數(shù)為100-400億CFU/克，優(yōu)選的地衣芽孢桿菌原菌粉含活菌數(shù)為200億CFU/克；所述地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)與小檗堿質(zhì)量的比例為200億CFU:1.25克～200億CFU:10克；所述地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)與小檗堿質(zhì)量的比例為200億CFU:2.5克～200億CFU:5克；所述的輪狀病毒感染疾病包括由輪狀病毒感染引起的腹瀉；所述的小檗堿和地衣芽孢桿菌為小檗堿和地衣芽孢桿菌的藥物組合物；所述的藥物組合物選自口服劑型；所述的口服劑型選自膠囊劑、顆粒劑、片劑、散劑。

本發(fā)明的要點在于提供一種預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物組合，其原理是：地衣芽孢桿菌和小檗堿能夠產(chǎn)生協(xié)同預防和治療輪狀病毒感染的作用，其效果顯著優(yōu)于單用地衣芽孢桿菌或小檗堿的效果。

一種小檗堿和地衣芽孢桿菌在制備用于預防或治療輪狀病毒感染疾病的藥物中的應用與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有高效、低毒等優(yōu)點，適合于臨床應用以及工業(yè)化大生產(chǎn)，將廣泛地應用于輪狀病毒感染疾病的治療領域中。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，實施例有助于更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實施例。

實施例一

本實例證明，一定劑量的地衣芽孢桿菌63516株原菌粉和鹽酸小檗堿能夠協(xié)同預防和治療輪狀病毒W(wǎng)a病毒株感染，其效果顯著優(yōu)于單用地衣芽孢桿菌或鹽酸小檗堿的效果。

1、細胞株和病毒株：

恒河猴胚腎細胞(MA-104)(ATTC#CRL-2378.1)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。人輪狀病毒株Wa株購買自中國微生物菌種網(wǎng)，編號CVCCAV54。

2、MA-104細胞培養(yǎng)：

用含10％小牛血清、1％非必須氨基酸的低限基本培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)MA-104，以細胞密度為5×10⁵/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h，長成良好致密單層細胞后，供后續(xù)試驗。

3、輪狀病毒增殖和收獲：

病毒液與終濃度為10μg/mL胰蛋白酶混合，37℃共孵育1h以激活病毒液。取狀態(tài)良好的單層MA-104細胞，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗三次，接種病毒液。于37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置2h。然后補加含1μg/mL胰蛋白酶的無血清MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48-60h。將病毒細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，低溫12000r/min離心5min，上清液即為輪狀病毒液，收獲待用。

4、輪狀病毒50％細胞致死量(TCID50/ml)測定：

取10μg/mL胰蛋白酶預處理過的病毒液，10倍系列稀釋后各取100μl接種于96孔板中處于對數(shù)生長期的單層MA-104細胞上，每個濃度設3個重復，于37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱中共孵育靜置吸附1h。按100μl/孔加入含有0.5μg/ml胰蛋白酶的培養(yǎng)液孵育培養(yǎng)，同時設置正常細胞對照。72h后對病變細胞和非病變細胞分別計數(shù)，然后根據(jù)Reed-Muench計數(shù)法計算，結(jié)果為TCID50＝10^-5.5/ml，后續(xù)動物試驗采用10^5.5TCID50/ml。

5、地衣芽孢桿菌63516株原菌粉和鹽酸小檗堿混合物對悉生仔豬感染RV的預防作用

地衣芽孢桿菌63516株原菌粉，其原菌粉含活菌數(shù)約200億CFU/克，其中CFU為菌落形成單位(Colony-Forming Units)，原菌粉：即地衣芽孢桿菌63516 菌泥加入適量無水碳酸鈣，經(jīng)脫水干燥制成的單位質(zhì)量高活菌數(shù)菌粉。其中的無水碳酸鈣也可用其他稀釋劑如乳糖或微晶纖維素替代。

新生小豬在無菌環(huán)境下剖腹產(chǎn)出生，并且在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。所有的小豬都是無特定病原，并且沒有RV抗體。選取1周齡悉生仔豬，隨機分成十一組，每組十二頭。在試驗第1-5天，按表1分組給藥(用10ml生理鹽水溶解)，第1、2組悉生仔豬喂食10ml生理鹽水。第6-10天，除1組外，其他各組悉生仔豬均進行1ml的10^5.5TCID50/ml口服攻毒。

表1分組給藥情況

6、地衣芽孢桿菌63516株和鹽酸小檗堿混合物對悉生仔豬感染RV的治療作用

地衣芽孢桿菌63516株原菌粉，其原菌粉含活菌數(shù)約200億CFU/克。

新生小豬在無菌環(huán)境下剖腹產(chǎn)出生，并且在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。所有的小豬都是無特定病原，并且沒有RV抗體。選取1周齡悉生仔豬，隨機分成十一組，每組十二頭。在試驗第1-5天，除1組外，其他各組悉生仔豬均進行1ml的10^5.5TCID50/ml口服攻毒。第6-10天，按表1分組給藥(用10ml生理鹽水溶解)，第1、2組悉生仔豬喂食10ml生理鹽水。

7、悉生仔豬血清中IL-2、IL-6、IL-8、INF-γ含量和輪狀病毒抗體水平檢測

以上每組采集第1天，第6天，第11天和第16天血清，ELISA法檢測。試驗結(jié)果見表2-A、2-B和3-A、3-B。結(jié)果表明地衣芽孢桿菌63516株原菌粉和鹽酸小檗堿重量比例為1:1.25-1:10時，對RV感染有協(xié)同預防和治療效果。地衣芽孢桿菌63516株原菌粉和鹽酸小檗堿重量比例為1:2.5-1:5時，協(xié)同效果最佳，其效果顯著優(yōu)于單用地衣芽孢桿菌或小檗堿的效果。

表2-A悉生仔豬血清因子含量和輪狀病毒抗體水平檢測(治療作用)

表2-B悉生仔豬血清因子含量和輪狀病毒抗體水平檢測(治療作用)

表2-A，2-B中，A為與組1的顯著性差異；B為與組2的顯著性差異；C為與組3的顯著性差異；D為與組4的顯著性差異；E為與組5的顯著性差異；F為與組6的顯著性差異；G為與組7的顯著性差異；*為顯著性差異P小于0.05；**為顯著性差異P小于0.01；***為顯著性差異P小于0.001。

表3-A悉生仔豬血清因子含量和輪狀病毒抗體水平檢測(預防作用)

表3-B悉生仔豬血清因子含量和輪狀病毒抗體水平檢測(預防作用)

表3-A,表3-B中，A為與組1的顯著性差異；B為與組2的顯著性差異；C為與組3的顯著性差異；D為與組4的顯著性差異；E為與組5的顯著性差異；F為與組6的顯著性差異；G為與組7的顯著性差異；*為顯著性差異P小于0.05；**為顯著性差異P小于0.01；***為顯著性差異P小于0.001。

實施例二

取20g原菌粉，25g鹽酸小檗堿，30g淀粉，10g乳糖和2.5g羧甲基淀粉鈉充分混勻，加適量水制成軟材，將軟材過40目篩，制得濕顆粒，用箱式干燥法干燥濕顆粒，即得。

實施例三

取15g原菌粉，75g鹽酸小檗堿，60g微晶纖維素，35g乳糖和7g低取代羥丙基纖維素充分混勻，加適量水制成軟材，將軟材過40目篩，制得濕顆粒，用箱式干燥法干燥濕顆粒，即得。

實施例四

取10g原菌粉，100g鹽酸小檗堿，40g微晶纖維素，52g淀粉，5g羧甲基纖維素鈉和11g交聯(lián)羧甲基纖維素鈉充分混勻，加適量水制成軟材，將軟材過40目篩，制得濕顆粒，用箱式干燥法干燥濕顆粒，即得。

實施例五

取30g原菌粉，75g鹽酸小檗堿，106g改性淀粉，50g乳糖和3.5g硬脂酸鎂充分混勻，過40目篩，制備成菌粉混合物，填入空膠囊中，即得。

實施例六

取20g原菌粉，35g鹽酸小檗堿，80g淀粉，65g蔗糖和4g硬脂酸鎂充分混勻，過40目篩，制備成菌粉混合物，填入空膠囊中，即得。

實施例七

取10g原菌粉，16g鹽酸小檗堿過40目篩，與33g乳糖和56g淀粉混勻，用10％淀粉漿制成軟材，干燥后于12目篩整粒，加入4.5g干淀粉和0.6g硬脂酸鎂混勻后，壓片，即得。

實施例八

取5g原菌粉，45g鹽酸小檗堿過40目篩，與24g乳糖和60g微晶纖維素混勻，用15％淀粉漿制成軟材，干燥后于12目篩整粒，加入4.5g干淀粉和5.3g滑石粉混勻后，壓片，即得。

菌種：地衣芽孢桿菌63516株(中國醫(yī)學細菌保藏中心的菌株編號CMCC63516)。