本發(fā)明涉及壞死梭桿菌疫苗領(lǐng)域，具體而言，涉及一種壞死梭桿菌抗原及其制備方法和制得的疫苗。
背景技術(shù)：
：腐蹄病是牛、羊、鹿等偶蹄動(dòng)物常見的一種亞急性高度接觸性傳染病，臨床癥狀包括起臥困難、站立時(shí)負(fù)重不實(shí)、食欲下降或廢絕、產(chǎn)奶量急劇下降；嚴(yán)重者蹄角質(zhì)分離，甚至造成死亡。腐蹄病每年都給我國(guó)乃至全世界的牛、羊、鹿的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，腐蹄病臨床防治無商品化疫苗可用，主要以臨床處置和抗生素治療為主，但控制效果不佳卻造成抗生素被濫用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)；上個(gè)世紀(jì)末，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所歷經(jīng)多年研究成功研制出適用于牛和鹿的壞死梭桿菌滅活全菌疫苗，雖然疫苗免疫保護(hù)率達(dá)90％以上，免疫期6個(gè)月以上，但該疫苗接種后在注射部位容易形成硬結(jié)，會(huì)出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等副反應(yīng)，影響疫苗的推廣應(yīng)用。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種壞死梭桿菌抗原的制備方法，該方法將壞死梭桿菌菌體采用胰酶進(jìn)行裂解，然后分離，得到的上清液滅活，上清液中不再含有內(nèi)毒素，解決了現(xiàn)有技術(shù)中壞死梭桿菌滅活全菌疫苗含有內(nèi)毒素的缺陷。本發(fā)明的第二目的在于提供一種壞死梭桿菌抗原，該抗原不再含有內(nèi)毒素，并且能很好的滿足制備疫苗的需求。本發(fā)明的第三目的在于提供由上述抗原制得的疫苗。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種壞死梭桿菌抗原的制備方法，將壞死梭桿菌采用胰酶進(jìn)行酶解，離心得到的上清液經(jīng)滅活處理后即得。本發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的壞死梭桿菌滅活全菌疫苗研究發(fā)現(xiàn)，該疫苗接種后在注射部位容易形成硬結(jié)，會(huì)出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等副反應(yīng)是由于該全菌疫苗不僅含有高濃度的抗原物質(zhì)，而且含有高濃度內(nèi)毒素。本發(fā)明經(jīng)多次試驗(yàn)，采用胰酶裂解菌體的方式，使其內(nèi)容物釋放出來，裂解產(chǎn)物進(jìn)行分離，去除內(nèi)毒素以及其他無效的成分，保留其有效抗原成分，然后將其滅活得到壞死梭桿菌抗原。制備方法簡(jiǎn)便易行，得到的壞死梭桿菌抗原制成的疫苗克服了現(xiàn)有的疫苗接種后在注射部位容易形成硬結(jié)，會(huì)出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等的副反應(yīng)。進(jìn)一步地，所述壞死梭桿菌來源于牛、鹿以及羊中的任一種或多種。進(jìn)一步地，所述酶解的懸浮液的pH值為8.0-8.2，所述懸浮液是將收集的壞死梭桿菌菌體用水懸浮制得，所述懸浮液的pH用堿溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過調(diào)節(jié)菌體懸浮液的pH為枯草桿菌素提供良好的酶解條件。優(yōu)選地，所述菌體與所述水的重量比為1:3-5。以達(dá)到適當(dāng)?shù)木w濃度，便于胰酶更充分的酶解。優(yōu)選地，所述堿溶液為強(qiáng)堿性溶液，所述強(qiáng)堿性溶液的質(zhì)量濃度為8％-15％。進(jìn)一步地，所述強(qiáng)堿包括氫氧化鈉和氫氧化鉀中的任一種或兩種。經(jīng)試驗(yàn)，在特定的溫度下，酶解更完全，酶解產(chǎn)物更易于去除含有的內(nèi)毒素，進(jìn)一步地，所述胰酶的添加量為菌體重量的0.3％-0.5％，酶解的溫度為42-45℃，酶解的時(shí)間為28-32min。為了達(dá)到更好的酶解效果，且利于后續(xù)的分離，優(yōu)選地，胰酶酶解菌體的過程中，保持菌體懸浮液的pH為8.0-8.2。進(jìn)一步地，所述滅活采用福爾馬林進(jìn)行。進(jìn)一步地，所述滅活是在所述上清液中添加福爾馬林，然后于36-38℃處理4.5-5.5天，期間不時(shí)搖動(dòng)。優(yōu)選地，所述上清液的蛋白濃度為8-12mg/mL，添加的福爾馬林占所述上清液的體積百分?jǐn)?shù)為0.45％-0.55％。進(jìn)一步地，酶解的壞死梭桿菌為：將壞死梭桿菌接種于厭氧培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到的菌體。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體生長(zhǎng)旺盛，也易于裂解，且其中積累的有害成分少。優(yōu)選地，所述厭氧培養(yǎng)基為腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基或硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。這兩種培養(yǎng)基是現(xiàn)有的，可通過市售購買，或者是按照市售的配方進(jìn)行配制。優(yōu)選地，所述離心采用的轉(zhuǎn)速為12000-13000rpm。裂解的菌體通過該轉(zhuǎn)速離心，得到的上清液中去除了內(nèi)毒素以及其他無效的成分，保留了有效抗原成分。進(jìn)一步地，所述壞死梭桿菌接種量為5％-10％，培養(yǎng)的溫度為35-39℃，培養(yǎng)的時(shí)間為8-24h。通過該接種量以及培養(yǎng)溫度和時(shí)間，得到的菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。本發(fā)明還提供了由上述的壞死梭桿菌抗原的制備方法制得的壞死梭桿菌抗原。本發(fā)明還提供了由上述的壞死梭桿菌抗原制得的壞死梭桿菌疫苗。該疫苗可采用常規(guī)的方法制備。進(jìn)一步地，所述疫苗為白油佐劑疫苗、鋁膠佐劑疫苗、弗氏完全佐劑疫苗中的任一種。具體地，白油佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液中加入Tween80，然后與佐劑用膠體磨乳化制得白油佐劑疫苗，定批號(hào)1；其中，Tween80的質(zhì)量濃度為3.5-4.5％；佐劑為：10號(hào)白油、司班80和硬脂酸鋁以質(zhì)量比為90：8：2的混合物。鋁膠佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液按重量比例為3：6-8加入鋁佐劑，然后加入質(zhì)量濃度為0.01％硫柳汞充分振蕩，在2～10℃冷暗處放置24h，期間不時(shí)搖動(dòng)，使充分吸附，制備得到鋁膠佐劑疫苗，定批號(hào)2。弗氏完全佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液按質(zhì)量濃度為1％加入Tween80，然后按重量比為5：6-4：5加入弗氏完全佐劑，用膠體磨乳化，制備得疫苗，定批號(hào)3。三種疫苗在無菌、安全檢驗(yàn)合格后均移入2～10℃冷暗處保存。最后得到的產(chǎn)物中，甲醛一方面是自己揮發(fā)；另一方面在后續(xù)配置疫苗過程中會(huì)添加其他液體，對(duì)甲醛起到一個(gè)稀釋的作用，最終保證甲醛終濃度不超過1％。另外，需要說明的是，本發(fā)明人還對(duì)壞死梭桿菌進(jìn)行堿裂解、蛋白酶K裂解、超聲波裂解以及凍融裂解等等，裂解后分離得到的上清液中均殘留較多的內(nèi)毒素，制成的疫苗的副反應(yīng)與現(xiàn)有的全菌疫苗效果基本一致，均不能解決現(xiàn)有的疫苗接種后在注射部位容易形成硬結(jié)、出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等的副反應(yīng)的問題。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明采用胰酶裂解壞死梭桿菌的方式，將裂解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到的上清液滅活，制得的壞死梭桿菌抗原制成的疫苗克服了現(xiàn)有的疫苗接種后在注射部位容易形成硬結(jié)，會(huì)出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等的副反應(yīng)的缺陷。(2)本發(fā)明還提供了具體的裂解壞死梭桿菌的步驟，通過分離，盡量多的去除含有的內(nèi)毒素以及其他無效的成分，保留其有效抗原成分，得到的壞死梭桿菌抗原制成的疫苗克服了現(xiàn)有的疫苗接種后的副反應(yīng)，并且免疫性能穩(wěn)定。(3)本發(fā)明還提供了不同類型的疫苗，免疫效果穩(wěn)定可靠。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1一種壞死梭桿菌抗原，通過以下方法制備：將牛源壞死梭桿菌接種于厭氧培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，壞死梭桿菌接種量為5％，培養(yǎng)的溫度為39℃，培養(yǎng)的時(shí)間為24h，培養(yǎng)得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的壞死梭桿菌；將培養(yǎng)得到的壞死梭桿菌菌液離心，離心采用連續(xù)流離心機(jī)，使用連續(xù)流離心機(jī)離心壞死梭桿菌培養(yǎng)物時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)子、輸液管需要煮沸滅菌或高壓滅菌，無菌條件下安裝轉(zhuǎn)子和輸液管；菌液進(jìn)入連續(xù)流離心機(jī)的流速約為100mL/min，離心的轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心5min，得到菌體沉淀；菌體沉淀用滅菌蒸餾水重懸，菌體沉淀與蒸餾水的重量比例為1:3，得到菌體懸浮液；菌體懸浮液用10％NaOH溶液調(diào)整其pH值為8.0，升高溫度至42℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量為菌體沉淀物重量的0.3％；每隔5min檢查一下菌體懸浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解時(shí)間為32min；酶解完成后，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，收集上清液；取樣按照Lowry法測(cè)定菌體蛋白含量，利用滅菌蒸餾水稀釋至蛋白濃度為8mg/mL，備用；按照終濃度0.45％向制備的水解產(chǎn)物中添加福爾馬林，置于36℃溫箱中滅活5.5天，期間不時(shí)搖動(dòng)確保滅活均勻，得到壞死梭桿菌抗原。實(shí)施例2一種壞死梭桿菌抗原，通過以下方法制備：將牛源壞死梭桿菌接種于厭氧培養(yǎng)基腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基，壞死梭桿菌接種量為8％，培養(yǎng)的溫度為37℃，培養(yǎng)的時(shí)間為12h，培養(yǎng)得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的壞死梭桿菌；將培養(yǎng)得到的壞死梭桿菌菌液離心，離心采用連續(xù)流離心機(jī)，使用連續(xù)流離心機(jī)離心壞死梭桿菌培養(yǎng)物時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)子、輸液管需要煮沸滅菌或高壓滅菌，無菌條件下安裝轉(zhuǎn)子和輸液管；菌液進(jìn)入連續(xù)流離心機(jī)的流速約為110mL/min，離心的轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心5min，得到菌體沉淀；菌體沉淀用滅菌蒸餾水重懸，菌體沉淀與蒸餾水的重量比例為1:4，得到菌體懸浮液；菌體懸浮液用10％NaOH溶液調(diào)整其pH值為8.1，升高溫度至44℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量為菌體沉淀物重量的0.4％；每隔5min檢查一下菌體懸浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解時(shí)間為30min；酶解完成后，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，收集上清液；取樣按照Lowry法測(cè)定菌體蛋白含量，利用滅菌蒸餾水稀釋至蛋白濃度為10mg/mL，備用；按照終濃度0.5％向制備的水解產(chǎn)物中添加福爾馬林，置于37℃溫箱中滅活5天，期間不時(shí)搖動(dòng)確保滅活均勻，得到壞死梭桿菌抗原。實(shí)施例3一種壞死梭桿菌抗原，通過以下方法制備：將牛源壞死梭桿菌接種于厭氧培養(yǎng)基腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基，壞死梭桿菌接種量為10％，培養(yǎng)的溫度為35℃，培養(yǎng)的時(shí)間為8h，培養(yǎng)得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的壞死梭桿菌；將培養(yǎng)得到的壞死梭桿菌菌液離心，離心采用連續(xù)流離心機(jī)，使用連續(xù)流離心機(jī)離心壞死梭桿菌培養(yǎng)物時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)子、輸液管需要煮沸滅菌或高壓滅菌，無菌條件下安裝轉(zhuǎn)子和輸液管；菌液進(jìn)入連續(xù)流離心機(jī)的流速約為120mL/min，離心的轉(zhuǎn)速為13000rpm，離心3min，得到菌體沉淀；菌體沉淀用滅菌蒸餾水重懸，菌體沉淀與蒸餾水的重量比例為1:5，得到菌體懸浮液；菌體懸浮液用10％NaOH溶液調(diào)整其pH值為8.2，升高溫度至45℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量為菌體沉淀物重量的0.5％；每隔5min檢查一下菌體懸浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解時(shí)間為28min；酶解完成后，冷卻至室溫，13000rpm離心3min，收集上清液；取樣按照Lowry法測(cè)定菌體蛋白含量，利用滅菌蒸餾水稀釋至蛋白濃度為12mg/mL，備用；按照終濃度0.5％向制備的水解產(chǎn)物中添加福爾馬林，置于38℃溫箱中滅活4.5天，期間不時(shí)搖動(dòng)確保滅活均勻，得到壞死梭桿菌抗原。試驗(yàn)例實(shí)施例2制得的壞死梭桿菌抗原分別制備成疫苗，疫苗的種類為白油佐劑疫苗、鋁膠佐劑疫苗、弗氏完全佐劑疫苗；白油佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液中加入Tween80，然后與佐劑用膠體磨乳化制得白油佐劑疫苗，為1號(hào)疫苗；其中，Tween80的質(zhì)量濃度為4％；佐劑為：10號(hào)白油、司班80和硬脂酸鋁以質(zhì)量比為90：8：2的混合物；鋁膠佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液按重量比例為3：7加入鋁佐劑，然后加入質(zhì)量濃度為0.01％硫柳汞充分振蕩，在2～10℃冷暗處放置24h，期間不時(shí)搖動(dòng)，使充分吸附，制備得到鋁膠佐劑疫苗，為2號(hào)疫苗；弗氏完全佐劑疫苗通過以下方法制備：制得的滅活的上清液按質(zhì)量濃度為1％加入Tween80，然后按重量比為1：1加入弗氏完全佐劑，用膠體磨乳化，制備得疫苗，為3號(hào)疫苗；三種疫苗在無菌、安全檢驗(yàn)合格后均移入2～10℃冷暗處保存。制得的不同種類的疫苗進(jìn)行免疫試驗(yàn)。1、兔免疫試驗(yàn)20只試驗(yàn)兔、隨機(jī)分為4組，每組5只，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。第一組皮下注射1號(hào)疫苗0.5mL，第二組皮下注射2號(hào)疫苗0.5mL，第三組皮下注射3號(hào)疫苗0.5mL，注射部位耳根皮下，第4組為空白對(duì)照組。在注射疫苗前和注射疫苗后采血，并在注射疫苗后28d對(duì)各組試驗(yàn)兔耳根皮下注射2個(gè)致死劑量的壞死梭桿菌(108cells/mL，2mL)，觀察精神、食欲等變化，詳細(xì)記錄。結(jié)果如表1和表2所示。表1兔攻毒試驗(yàn)結(jié)果表2接種3種疫苗兔血清中的抗體變化注：“X/Y”表示“Y”中有“X”只檢測(cè)出抗體，如“3/4”表示四只兔有三只檢測(cè)出抗體。從表1可以看出，本發(fā)明提供的疫苗只有輕微的不良反應(yīng)，疫苗接種后在注射部位不會(huì)形成硬結(jié)，也不會(huì)出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等副反應(yīng)。并且免疫效果較好。表2結(jié)果表明，接種三種疫苗兔在14d前，被免兔血清對(duì)流免疫電泳呈陰性，3周后逐漸產(chǎn)生抗體，追蹤檢測(cè)至22周，被檢兔血清對(duì)流免疫電泳仍然呈陽性。表2中，由于試驗(yàn)兔在免疫后4周開始接種2個(gè)致死劑量的壞死梭桿菌菌液進(jìn)行攻毒，考察疫苗的攻毒保護(hù)；所以會(huì)有實(shí)驗(yàn)兔死亡現(xiàn)象發(fā)生；即使沒有死亡，由于選取試驗(yàn)兔進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)，觀察試驗(yàn)兔的實(shí)質(zhì)臟器的變化情況，與對(duì)照組進(jìn)行比較分析，所以會(huì)有試驗(yàn)兔數(shù)量減少情況發(fā)生。2、三種疫苗對(duì)奶牛的免疫試驗(yàn)2.1奶牛的分組540只奶牛隨機(jī)分為3組，1組170只，2組230只，3組144只，每組再隨機(jī)分為2組，為注射疫苗組和對(duì)照組，具體分組情況如表3所示。表3免疫奶牛分組方式分組序號(hào)總數(shù)注射疫苗組對(duì)照組11709080223012510531409050組1、2、3注射疫苗組分別對(duì)應(yīng)注射1、2、3號(hào)疫苗，每頭奶牛耳根皮下注射疫苗4mL；對(duì)照組不注射疫苗；統(tǒng)計(jì)發(fā)病數(shù)，具體結(jié)果如表4所示。表4免疫試驗(yàn)結(jié)果1號(hào)疫苗和2號(hào)疫苗對(duì)牛免疫后，有個(gè)別牛出現(xiàn)精神、食欲不振，3d后癥狀消失；3號(hào)疫苗對(duì)牛免疫后，有10余只牛出現(xiàn)局部非細(xì)菌性化膿，一個(gè)月后破潰，一直遷延不愈，駐場(chǎng)獸醫(yī)切開部分牛的創(chuàng)口，處理后痊愈，未處理牛半年后化膿逐漸消失。懷疑3號(hào)疫苗是由于除抗原外的添加物造成免疫動(dòng)物牛出現(xiàn)更加不適的現(xiàn)象。另外，改變白油佐劑疫苗、鋁膠佐劑疫苗以及弗氏完全佐劑疫苗中各成分的添加量，以得到更加優(yōu)越的免疫效果也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)表4進(jìn)行雙因素分析，不同佐劑間的免疫效果無明顯差異；應(yīng)用疫苗前后效果顯著。利用制備的疫苗在本動(dòng)物奶牛上進(jìn)行了田間試驗(yàn)，用SPSS軟件對(duì)表4的田間試驗(yàn)結(jié)果分析，應(yīng)用配對(duì)T檢驗(yàn)，疫苗免疫前后差異顯著，說明疫苗效果良好。另外，本發(fā)明還將實(shí)施例1和實(shí)施例3制得的壞死梭桿菌抗原采用與實(shí)施例2制得的壞死梭桿菌抗原相同的方法分別制得白油佐劑疫苗、鋁膠佐劑疫苗、弗氏完全佐劑疫苗，并對(duì)其進(jìn)行性能的驗(yàn)證，結(jié)果均同實(shí)施例2制得的疫苗效果一致。本發(fā)明提供的牛源壞死梭桿菌具有良好的免疫原性，本發(fā)明首次在國(guó)內(nèi)制備出無細(xì)胞牛壞死桿菌病疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)證明，疫苗安全有效。盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁1 2 3