本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，涉及雙特異性磷酸酶14（Dusp14）在肝缺血再灌注損傷中的應(yīng)用，具體涉及Dusp14在篩選或制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）損傷是在肝臟外科手術(shù)或者肝臟移植中，因肝臟血流阻斷或肝臟供體的體外灌注引起肝臟缺血，當(dāng)肝臟血流灌注恢復(fù)后，導(dǎo)致肝臟損傷加重甚至功能障礙的生理病理過程^[1]。肝臟I/R損傷根據(jù)缺血情況的不同分為熱缺血和冷缺血兩種，熱缺血常發(fā)生在常規(guī)肝臟手術(shù)及肝臟創(chuàng)傷中，也可能發(fā)生于某些類型的中毒性肝損傷，肝血竇阻塞以及Budd-Chiari綜合征等^[2]；冷缺血主要發(fā)生于器官移植前的低溫保存^[3]。肝臟I/R損傷在臨床上常表現(xiàn)為肝功能的損害，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率增加，外科醫(yī)生常需要在減少術(shù)中出血和降低肝臟I/R損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間做出艱難的選擇。導(dǎo)致肝缺血再灌注損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，研究表明，Kupffer細(xì)胞的激活、氧化應(yīng)激以及炎癥性細(xì)胞信號(hào)通路的激活等都參與了這一病理生理過程^[4]。

關(guān)于肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制及其預(yù)防措施的研究，對(duì)于減少肝臟I/R損傷的發(fā)生或減輕I/R損傷的程度，減少肝臟手術(shù)的并發(fā)癥，提高肝移植成功率，促進(jìn)術(shù)后肝功能的恢復(fù)，具有重要的臨床意義。針對(duì)這一難題，臨床醫(yī)生探索了眾多控制和減輕I/R損傷的方法，包括低溫麻醉、控制性灌注、肝臟原位降溫冷卻以及使用抗自由基損傷的藥物等。但是，臨床條件和病人實(shí)際情況限制了上述方法的應(yīng)用和效果。

在細(xì)胞中，很多蛋白在合成以后都會(huì)發(fā)生蛋白翻譯后的修飾。而在這些蛋白修飾中，蛋白的可逆性的磷酸化修飾就是一種作用非常廣泛的蛋白翻譯后的修飾。蛋白激酶（protein kinase, PK）能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)游離的磷酸基團(tuán)連接到底物蛋白分子上，介導(dǎo)底物蛋白發(fā)生磷酸化。蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PP）和蛋白激酶的作用是相反的，蛋白磷酸酶能夠介導(dǎo)底物蛋白發(fā)生去磷酸化。在真核細(xì)胞中，有三種氨基酸殘基是最容易發(fā)生磷酸化作用的，分別是酪氨酸（tyrosine, tyr）、蘇氨酸（threonine, thr）和絲氨酸（serine, ser）。發(fā)生磷酸化作用的氨基酸位點(diǎn)不一樣，那么所對(duì)應(yīng)的去磷酸化作用的酶也是不一樣的，分別是酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）以及絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（protein serine/threonine phosphatases, PSPs）。雙特異性蛋白磷酸酶（dual specificity protein phosphatases, DUSPs）具備酪氨酸磷酸酶以及絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的雙重作用，不僅可以催化酪氨酸位點(diǎn)上的去磷酸化作用，也可以催化絲氨酸、蘇氨酸位點(diǎn)上的去磷酸化作用。

Dusp14是雙特異性磷酸酶（DUSP）家族中的一員，Dusp14蛋白分子全長(zhǎng)198個(gè)氨基酸，其中包含了一個(gè)雙特異性磷酸酶的催化結(jié)構(gòu)域DSPs（Dual-specificity phosphatase catalytic domain, DSPs）。Dusp14分子上能夠介導(dǎo)磷酸基團(tuán)結(jié)合的催化活性區(qū)域是H₁₁₀CAAGVSR₁₁₇，其中催化活性位點(diǎn)是第111位的半胱氨酸（cysteine111）。Dusp14最初作為CD28的胞質(zhì)尾區(qū)互作蛋白，廣泛表達(dá)于心、肝、胎盤等組織器官中^[5]。研究表明，Dusp14能夠調(diào)節(jié)原代T細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK和P38的磷酸化水平^[5]；Dusp14活性位點(diǎn)突變（C111S）可以激活ERK，促進(jìn)β細(xì)胞增殖^[6]；Dusp14通過TAK1-P38/JNK信號(hào)通路在主動(dòng)脈縮窄引起的心肌肥厚中發(fā)揮重要的保護(hù)作用^[7]，而其在肝臟缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決臨床防治肝缺血再灌注損傷現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定Dusp14基因的表達(dá)與肝缺血再灌注損傷之間的相互關(guān)系，提供一種用于治療肝缺血再灌注損傷的靶基因Dusp14的新應(yīng)用，即Dusp14作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，以及Dusp14在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而把Dusp14基因應(yīng)用于肝缺血再灌注損傷的治療。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠和Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過肝缺血再灌注損傷模型研究Dusp14基因的功能。結(jié)果表明：與野生型C57BL/6小鼠相比，肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠肝臟壞死面積明顯增加；與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死面積則明顯減小。這提示Dusp14基因具有保護(hù)肝功能的作用，為研究Dusp14在防治肝缺血疾病的新靶點(diǎn)和新策略中所發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。

本發(fā)明的研究證明了：在肝缺血再灌注損傷模型中，Dusp14具有抑制肝臟壞死、減少肝細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝功能的作用。

一種Dusp14基因在肝缺血再灌注損傷中的功能，主要體現(xiàn)在Dusp14具有保護(hù)肝功能的作用，特別是Dusp14具有改善肝缺血再灌注損傷的作用。

針對(duì)Dusp14改善肝缺血再灌注損傷的功能，Dusp14具有如下應(yīng)用：

Dusp14作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用是非診斷和治療的目的；所述的篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物，是指篩選夠促進(jìn)Dusp14表達(dá)的藥物。

Dusp14在制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Dusp14基因的新功能，即Dusp14基因能夠抑制肝組織缺血再灌注損傷，且與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

（2）基于Dusp14在抑制肝缺血疾病中的作用，其可以用于篩選或制備預(yù)防、緩解和/或治療肝缺血再灌注損傷的藥物。

附圖說明

圖1是肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠和Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建策略圖。A為肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖；B為肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建策略圖。

圖2是Western Blot檢測(cè)肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠和Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中Dusp14表達(dá)量的結(jié)果圖。A為肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠的檢測(cè)結(jié)果圖；B為肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)結(jié)果圖（TG1、TG2、TG3、TG4表示不同的轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體）。

圖3是小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的壞死情況對(duì)比圖。A為WT和Dusp14-KO小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B為NTG和Dusp14-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖（#：P＜0.05 vs 對(duì)應(yīng)I/R組）。

圖4小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)比較圖。A為WT和Dusp14-KO小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B為NTG和Dusp14-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀圖（*：P＜0.05 vs WT Sham組；#：P＜0.05 vs WT/NTG對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)I/R組）。

圖5小鼠缺血在再灌注24h時(shí)TUNEL細(xì)胞數(shù)的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。A為WT和Dusp14-KO小鼠在再灌注24h時(shí)TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計(jì)圖；B為NTG和Dusp14-TG小鼠在再灌注24h時(shí)TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計(jì)圖（#：P＜0.05 vs 對(duì)應(yīng)I/R組）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重在24g-27g、背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，購自北京華阜康生物科技股份有限公司）、肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠（Dusp14-KO）和Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠（Dusp14-TG）（由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心李紅良老師實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）、非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG，同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)小鼠飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。

實(shí)施例1 肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠以及Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

（1）肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠的構(gòu)建（構(gòu)建策略見圖1A）

根據(jù)Dusp14基因的信息，利用CRISPR Design分別在內(nèi)含子2和3中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為：

Dusp14-sRNA1：ggATAAGTCATTTTCTATTGACCAT TGG；

Dusp14-sRNA2：GGTTCTCCCGAGAGGGTTTCTACGC TGG。

此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體載體（Donor Vector），它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。

1）打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4 DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA（Addgene 51132）載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

2）條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp的構(gòu)建：

分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT；

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA；

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescript II SK(+)載體用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescript SK(+)-2loxp。

3）供體載體（Donor Vector）的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物（表1），以小鼠gDNA為模板，擴(kuò)增供體載體的左右同源臂（LA和RA）以及中間的外顯子部分（M）。上述擴(kuò)增得到的產(chǎn)物及pBluescript SK(+)-2loxp載體經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后連接，得到供體載體。

表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)

4）打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分（負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA）分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體pST1374-Cas9（Addgene 44758）用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7 mMESSAGE mMACHINE試劑盒（AM1345，Ambion）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A) Tailing 試劑盒（Ambion）對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript? Kit（AM1354，Ambion公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit（Qiagen，217084）進(jìn)行純化。

5）Dusp14-floxed條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體載體一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得Dusp14-floxed純合小鼠。

6）肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠的制作

將上述Dusp14-floxed小鼠與肝臟特異性Alb-Cre（購自The Jackson Laboratory，貨號(hào)003574）轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到Dusp14^{floxed/floxed}/Alb-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠。

通過蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠肝臟中Dusp14蛋白的表達(dá)量。提取肝細(xì)胞蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），驗(yàn)證Dusp14表達(dá)，結(jié)果見圖2A。相比于野生型小鼠，肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠肝細(xì)胞中Dusp14蛋白幾乎不表達(dá)。

（2）肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建（構(gòu)建策略見圖1B）

以野生型C57BL/6小鼠Dusp14基因cDNA為模板，用上游引物（5’-TGCTCTAGAGCCACCATGAGCTCCAGAGGTCACAG-3’）、下游引物（5’-TGCTCTAGACTAAATCCCCCAATAAGGCA-3’）擴(kuò)增小鼠Dusp14基因（NCBI，Gene ID：56405，NM_019819.3），把擴(kuò)增得到的產(chǎn)物以及pCAG-CAT-LacZ載體（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實(shí)驗(yàn)室提供，制備過程參見參考文獻(xiàn)：Kim T, Zhelyabovska O, Liu J, et al. Generation of an Inducible, Cardiomyocyte-Speci fi c Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J]. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs), 57.）用XbaI（NEB，# R0145L）酶切后連接，得到轉(zhuǎn)基因載體pCAG-loxP-CAT-loxP-Dusp14-hGHpA，Dusp14的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到。將構(gòu)建的載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到Dusp14-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠由Dusp14-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和Alb-Cre（購自The Jackson Laboratory，貨號(hào)003574）小鼠雜交繁殖得到。

通過蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中Dusp14蛋白的表達(dá)量。提取不同轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），驗(yàn)證Dusp14過表達(dá)，結(jié)果見圖2B。相比于野生型小鼠，肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中Dusp14蛋白表達(dá)含量顯著提高。

實(shí)施例2 小鼠肝缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）模型的獲得

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：雄性C57BL/6品系野生型小鼠、肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠及Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠、非轉(zhuǎn)基因小鼠，通過肝臟缺血再灌注建立肝缺血再灌注損傷模型（I/R）。隨機(jī)分為8組：C57BL/6J品系野生型小鼠假手術(shù)組（WT Sham）及I/R手術(shù)組（WT I/R）、肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠假手術(shù)組（KO Sham）及I/R手術(shù)組（KO I/R）、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（NTG Sham）及I/R手術(shù)組（NTG I/R）、肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（TG Sham）及I/R手術(shù)組（TG I/R）。

（2）肝缺血再灌注損傷I/R模型手術(shù)（采用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血）操作流程：

1）手術(shù)前12h給小鼠禁食，可自由飲水。

2）手術(shù)前用3%戊巴比妥鈉成功麻醉小鼠后，將其平臥固定肢體，用剃毛器將小鼠腹部術(shù)區(qū)毛刮凈，用10%碘酒和75%乙醇對(duì)術(shù)區(qū)消毒。

3）取腹正中切口進(jìn)腹，暴露肝臟左、中葉之肝蒂。

4）用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，可見阻斷葉變白，說明阻斷成功。此時(shí)，注意記錄缺血開始時(shí)間，維持缺血約60分鐘，期間用濕的鹽水紗布覆蓋切口，并注意小鼠的保溫（Sham組的小鼠在阻斷成功即刻去除血管夾，恢復(fù)缺血肝血流）。

5）缺血60分鐘后去除血管夾，恢復(fù)缺血的肝臟血流，然后關(guān)閉腹腔，分兩層關(guān)腹，先把內(nèi)層縫好，再縫皮，將手術(shù)后的小鼠置于干凈的籠子中單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察。

實(shí)施例3 肝臟壞死面積及肝功能指標(biāo)（AST，ALT）的測(cè)定

肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括肝臟壞死面積和肝功能指標(biāo)（AST，ALT），這些指標(biāo)均與肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。

（1）取材

分別于術(shù)后1h、3h、6h、24h取假手術(shù)組（Sham）以及缺血再灌注組小鼠，頸椎脫臼處死，立即自下腔靜脈取血1mL，分離血清。同時(shí)統(tǒng)一取缺血區(qū)肝左葉組織大小約1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福爾馬林中固定24h后脫水，包埋，進(jìn)行石蠟切片后進(jìn)行HE染色。

分離血清：收集血液的EP管于室溫下靜置1-2h使血液自然凝固。4℃、4000rpm/min離心30min，充分分離血清。用微量移液器分別吸取血清20μL、20μL、30μL、30μL置0.2mL無菌EP管中，對(duì)EP管進(jìn)行標(biāo)記，隨后保存于-80℃冰箱備用。

（2）制備石蠟標(biāo)本切片

1）主要操作程序包括：包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。

2）用石蠟切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5μm的石蠟切片備用。

（3）HE染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液5min→水洗1min→1%鹽酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL）1min→水洗1min→伊紅溶液3-5min→蒸餾水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。

（4）小鼠血清ALT、AST含量測(cè)定

1）從-80℃冰箱中取出血清樣本，迅速置于冰上，在室溫下待樣品融化；

2）在室溫下，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，讓EP管壁的血清聚集至管底。

3）按照操作流程，打開全自動(dòng)生化分析儀（Sysmex，Chemix 180i），清洗加樣器。

4）按照全自動(dòng)生化分析儀樣品盤的標(biāo)記順序，逐一放入待測(cè)的EP管。

5）準(zhǔn)確安裝試劑檢測(cè)盤，開始使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平。

Dusp14-KO、WT、Dusp14-TG和NTG組在肝臟缺血再灌注損傷后的HE染色結(jié)果見圖3：顯微鏡下可見Sham組肝組織基本正常，肝組織結(jié)構(gòu)整齊，無明顯的纖維組織增生。I/R組隨著再灌注的時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂。其內(nèi)有大小不等、形狀不規(guī)則的壞死灶，壞死灶內(nèi)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，離斷，與正常肝臟比較，壞死肝臟的肝小葉內(nèi)見大片壞死灶，壞死組織邊緣可見炎性反應(yīng)帶，肝細(xì)胞核發(fā)生典型的壞死改變，可見核固縮。這種現(xiàn)象在缺血再灌注后24h達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予Dusp14-KO小鼠I/R后的梗死面積明顯大于WT組小鼠（圖3A）；同樣Dusp14-TG小鼠I/R后的梗死面積明顯小于NTG組小鼠（圖3B），因此，Dusp14在肝臟缺血再灌注引起的損傷中起到重要作用。

血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。結(jié)果表明在I/R組各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平均明顯高于Sham組，在再灌注后6h達(dá)到高峰，隨后下降，Dusp14-KO小鼠I/R后的ALT、AST水平明顯高于WT組小鼠（圖4A）；Dusp14-TG小鼠I/R后的ALT、AST水平顯著低于NTG組小鼠（圖4B）。

實(shí)施例4 缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡情況測(cè)定

用TUNEL試劑盒染色檢測(cè)凋亡，UNEL試劑盒：ApopTag? Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit（S7111，Chemicon）。具體過程為：

1）將石蠟切片置于烤箱中，60℃烤片30分鐘；

2）二甲苯，5分鐘×3次；

3）100%乙醇，5分鐘×2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘；

4）ddH₂O漂洗，5分鐘×2次；

5）蛋白酶K 37℃孵育15分鐘；

6）PBS漂洗5min×2次；

7）直接滴加Equilibration Buffer于組織上（13μL/cm²），室溫孵育至少10s；

8）棄去Equilibration Buffer，滴加TdT Enzyme工作液（77μL Reaction Buffer +33μL TdT Enzyme）于組織上（11μL/cm²），置濕盒于37℃孵育1h；

9）將切片置于盛有Stop/Wash Buffer工作液（1mL Stop/Wash Buffer+34mL ddH₂O）的染色缸中振蕩15s后室溫孵育10min（等待過程中，將適當(dāng)量的Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫）；

10）PBS漂洗1min×3次；

11）輕輕甩去組織多余殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液（53%Blocking Solution+ 47%Anti-Digoxigenin Conjugate）于組織上（13μL/cm²），置濕盒中室溫避光孵育30min；

12）PBS漂洗2min×4次（每次換新的PBS）；

13）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen，S36939）封片；熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4℃保存。

通過TUNEL試劑盒檢測(cè)了各組小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖5所示， Dusp14-KO小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯比野生型小鼠增加（圖5A），Dusp14-TG小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯比非轉(zhuǎn)基因小鼠減少（圖5B），這表明Dusp14與肝細(xì)胞缺血再灌注時(shí)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，增加Dusp14表達(dá)可以抑制肝組織缺血再灌注損傷，且與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

上述結(jié)果表明，在肝臟缺血再灌注引起的損傷中，肝細(xì)胞特異性Dusp14基因敲除小鼠肝臟壞死面積顯著增加，肝功能明顯降低，肝細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯增多；而肝細(xì)胞特異性Dusp14轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死面積明顯減少，肝功能增強(qiáng)，肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。證明 Dusp14基因在肝臟缺血疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 雙特異性磷酸酶14（Dusp14）在肝缺血再灌注損傷中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggataagtca ttttctattg accattgg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggttctcccg agagggtttc tacgctgg 28

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 LA-F

<400> 7

ggggtacccc ggctcaatga tttcctct 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 LA-R

<400> 8

gcgtcgacca ttgggagatg tagcctgca 29

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 M-F

<400> 9

tctaccggtg tcaatagaaa atgacttata tgcttc 36

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 M-R

<400> 10

gaccttaagt agaaaccctc tcgggagaac 30

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 RA-F

<400> 11

cgacgcgtcg ctgggtgttc gggtt 25

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Dusp14 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgccctg gctgataaaa gggaaa 36

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 13

tgctctagag ccaccatgag ctccagaggt cacag 35

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 14

tgctctagac taaatccccc aataaggca 29