本發(fā)明涉及細(xì)胞制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心力衰竭(heartfailure)簡稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血。根據(jù)心力衰竭發(fā)生的緩急，臨床可分為急性心力衰竭和慢性心力衰竭。急性心衰會引發(fā)急性肺水腫，起病急，病情可迅速發(fā)展至危重狀態(tài)。突發(fā)的嚴(yán)重呼吸困難、端坐呼吸、喘息不止、煩躁不安并有恐懼感，呼吸頻率可達(dá)30～50次/分；頻繁咳嗽并咯出大量粉紅色泡沫樣痰；心率快，心尖部?？陕劶氨捡R律；兩肺滿布濕啰音和哮鳴音。還會引發(fā)心源性休克，表現(xiàn)為低血壓、組織低灌注狀態(tài)、血流動力學(xué)障礙、代謝性酸中毒和低氧血癥。急性心衰常危及生命，必須緊急搶救。目前的臨床治療主要采用藥物治療、介入治療和外科治療等手段：(1)初始治療為經(jīng)面罩或鼻導(dǎo)管吸氧；嗎啡、袢利尿劑、強(qiáng)心劑等經(jīng)靜脈給予。使患者取坐位或半臥位，兩腿下垂，減少下肢靜脈回流。(2)病情仍不緩解者應(yīng)根據(jù)收縮壓和肺淤血狀況選擇應(yīng)用血管活性藥物，如正性肌力藥、血管擴(kuò)張藥和血管收縮藥等。(3)病情嚴(yán)重、血壓持續(xù)降低(<90mmHg)甚至心源性休克者，應(yīng)監(jiān)測血流動力學(xué)，并采用主動脈內(nèi)球囊反搏、機(jī)械通氣支持、血液凈化、心室機(jī)械輔助裝置以及外科手術(shù)等各種非藥物治療方法。(4)動態(tài)測定BNP/NT-proBNP有助于指導(dǎo)急性心衰的治療，治療后其水平仍高居不下者，提示預(yù)后差，應(yīng)加強(qiáng)治療；治療后其水平降低且降幅>30％，提示治療有效，預(yù)后好。但這些治療方法只能在一定程度上緩解心力衰竭的發(fā)生。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和分化能力的多潛能細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界將其稱之為“萬用細(xì)胞”。經(jīng)過前人的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在適宜的細(xì)胞因子作用下可以作為一種藥物直接或者間接對受損的心肌細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)或者補(bǔ)充，目前已經(jīng)成為心衰治療的研究熱點之一。因此，研發(fā)一種可有效治療心衰的干細(xì)胞制劑成為必然趨勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該細(xì)胞制劑可有效治療心衰。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種細(xì)胞制劑，其包含間充質(zhì)干細(xì)胞的富血小板血漿。富血小板血漿(Platelet-richplasma，PRP)指的是自體全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，含有大量生長因子及蛋白質(zhì)。血小板中含有大量的生長因子，如表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等。由于其在組織再生方面發(fā)揮著十分重要的作用，近年來，它在臨床尤其是口腔的創(chuàng)傷及缺損修復(fù)中被人們所重視，并取得了令人較為滿意的效果。本發(fā)明將PRP與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合使用后，能夠更好地發(fā)揮間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)作用，從而可顯著提高左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)水平，并可顯著降低利鈉肽(BNP)水平，效果好于單獨使用間充質(zhì)干細(xì)胞或PRP，有效率可達(dá)80％～90％?？梢姡景l(fā)明細(xì)胞制劑可有效治療心衰。作為優(yōu)選，每mL富血小板血漿中含間充質(zhì)干細(xì)胞(1～10)×106個。在本發(fā)明提供的實施例中，每mL富血小板血漿中含間充質(zhì)干細(xì)胞1×106個。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每mL富血小板血漿中含間充質(zhì)干細(xì)胞5×106個。在本發(fā)明提供的另一實施例中，每mL富血小板血漿中含間充質(zhì)干細(xì)胞1×107個。在本發(fā)明提供的實施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。作為優(yōu)選，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了該細(xì)胞制劑的制備方法，包括如下步驟：采用富血小板血漿重懸間充質(zhì)干細(xì)胞，得到細(xì)胞制劑。在本發(fā)明中，間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法為：取包含間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，去除培養(yǎng)基，采用消化液進(jìn)行消化，得到單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，洗滌，得到間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明中，將外周血離心，獲得富血小板血漿。在本發(fā)明提供的實施例中，富血小板血漿的制備方法具體為：將外周血采用300g轉(zhuǎn)速離心5min，然后采用300g轉(zhuǎn)速離心5min，最后采用800g轉(zhuǎn)速離心5min。本發(fā)明還提供了該細(xì)胞制劑在制備提高LVEF水平或降低BNP水平藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該細(xì)胞制劑在制備治療心衰藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種藥物，包括本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑。該細(xì)胞制劑為包含間充質(zhì)干細(xì)胞的富血小板血漿。在本發(fā)明提供的實施例中，藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明提供了一種細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該細(xì)胞制劑為包括間充質(zhì)干細(xì)胞的富血小板血漿。本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，將間充質(zhì)干細(xì)胞和PRP聯(lián)合使用后，可顯著提高LVEF水平，并可顯著降低BNP水平，效果好于單獨使用間充質(zhì)干細(xì)胞或PRP，有效率可達(dá)80％～90％?？梢?，本發(fā)明細(xì)胞制劑可有效治療心衰。具體實施方式本發(fā)明公開了一種細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用中所用生物材料均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備從正規(guī)購買渠道獲得骨髓10mL，肝素抗凝后Percoll(1.073×10-3g/L)密度梯度離心，取中間單核細(xì)胞層以低糖DMEM洗滌2次，接種入75cm2培養(yǎng)瓶，以含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)。24h后換液，棄未貼壁的細(xì)胞，剩余的貼壁細(xì)胞是MSCs。每2～3天換液，待細(xì)胞生長至90％匯合后0.25％胰蛋白酶消化傳代。實施例2：PRP的制備取患者外周血10mL，300g離心5min，然后再一次300g離心5min，最后800g離心5min，獲得PRP。實施例3：細(xì)胞制劑的制備取實施例1制備的P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm，離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/mL。采用實施例2獲得的PRP重懸P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得細(xì)胞制劑，其組成如下表所示。表1實施例3細(xì)胞制劑組成組分含量P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1×106個/mLPRP3.5mL實施例4：細(xì)胞制劑的制備取實施例1制備的P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm，離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/mL。采用實施例2獲得的PRP重懸P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得細(xì)胞制劑，其組成如下表所示。表2實施例4細(xì)胞制劑組成組分含量P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106個/mLPRP3.5mL實施例5：細(xì)胞制劑的制備取實施例1制備的P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm，離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/mL。采用實施例2獲得的PRP重懸P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得細(xì)胞制劑，其組成如下表所示。表3實施例5細(xì)胞制劑組成組分含量P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1×107個/mLPRP3.5mL實施例6：細(xì)胞制劑評價對實施例3-5制得的細(xì)胞制劑進(jìn)行微生物檢測和內(nèi)毒素檢測。其中，微生物檢測(細(xì)菌、真菌)根據(jù)2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1100進(jìn)行檢測；內(nèi)毒素檢測根據(jù)2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1143進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果：實施例3-5制得的生物制劑在細(xì)菌、真菌和內(nèi)毒素的檢測中，均呈陰性，內(nèi)毒素報告顯示<0.25EU/mL。說明了該干細(xì)胞制劑的質(zhì)量合格，可用于創(chuàng)口的修復(fù)。實施例7：制劑的修復(fù)效果檢測試驗方法：采用心肌內(nèi)注射方式，對心衰造模成功的小鼠進(jìn)行制劑注射。取60只心衰造模成功的小鼠，分為6組，包括陰性對照組、3組實驗組、干細(xì)胞組和PRP組：陰性對照組：采用β受體阻滯劑常規(guī)治療手段；實驗組：分別用實施例3-5制得的制劑進(jìn)行治療；干細(xì)胞組：采用實施例1獲得的干細(xì)胞進(jìn)行治療；PRP組：采用實施例2獲得的PRP進(jìn)行治療。各組對小鼠的注射劑量如下：表4各組對小鼠的注射劑量組別小鼠數(shù)量(只)劑量陰性對照組28——實施例3281mL實施例4281mL實施例5281mL干細(xì)胞組282×107個PRP組282mL8周后觀察小鼠的LVEF和BNP水平等指標(biāo)，評判治療的有效率。有效率計算方式為：LVEF和BNP指標(biāo)顯著改善的小鼠數(shù)量/28。結(jié)果如下表所示：表5小鼠的LVEF和BNP水平等指標(biāo)注：*表示與對照組相比具有顯著性差異，p<0.05。由上述試驗結(jié)果可知，將間充質(zhì)干細(xì)胞和PRP聯(lián)合使用后，可顯著提高LVEF水平，并可顯著降低BNP水平，效果好于單獨使用間充質(zhì)干細(xì)胞或PRP，有效率可達(dá)80％～90％?？梢?，本發(fā)明細(xì)胞制劑可有效治療心衰。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3