本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種干擾素調(diào)節(jié)因子2結(jié)合蛋白2（Interferonregulatoryfactor2bindingprotein2，IRF2BP2）作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一組以血葡萄糖水平增高為特征的慢性代謝性疾病，其患病率正隨著人類生活水平的提高、生活方式的改變、人口老齡化以及早期篩查率的提高而急劇增加，逐漸成為繼惡性腫瘤和心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。目前我國20歲以上人群糖尿病的患病率為10.3~12.8%，而糖尿病前期的患病率更是高達(dá)14.7%。1980年開展的人口糖尿病調(diào)查發(fā)現(xiàn)其患病率僅為0.67%；1994年糖尿病普查發(fā)現(xiàn)患病率上升至2.28%；1996年對人口的糖尿病抽樣調(diào)查顯示患病率為3.62%；2002年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國城市糖尿病患病率約為4.5%，農(nóng)村為1.8%；2010年人口糖尿病調(diào)查顯示其患病率已高達(dá)9.65%[1]?？傊?，目前中國糖尿病患者總數(shù)高居世界第一的事實(shí)已經(jīng)不容爭辯，并且世界衛(wèi)生組織預(yù)測至2025年全球糖尿病患者將突破1.3億大軍，而用于這部分疾病管理的費(fèi)用將占醫(yī)療總開支的40%[2]，將為人類社會(huì)帶來極其沉重的負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織（1999年）依據(jù)糖尿病病因及發(fā)病機(jī)制將其分為Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病約占糖尿病總數(shù)的90%。Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，胰島素抵抗與胰島素β細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是其發(fā)病的重要機(jī)制。Ⅱ型糖尿病的多種慢性并發(fā)癥如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病相關(guān)的心腦血管疾病以及“糖尿病足”已得到人們的充分認(rèn)識(shí)，也是其致死致殘的主要原因。此外，糖尿病與非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）之間的聯(lián)系也得到了廣泛關(guān)注，非酒精性脂肪肝是一種與肥胖和Ⅱ型糖尿病相互影響的臨床綜合征。NAFLD確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，其中胰島素抵抗及其相關(guān)代謝紊亂在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。研究顯示，NAFLD是Ⅱ型糖尿病發(fā)病率和死亡率的主要促進(jìn)因素，因而研究Ⅱ型糖尿病與NAFLD之間的關(guān)系以及防治Ⅱ型糖尿病的慢性并發(fā)癥顯得尤為重要。IRF2BP2是一種屬于IRF2BP家族的轉(zhuǎn)錄因子。IRF2BP家族包括IRF2BP1、IRF2BP2和IRF2BPL三個(gè)成員，其中IRF2BP2包括兩種選擇性剪接亞型IRF2BP2A和IRF2BP2B。IRF2BP2包含一個(gè)大約64個(gè)氨基酸組成的N末端鋅指結(jié)構(gòu)域（Zincfingerdomain）和一個(gè)大約82個(gè)氨基酸組成的C末端指環(huán)結(jié)構(gòu)域（RINGfingerdomain），二者是IRF2BP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，在眾多細(xì)胞病理生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。IRF2BP2最早通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選作為IRF2的轉(zhuǎn)錄因子共同作用因子被鑒定[3]。研究表明，IRF2BP2作為p53的靶基因通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（ChromatinImmunoprecipitationAssay）得到了驗(yàn)證，同時(shí)IRF2BP2能夠作為p53的轉(zhuǎn)錄共抑制因子，抑制p53下游的基因如p21和BAX的表達(dá)，從而在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等生物過程中發(fā)揮重要作用[4]；IRF2BP2與NFAT1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，抑制NFAT1下游基因的初始轉(zhuǎn)錄及增強(qiáng)子活化性轉(zhuǎn)錄[5]；當(dāng)心肌和骨骼肌處于缺血狀態(tài)時(shí)，IRF2BP2作為VGLL4（Vestigial-like4）的共激活因子，促進(jìn)VEGFA（VascularendothelialgrowthfactorA）表達(dá)進(jìn)而在血管再生中發(fā)揮重要作用[6]；在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，IRF2BP2與MEF2（Myocyteenhancerfactor2）互相作用共同促進(jìn)KLF2（Kruppel-likefactor2）的表達(dá)，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化和促進(jìn)膽固醇代謝平衡[7]；IRF2BP2能夠與其家族中的另兩個(gè)成員IRF2BP1和IRF2BPL結(jié)合，三者共同形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，IRF2BP2與ETO2（Eight-twenty-one2）相互結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄共抑制因子，在紅細(xì)胞的分化發(fā)育過程中作用顯著[9]。除此之外，IRF2BP2基因分別與CDX1和BCL1/JH等基因形成融合基因在間葉細(xì)胞軟骨肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮作用[10,11]。參考文獻(xiàn)：[1]廖涌.中國糖尿病的流行病學(xué)現(xiàn)狀及展望[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,40（7）.[2]FaragYM,GaballaMR.Diabesity:anoverviewofarisingepidemic[J].NephrolDialTransplant,2011,26(1):28-35.[3]ChildsKS,GoodbournS.Identificationofnovelco-repressormoleculesforInterferonRegulatoryFactor-2[J].NucleicAcidsRes,2003,31(12):3016-3026.[4]KoeppelM,vanHeeringenSJ,SmeenkL,etal.Thenovelp53targetgeneIRF2BP2participatesincellsurvivalduringthep53stressresponse[J].NucleicAcidsRes,2009,37(2):322-335.[5]CarneiroFR,Ramalho-OliveiraR,MognolGP,etal.Interferonregulatoryfactor2bindingprotein2isanewNFAT1partnerandrepressesitstranscriptionalactivity[J].MolCellBiol,2011,31(14):2889-2901.[6]TengAC,KuraitisD,DeekeSA,etal.IRF2BP2isaskeletalandcardiacmuscle-enrichedischemia-inducibleactivatorofVEGFAexpression[J].FASEBJ,2010,24(12):4825-4834.[7]ChenHH,KeyhanianK,ZhouX,etal.IRF2BP2ReducesMacrophageInflammationandSusceptibilitytoAtherosclerosis[J].CircRes,2015,117(8):671-683.[8]YeungKT,DasS,ZhangJ,etal.AnoveltranscriptioncomplexthatselectivelymodulatesapoptosisofbreastcancercellsthroughregulationofFASTKD2[J].MolCellBiol,2011,31(11):2287-2298.[9]StadhoudersR,CicoA,StephenT,etal.Controlofdevelopmentallyprimederythroidgenesbycombinatorialco-repressoractions[J].NatCommun,2015,6:8893.[10]NyquistKB,PanagopoulosI,ThorsenJ,etal.Whole-transcriptomesequencingidentifiesnovelIRF2BP2-CDX1fusiongenebroughtaboutbytranslocationt(1;5)(q42;q32)inmesenchymalchondrosarcoma[J].PLoSOne,2012,7(11):e49705.[11]NiIB,ChingNC,MengCK,etal.Translocationt(11;14)(q13;q32)andgenomicimbalancesinmulti-ethnicmultiplemyelomapatients:aMalaysianstudy[J].HematolRep,2012,4(3):e19。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種IRF2BP2基因的表達(dá)與脂肪肝和Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的靶基因IRF2BP2的新用途，進(jìn)而將IRF2BP2基因應(yīng)用于脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的治療。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明以基因敲除工具鼠（Alb-cre）與IRF2BP2肝細(xì)胞特異性基因敲除小鼠（IRF2BP2Δ/Δ）為實(shí)驗(yàn)對象，通過高脂飲食（Highfatdiet）誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型（dietinducedobesity，DIO）研究IRF2BP2基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Alb-cre小鼠相比，IRF2BP2Δ/Δ小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重及空腹血糖水平明顯高于高脂飼料飼養(yǎng)的Alb-cre小鼠，進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及病理染色結(jié)果等均表明高脂飲食誘導(dǎo)后IRF2BP2Δ/Δ小鼠脂肪肝病變更嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。以上這些結(jié)果表明肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除會(huì)加劇脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，IRF2BP2基因能夠抑制脂肪肝和Ⅱ型糖尿病。本發(fā)明人的研究證明了：在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝和Ⅱ型糖尿病模型中，IRF2BP2具有抑制肥胖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護(hù)肝臟功能；降低血糖，增強(qiáng)葡糖耐受能力。針對IRF2BP2的上述功能，提供IRF2BP2作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)肝臟及維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的藥物中的應(yīng)用。針對IRF2BP2的上述功能，提供IRF2BP2作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。以上藥物是指能夠促進(jìn)IRF2BP2基因表達(dá)的藥物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF2BP2基因的新功能，即IRF2BP2基因具有能夠保護(hù)脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病的作用。（2）基于IRF2BP2在保護(hù)脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖。圖2是Alb-cre和IRF2BP2Δ/Δ小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖（*：p＜0.05vsAlb-creNC組，**：p＜0.01vsAlb-creNC組，#：p＜0.05vsAlb-creHFD組，##：p＜0.01vsAlb-creHFD組）。圖3是Alb-cre和IRF2BP2Δ/Δ小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積（areaunderthecurve,AUC）比較圖（**：p＜0.01vsAlb-creNC組，##：p＜0.01vsAlb-creHFD組）。圖4是Alb-cre和IRF2BP2Δ/Δ小鼠肝臟重量、肝臟重/體重比圖；A為肝臟重量、B為肝臟重量與體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖（##：p＜0.01vsAlb-creHFD組）。圖5是Alb-cre和IRF2BP2Δ/Δ小鼠肝臟組織HE和油紅O染色圖。具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6小鼠、IRF2BP2肝臟特異性基因敲除（IRF2BP2Δ/Δ）小鼠和肝細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Alb-Cre（購自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574），雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，IRF2BP2肝臟特異性基因敲除小鼠由IRF2BP2-flox小鼠Alb-Cre雜交得到，構(gòu)建策略見圖1。肝臟特異性IRF2BP2基因敲除小鼠的構(gòu)建：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign（網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/）分別在內(nèi)含子1和外顯子2的非編碼區(qū)中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為:IRF2BP2sgRNA1:GGGTTGATAGGCAGCGACACGGGGIRF2BP2sgRNA2:GGCTATATTTTTTTTGACGACAAAAGG此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒（DonorVector），它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。（1）打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。（2）條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。（3）供體載體的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物（表1）用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂（LA和RA）以及中間的外顯子部分（M）。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物連接入經(jīng)表1中3對限制性內(nèi)切酶依次酶切的pBluescriptSK(+)-2loxp載體中，得到DonorVector。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對應(yīng)酶切位點(diǎn)引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)IRF2BP2LA-FCCGCTCGAGCCAACGGGTTCTCCAAACTGXhoIIRF2BP2LA-RATGGACGTCGTCGCTGCCTATCAACCCAatIIIRF2BP2M-FCCGGAATTCACGGGGTTTTCCTTTCCEcoRIIRF2BP2M-RGGCGATATCGTCGTCAAAAAAAATATAGAAACACEcoRVIRF2BP2RA-FCGACGCGTAAAAGGTATGTACTTTAAGGCATTTTCMluIIRF2BP2RA-RATAAGAATGCGGCCGCTGCAGTAAGCACTCGTCACANotI（4）打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分（負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA）分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體（pST1374-Cas9）用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒（AM1345，Ambion）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒（Ambion）對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscript?Kit（AM1354，Ambion公司）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiagen，217084）進(jìn)行純化。（5）IRF2BP2-flox條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體載體一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得IRF2BP2-flox純合小鼠。（6）肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除小鼠的制作將上述IRF2BP2-flox小鼠與肝臟特異性Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到IRF2BP2flox/flox/Alb-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料（Highfatdiet，HFD）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942）：熱量百分比：蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%，脂肪60%；總的熱量質(zhì)量比5.24kcal/g。低脂飼料（Normalchow，NC）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B）：熱量百分比：蛋白質(zhì)20%，碳水化合物70%，脂肪10%；總的熱量質(zhì)量比3.85kcal/g。動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2℃，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食?！緦?shí)施例1】小鼠脂肪肝和Ⅱ型糖尿病模型（dietinducedobesity，DIO）獲得（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，Alb-cre小鼠和IRF2BP2Δ/Δ小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即Alb-creNC組，IRF2BP2Δ/ΔNC組，Alb-creHFD組，IRF2BP2Δ/ΔHFD組共4個(gè)組別。（2）模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：采用Alb-cre和IRF2BP2Δ/Δ小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確IRF2BP2基因?qū)χ靖魏廷蛐吞悄虿“l(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，Alb-cre小鼠和IRF2BP2Δ/Δ小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即Alb-creNC組，IRF2BP2Δ/ΔNC組，Alb-creHFD組，IRF2BP2Δ/ΔHFD組共4個(gè)組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測1次。實(shí)驗(yàn)第10周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT），以評價(jià)小鼠機(jī)體對葡萄糖耐受能力。第12周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑（TissueFreezingMedium）包埋作為病理分析用?！緦?shí)施例2】小鼠體重、血糖水平測定（1）小鼠空腹體重檢測a.體重檢測①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食（不禁水），下午2:00開始實(shí)驗(yàn)操作。②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)b.空腹血糖水平檢測實(shí)驗(yàn)將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食（不禁水），即禁食6小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)操作。①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀（美國強(qiáng)生公司，ONETOUCH）電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條的相對應(yīng)代碼，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀器處于待測狀態(tài)。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：使用眼科剪刀迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處將鼠尾剪下，待血滴自行流出。④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖2所示，Alb-cre小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第2周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與IRF2BP2Δ/Δ小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第2周開始HFD組的IRF2BP2Δ/Δ小鼠體重明顯高于HFD組的Alb-cre小鼠體重，一直持續(xù)到第12周（見圖2A）；經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周、4周、6周、8周、10周、12周的空腹血糖水平明顯比相應(yīng)NC對照組升高，且HFD組的IRF2BP2Δ/Δ小鼠空腹血糖水平也明顯高于Alb-cre小鼠空腹血糖水平（見圖2B）。表明肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，IRF2BP2基因能顯著提高小鼠的糖代謝穩(wěn)態(tài)，表明IRF2BP2在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用?！緦?shí)施例3】葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT）實(shí)驗(yàn)第10周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT），以評價(jià)小鼠機(jī)體對糖耐受能力。（1）在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。（2）先檢測進(jìn)行葡萄糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖水平，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。（3）腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行小段距離，穿過腹部中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。（4）分別于腹腔注射后15、30、60、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪去尾部測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時(shí)間。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT）來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第10周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的Alb-cre小鼠和IRF2BP2Δ/Δ小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平（0分鐘時(shí)血糖），Alb-cre小鼠在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且IRF2BP2Δ/Δ小鼠血糖水平從0分鐘至2小時(shí)一直處于高于Alb-cre小鼠的血糖水平（圖3A）。比較各組小鼠血糖曲線下面積（areaunderthecurve，AUC），發(fā)現(xiàn)Alb-cre小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，IRF2BP2Δ/ΔHFD組的AUC顯著大于Alb-creHFD組的AUC（圖3B），表明IRF2BP2對維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的調(diào)控能力?！緦?shí)施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測定（1）終末肝臟組織取材a.小鼠稱重后，迅速使用頸椎脫臼法將其處死。仰臥位固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。b.用鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。c.迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)器皿中，迅速拍照，稱重。d.石蠟標(biāo)本：切取部分肝臟置于10%中性福爾馬林中固定。冰凍標(biāo)本：切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。（2）肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實(shí)驗(yàn)a.肝臟脫水，透明，浸蠟切取10%中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標(biāo)記的包埋框內(nèi)，在小流量流水下沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機(jī)器上設(shè)置程序，①脫水：75%酒精（45分鐘）→75%酒精（45分鐘）→85%酒精（45分鐘）→85%酒精（45分鐘）→95%酒精（45分鐘）→95%酒精（45分鐘）→無水酒精（1小時(shí)）→無水酒精（1小時(shí)）；②透明：二甲苯（1小時(shí)）→二甲苯（1小時(shí)）；③浸臘（65℃）：石蠟（1小時(shí)）→石蠟（1小時(shí)）。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進(jìn)機(jī)器籃筐內(nèi)，啟動(dòng)上述程序。上述程序完成后，取出盛放組織的包埋框，送病理室包埋組織，同時(shí)清洗機(jī)器備用。b.肝臟組織切片使用切片機(jī)切片（切片厚度5μm）。c.肝臟組織蘇木素-伊紅（HE）染色將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱（30分鐘）→二甲苯中（5分鐘×3次）→100%酒精（1分鐘）→90%酒精（1分鐘）→70%酒精（1分鐘）→蒸餾水洗→蘇木素（5分鐘）→自來水洗去切片上的浮色→1%鹽酸酒精（1至3秒）→自來水洗數(shù)下→Scott液（碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL）（1分鐘）→自來水洗數(shù)下→伊紅（1分鐘）→蒸餾水洗去切片上的浮色→70%酒精一下→90%酒精一下→100%酒精（30秒×3次）→二甲苯（2分鐘×3次）→在二甲苯未干時(shí)封片，拍照。d.肝臟組織油紅O染色①將冰凍肝臟組織切片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干30分鐘，4%多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。②以60%異丙醇處理1分鐘。③用油紅O（公司sigma，貨號(hào)O0625，濃度0.5克/100mL100%異丙醇）染色30分鐘。之后以60%異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。用Mayer’s蘇木素染液（5滴）淡染細(xì)胞核。水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，充分水洗，水洗至細(xì)胞核藍(lán)化。用甘油明膠封片，拍照。肝臟大體外觀結(jié)果見圖4所示，HFD組的IRF2BP2Δ/Δ小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的Alb-cre小鼠高（如圖4）。進(jìn)一步通過組織切片，進(jìn)行HE和油紅O染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，Alb-cre小鼠和IRF2BP2Δ/Δ小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，Alb-cre組小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細(xì)胞形態(tài)幾乎完全破壞，而IRF2BP2Δ/Δ組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)變化更為嚴(yán)重（如圖5上）。通過肝臟油紅O染色來檢測肝組織中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的Alb-cre小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積，而在HFD組的IRF2BP2Δ/Δ小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著（如圖5下）。這些結(jié)果說明肝細(xì)胞特異性IRF2BP2基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。上述結(jié)果顯示IRF2BP2Δ/Δ小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的脂肪肝病變和Ⅱ型糖尿病顯著加重。這些結(jié)果表明IRF2BP2基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明IRF2BP2基因在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>干擾素調(diào)節(jié)因子2結(jié)合蛋白2在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>IRF2BP2sgRNA1<400>1gggttgataggcagcgacacgggg24<210>2<211>27<212>DNA<213>IRF2BP2sgRNA2<400>2ggctatattttttttgacgacaaaagg27<210>3<211>29<212>DNA<213>IRF2BP2LA-F<400>3ccgctcgagccaacgggttctccaaactg29<210>4<211>27<212>DNA<213>IRF2BP2LA-R<400>4atggacgtcgtcgctgcctatcaaccc27<210>5<211>26<212>DNA<213>IRF2BP2M-F<400>5ccggaattcacggggttttcctttcc26<210>6<211>34<212>DNA<213>IRF2BP2M-R<400>6ggcgatatcgtcgtcaaaaaaaatatagaaacac34<210>7<211>35<212>DNA<213>IRF2BP2RA-F<400>7cgacgcgtaaaaggtatgtactttaaggcattttc35<210>8<211>36<212>DNA<213>IRF2BP2RA-R<400>8ataagaatgcggccgctgcagtaagcactcgtcaca36當(dāng)前第1頁1 2 3