本發(fā)明涉及一種含有葡萄糖激酶激動(dòng)劑和B族維生素的藥物組合物，屬于藥學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖伴隨因胰島素分泌不足和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2011年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3.7億，其中80％在發(fā)展中國家，估計(jì)到2030年全球?qū)⒂薪?.5億糖尿病患者。2011年全球共有460萬人死于糖尿病，當(dāng)年糖尿病的全球醫(yī)療花費(fèi)達(dá)4650億美元。其中糖尿病在中國和其他發(fā)展中國家中的快速增長，已給這些國家的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了沉重負(fù)擔(dān)。2007～2008年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)在我國部分地區(qū)開展的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，在20歲以上的人群中，糖尿病患病率為9.7％，糖尿病前期的比例為15.5％【中國2型糖尿病防治指南(2013年版)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國糖尿病雜志，2014；8：1-41】。

糖尿病隨病程進(jìn)展常發(fā)生血管并發(fā)癥，包括大血管病變和微血管病變，導(dǎo)致心、腦、腎、眼等器官的慢性進(jìn)行性損害，糖尿病的危害主要來自這些并發(fā)癥，也是醫(yī)療費(fèi)用增加的主要原因。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)的報(bào)道，我國糖尿病血管并發(fā)癥的患病率為：高血壓31.9％、腦血管病12.2％、心血管病15.9％、下肢血管病5.0％、腎臟病(腎微血管病變)33.6％、視網(wǎng)膜病變24.3％，總患病率73.2％【中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)慢性并發(fā)癥調(diào)查組.全國住院糖尿病患者慢性并發(fā)癥及其相關(guān)危險(xiǎn)因素10年回顧性調(diào)查分析.中國糖尿病雜志，2003；11：232-237】。糖尿病的治療目標(biāo)是使血糖達(dá)到或接近正常水平，糾正代謝紊亂，防止或延緩并發(fā)癥，降低病死率。

中國2型糖尿病防治指南(2013年版)公布口服降糖藥物包括雙胍類、磺脲類、噻唑烷二酮類、格列奈類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、二肽基肽酶-4抑制劑、GLP-1受體激動(dòng)劑等。2003年首個(gè)研發(fā)階段的葡萄糖激酶激動(dòng)劑(GKA)誕生，葡萄糖激酶主要由肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞特異性分泌，它不但能夠催化細(xì)胞的葡萄糖磷酸化，還能促進(jìn)胰島素分泌和加速體內(nèi)葡萄糖的分解代謝，具有調(diào)控體內(nèi)血糖平衡的功能。GKA能夠與葡萄糖激酶的某些氨基酸殘基如Lys169、Arg63、Tyr215等結(jié)合，從而調(diào)節(jié)葡萄糖激酶活性。目前臨床在研的GKA有TTP399、HMS5552(Sinogliatin)、PF-04937319、LY2608204、PF-04991532、GKM-001等【余剛，葡萄糖激酶激活劑研究進(jìn)展。藥學(xué)進(jìn)展，2016,40(3)：168-177】。

B族維生素包括維生素B₁、維生素B₂、維生素PP、維生素B₆、維生素B₁₂、葉酸、泛酸和生物素等，對(duì)機(jī)體新陳代謝、紅細(xì)胞形成、保持神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能具有重要作用。B族維生素屬于水溶性維生素，經(jīng)人體腸道吸收，由尿排出體外，在體內(nèi)存留時(shí)間短暫，很少蓄積，所以必須經(jīng)常從體外攝取以滿足機(jī)體營養(yǎng)和代謝需要。B族維生素缺乏可導(dǎo)致諸多不良后果，包括肌無力、精神混亂、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、消化障礙、皮膚皺裂、嚴(yán)重貧血和心臟損害等。其中，葉酸、維生素B₆、維生素B₁₂補(bǔ)充不足時(shí)影響人體內(nèi)同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的生化代謝，而目前認(rèn)為Hcy是一種心血管危險(xiǎn)因子，尤其是易對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生損害。

糖尿病的血管病變是多因素長期作用的結(jié)果，不僅有慢性高血糖這一重要因素，還有其它復(fù)雜因素的參與。目前市場(chǎng)上抗糖尿病藥物多注重糾正糖尿病的血糖異常狀態(tài)和代謝紊亂，而忽略了對(duì)引發(fā)糖尿病并發(fā)癥(例如糖尿病血管病變)的復(fù)合危險(xiǎn)因素的早期干預(yù)。糖尿病治療的重要目標(biāo)之一即是預(yù)防或延緩各種并發(fā)癥，從而降低病死率，所以需要對(duì)各種并存的損害因素或疾病進(jìn)行處理。因此，如何提高GKA的臨床應(yīng)用價(jià)值、加強(qiáng)對(duì)糖尿病合并高Hcy血癥的血管保護(hù)或降低糖尿病引發(fā)血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)，無論從治療抑或預(yù)防的角度，都值得深入研究，以解決臨床實(shí)際問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服葡萄糖激酶激活劑存在的不足，提供一種在預(yù)防或延緩糖尿病血管并發(fā)癥方面優(yōu)于葡萄糖激酶激活劑、而毒副作用不增加的藥物組合物(復(fù)方藥物及制劑)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種藥物組合物，包括

(1)藥用劑量的葡萄糖激酶激活劑(GKA)及其藥用前體、活性代謝產(chǎn)物或其鹽類中的一種；

(2)藥用劑量的B族維生素的一種或幾種；

(3)藥劑學(xué)上可接受的載體。

上述的“藥用劑量”是指具有協(xié)同、預(yù)防或治療效應(yīng)的藥理作用的量。

所述的GKA選自TTP399、HMS5552、PF-04937319、LY2608204、PF-04991532、GKM-001的一種。

通過實(shí)驗(yàn)研究，GKA的含量分別為：TTP399(500～1000mg)、HMS5552(50～300mg)，上述物質(zhì)藥用前體、活性代謝產(chǎn)物或鹽類的含量與相應(yīng)的上述物質(zhì)含量等同。

所述的B族維生素選自維生素B₆、維生素B₁₂和葉酸類化合物的一種或幾種。

所述維生素B₆包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物質(zhì)的衍生物和可在體內(nèi)代謝和/或生成該類化合物的物質(zhì)。

所述維生素B₁₂包括鈷胺素、甲鈷胺素、5’-脫氧腺苷鈷胺素、羥鈷胺素、氰鈷胺素及上述物質(zhì)的衍生物和可在體內(nèi)代謝和/或生成該類化合物的物質(zhì)。

所述葉酸類化合物包括葉酸、5-甲基四氫葉酸(簡(jiǎn)稱5-MTHF)、甲酰四氫葉酸、亞葉酸、左亞葉酸鈣、葉酸可藥用鹽、葉酸或葉酸可藥用鹽的活性代謝產(chǎn)物和可在體內(nèi)代謝和/或生成葉酸的物質(zhì)。

B族維生素在本發(fā)明中的治療有效量分別為：0.1mg～5mg的葉酸類化合物，5～50mg的維生素B₆，0.01～1mg的維生素B₁₂；其更佳的治療有效量分別為：0.4～1.6mg葉酸類化合物，10mg～40mg維生素B₆，0.05～0.5mg維生素B₁₂。

研究發(fā)現(xiàn)，B族維生素與GKA合用時(shí)，能協(xié)同增強(qiáng)后者的降血糖作用，并能協(xié)同加強(qiáng)對(duì)糖尿病引起血管損害的預(yù)防或緩解作用。因此，本發(fā)明提供了含有藥用劑量的GKA、藥用劑量的B族維生素及藥劑學(xué)上可接受的載體的藥物組合物在制備用于治療糖尿病、預(yù)防及延緩糖尿病血管并發(fā)癥及相關(guān)疾病的藥物中的用途。

糖尿病引起的血管并發(fā)癥包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病足等。

根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物中的活性成分是組合物中的基本組分，其中一個(gè)活性成分來自于GKA中的一種，另一個(gè)活性成分為B族維生素的一種或多種，該藥物組合物的劑型包括但不限于普通片劑、雙層片劑、多層片劑、緩釋片劑、單室控釋片劑、雙室控釋片劑、微孔型控釋片劑、舌下含片、口腔速崩片、分散片、腸溶片、顆粒劑、丸劑、腸溶膠囊、延遲釋放片、定時(shí)/位釋放片、普通膠囊、緩釋膠囊、控釋膠囊、含有微丸或小片的膠囊、含有微丸或小片的pH依賴型膠囊、口服液、膜劑或貼劑。特別指出的是，將含有GKA和B族維生素的一種或多種藥物組合物制成片劑或膠囊。

該藥物組合物中還含有藥劑學(xué)可接受的載體，可制成普通口服制劑，包括普通片劑、普通膠囊、顆粒劑等，制成片劑時(shí)所述可藥用載體包括有助于將活性化合物配制成藥用制劑的賦形劑和輔藥，如微晶纖維素、無機(jī)鹽類、乳糖、氯化鈉、檸檬酸和亞硫酸鈉等的一種或幾種物質(zhì)的組合物，屬于本領(lǐng)域常識(shí)。

本發(fā)明提供的藥物組合物中的化合物在相同的制劑中可以同時(shí)施與患病個(gè)體，也可分別地相繼施與個(gè)體。若是相繼施與，則第二個(gè)活性成分施與的延遲不應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致活性成分聯(lián)合帶來的有益效果的損失。若是同時(shí)施與患病個(gè)體，組合物中的化合物可以混合存在于同一個(gè)藥物制劑形式中，也可以以同樣的制劑形式分別獨(dú)立存在。若是以同樣的制劑形式分別獨(dú)立存在，則藥物組合物可以變通地以“組合藥盒”形式存在?！敖M合藥盒”是一種盒狀容器，內(nèi)置一種或多種劑量形式的藥物組合及使用說明書，在本發(fā)明中優(yōu)選GKA中的一種和B族維生素的一種或幾種組成“藥盒”。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有藥用劑量的GKA及其藥用前體、活性代謝產(chǎn)物或其鹽類中的一種、藥用劑量的B族維生素的一種或多種和可藥用載體的藥物組合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。本發(fā)明提供的藥物組合物因能夠治療糖尿病、防治和延緩糖尿病血管并發(fā)癥，因而成為更適宜的抗糖尿病藥物。其中，GKA選自TTP399、HMS5552、PF-04937319、LY2608204、PF-04991532、GKM-001的一種，B族維生素選自維生素B₆、維生素B₁₂和葉酸類化合物中的一種或幾種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了含有藥用劑量的GKA的一種、藥用劑量的B族維生素的一種或幾種和可藥用載體的藥物組合物。GKA和B族維生素的聯(lián)合效果并不是各個(gè)活性物質(zhì)的各自作用的簡(jiǎn)單相加，而是導(dǎo)致2型糖尿病患者的在顯著改善高血糖的基礎(chǔ)上減少血管并發(fā)癥的發(fā)生。也就是說，GKA和B族維生素聯(lián)合用藥取得了協(xié)同治療效果，因此是更適宜的抗糖尿病藥物。

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，凡依照本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.制備復(fù)方TTP399/5-甲基四氫葉酸片(1000片量)

制備方法：取處方量5-MTHF、TTP399按照等量遞增法混合均勻，備用；稱取處方量的微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、羧甲淀粉鈉，與原料藥混合粉充分混勻，過80目篩，加入適量5％聚維酮95％乙醇溶液制成軟材，20目篩制粒，50℃干燥約6h，20目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與處方量的硬脂酸鎂混合均勻，中間體進(jìn)行檢測(cè)，壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝。制成的復(fù)方片劑中每片含TTP399 500mg、5-MTHF 0.8mg。

實(shí)施例2.制備復(fù)方TTP399/葉酸片(1000片量)

制備方法：輔料為直壓輔料，干燥備用。取處方量的葉酸及微晶纖維素30g按照等量遞增法混合均勻，得到混粉1；稱取剩余處方量的微晶纖維素、乳糖、羧甲淀粉鈉，與TTP399按等量遞增法充分混勻，得到混粉2；將混粉1和混粉2與處方量的山愈酸甘油酯混合均勻，得最終混粉中間體，檢測(cè)混粉中間體，壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝，避光保存。制成的復(fù)方片劑中每片含TTP399 800mg、葉酸0.4mg。

實(shí)施例3.制備復(fù)方TTP399/甲酰四氫葉酸/維生素B₁₂膠囊(1000粒量)

制備方法：取處方量甲酰四氫葉酸、維生素B₁₂、TTP399按照等量遞增法混合均勻，備用；再與微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉混合均勻后，過80目篩，加入5％聚維酮95％乙醇溶液適量，制軟材，50℃干燥約6h過24目篩制顆粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與處方量微粉硅膠、山愈酸甘油酯混合均勻，得到的顆粒中間體進(jìn)行含量檢測(cè)，檢測(cè)合格后，裝入空心膠囊即得。制備過程中注意避光，制成的膠囊需鋁塑泡罩包裝，避光保存。制成的膠囊中每粒TTP399 500mg、甲酰四氫葉酸0.6mg、維生素B₁₂ 0.1mg。

實(shí)施例4.制備復(fù)方HMS5552/5-甲基四氫葉酸片(1000片量)

制備方法：取處方量5-MTHF、HMS5552按照等量遞增法混合均勻，備用；稱取處方量的微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、羧甲淀粉鈉，與原料藥混合粉充分混勻，過80目篩，加入適量5％聚維酮95％乙醇溶液制成軟材，20目篩制粒，50℃干燥約6h，20目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與處方量的硬脂酸鎂混合均勻，中間體進(jìn)行檢測(cè)，壓制成1000片。制成的片劑需鋁塑泡罩包裝。制成的復(fù)方片劑中每片含HMS5552 50mg、5-MTHF 0.8mg。

實(shí)施例5.制備復(fù)方HMS5552/葉酸片(1000片量)

制備方法：輔料為直壓輔料，干燥備用。取處方量的葉酸及微晶纖維素30g按照等量遞增法混合均勻，得到混粉1；稱取剩余處方量的微晶纖維素、乳糖、羧甲淀粉鈉，與HMS5552按等量遞增法充分混勻，得到混粉2；將混粉1和混粉2與處方量的山愈酸甘油酯混合均勻，得最終混粉中間體，檢測(cè)混粉中間體，壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝，避光保存。制成的復(fù)方片劑中每片含HMS5552 75mg、葉酸0.8mg。

實(shí)施例6.制備復(fù)方HMS5552/葉酸片(1000片量)

制備方法同實(shí)施例5，制成的復(fù)方片劑中每片含HMS5552 100mg、葉酸0.8mg。

實(shí)施例7.制備復(fù)方HMS5552/甲酰四氫葉酸/維生素B₁₂膠囊(1000粒量)

制備方法：取處方量甲酰四氫葉酸、維生素B₁₂、HMS5552按照等量遞增法混合均勻，備用；再與微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉混合均勻后，過80目篩，加入5％聚維酮95％乙醇溶液適量，制軟材，50℃干燥約6h過24目篩制顆粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與處方量微粉硅膠、山愈酸甘油酯混合均勻，得到的顆粒中間體進(jìn)行含量檢測(cè)，檢測(cè)合格后，裝入空心膠囊即得。制備過程中注意避光，制成的膠囊需鋁塑泡罩包裝，避光保存。制成的膠囊中每粒HMS5552 75mg、甲酰四氫葉酸0.8mg、維生素B₁₂ 0.1mg。

實(shí)施例8.制備HMS5552/5-甲基四氫葉酸/維生素B₆雙層片

配方：

HMS5552層顆粒A的制備方法：將原輔料粉碎過80目篩，干燥備用。取50gHMS5552、122.0g維晶纖維素和18.0g羧甲淀粉鈉，按照等量遞增法均勻混合，用3％羧甲纖維素鈉溶液制成軟材，20目篩制粒，50℃干燥約6h，20目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，得到HMS5552層顆粒A；

維生素層顆粒B的制備方法：取0.8g 5-MTHF、10g維生素B₆、220.0g微晶纖維素和20.0g低取代羥丙基纖維素，按照等量遞增法均勻混合，用5％聚維酮K29/32-95％乙醇溶液制成軟材，20目篩制粒，50℃干燥約6h，20目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，得到維生素層顆粒B；

雙層片的制備方法：將干燥后的顆粒A與硬脂酸鎂混合均勻，將干燥后的顆粒B與山愈酸甘油酯混合均勻；半成品分別進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定含量后，分別裝入料斗中，用雙層片壓片機(jī)壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝，避光保存。制成的復(fù)方片劑中每片含50mg的HMS5552、0.8mg的5-MTF、10mg維生素B₆。

實(shí)施例9. HMS5552+5-MTHF組合物對(duì)糖尿病大鼠的降糖、血管保護(hù)作用

方法：(1)鏈脲佐菌素溶液：稱取600mg鏈脲佐菌素(STZ)臨用前溶于200ml檸檬酸溶液中，配成3mg/ml的溶液。(2)健康大鼠約60只，隨機(jī)選取12只大鼠作為正常對(duì)照組，其余大鼠按30mg/kg單次腹腔注射STZ溶液，正常飲食，但飲水中含1％蛋氨酸，擬造成體內(nèi)同型半胱氨酸(Hcy)升高。2周后眶后采血測(cè)定空腹血糖(FPG)值，取FPG>11.1mmol/L、Hcy>12μmol/L的大鼠為糖尿病合并高Hcy血癥大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、HMS5552組、HMS5552+5-MTHF組，每組15只，每日分別灌胃生理鹽水、HMS5552(5mg/kg/d)、HMS5552+5-MTHF(5+0.08mg/kg/d)，另以正常大鼠作空白對(duì)照，給予等量生理鹽水灌胃，各組均為每日1次灌藥。連續(xù)給藥6周后，各組大鼠眼眶采血測(cè)FPG、內(nèi)皮素-1(ET-1)和Hcy,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)。

結(jié)果：見表1。模型組大鼠FPG、Hcy水平顯著高于正常對(duì)照組大鼠，表明模型組大鼠呈現(xiàn)高血糖、高Hcy狀態(tài)，造模成功。大鼠藥物治療后，HMS5552、HMS5552+5-MTHF組合物組大鼠FPG顯著降低(均P<0.01)，但HMS5552+5-MTHF組合物對(duì)大鼠的降血糖作用優(yōu)于HMS5552單用(P<0.05)，提示5-MTHF合用后有顯著的輔助降血糖作用；HMS5552+5-MTHF組合物組大鼠Hcy顯著降低，但HMS5552組沒有降低，提示5-MTHF合用后有顯著的降Hcy作用。血漿內(nèi)皮素水平是反映糖尿病血管病變的指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組或HMS5552組比較，HMS5552+5-MTHF組合物組大鼠血漿ET-1有顯著降低，提示兩者合用后有顯著的血管內(nèi)皮保護(hù)作用。

表1 HMS5552+5-MTHF組合物對(duì)大鼠的作用(n＝15)

注：與正常組比較，^**P<0.01；與模型組比較，^#P<0.05,^##P<0.01；與HMS5552組比較，^△P<0.05。

實(shí)施例10. TTP399+葉酸組合物對(duì)糖尿病大鼠血管、腎的保護(hù)作用

方法：(1)動(dòng)物造模及給藥：雄性SD大鼠60只，體重200～230g，適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后隨機(jī)抽取13只作為空白對(duì)照組，其余分別給予30mg/kg STZ單次腹腔注射，14d后大鼠尾靜脈采血測(cè)定FPG水平，大于11.1mmoL/L確定為糖尿病造模成功，隨機(jī)分為3組，即模型對(duì)照組、TTP399組、TTP399+葉酸組，每組15只，后兩組分別給予TTP39980mg/kg/d、TTP399+葉酸(80+0.08mg/kg/d)組，均為每日1次給藥，空白組、模型組給予等量的生理鹽水灌喂，各組用藥或處理時(shí)間為8周。除正常對(duì)照組喂普通飼料外，其余各組均喂以高熱量飼料。(2)標(biāo)本采集、指標(biāo)檢測(cè)：8周后l0％水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血測(cè)血糖、按試劑盒說明書測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、內(nèi)皮素(ET)水平；代謝籠法接取24h尿液，測(cè)定24h尿蛋白量。各組結(jié)果及統(tǒng)計(jì)見表2、3。

結(jié)果：給與糖尿病大鼠藥物治療8周后，與模型組比較，TTP399、TTP399葉酸組合物組大鼠FPG顯著降低，且TTP399葉酸組合物對(duì)大鼠的降糖作用強(qiáng)于TTP399單用，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組尿蛋白顯著升高，TTP399組大鼠尿蛋白與模型組相比無顯著差異，TTP399葉酸組尿蛋白顯著下降，提示TTP399葉酸合用對(duì)腎功能有顯著的保護(hù)作用(見表2)。

表2 TTP399葉酸組合物對(duì)大鼠血糖、24h尿蛋白的作用(n＝15)

注：與正常組比較，^**P<0.01；與模型組比較，^#P<0.05,^##P<0.01；與TPP399組比較，^△P<0.05,^△ΔP<0.01

與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠血清ET水平升高、SOD、CAT水平降低，提示糖尿病模型合并早期血管內(nèi)皮損傷；TTP399組對(duì)ET、SOD、CAT作用效果與模型組無顯著差異；與TTP399組比較，TTP399葉酸組ET顯著下降、SOD和CAT明顯升高，顯示TTP399葉酸有降ET、升高SOD、CAT的效應(yīng)，提示葉酸組合物后有進(jìn)一步改善大鼠的抗氧化及抗內(nèi)皮損傷作用(表3)。

表3 TTP399葉酸組合物對(duì)大鼠血管的保護(hù)作用(n＝15)

注：與正常組比較，^**P<0.01；與模型組比較，^##P<0.01；與TPP399組比較，^△ΔP<0.01。

糖尿病血管病變以動(dòng)脈硬化為主要表現(xiàn)，血管內(nèi)皮損傷是糖尿病血管并發(fā)癥的始動(dòng)環(huán)節(jié)，同時(shí)糖尿病血管病變的發(fā)生又進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮損傷，但血管病變的機(jī)制尚未完全闡明。血液中ET是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，是強(qiáng)烈的血管收縮劑，與糖尿病血管并發(fā)癥密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，隨糖尿病進(jìn)展，ET水平逐漸升高，是反映糖尿病血管病變的良好指標(biāo)。氧自由基是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的重要因素，而血液中SOD、CAT是清除氧自由基的重要蛋白酶。根據(jù)上述結(jié)果，初步得出結(jié)論：葉酸與TPP399聯(lián)合應(yīng)用不僅降血糖作用加強(qiáng)，還有顯著改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷的作用。

實(shí)施例11. HMS5552/甲酰四氫葉酸/維生素B₁₂對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮保護(hù)作用

方法：Wistar大鼠(雄性，體重200-250g)高脂飼料喂養(yǎng)12周。大鼠造模前禁食12小時(shí)，腹腔注射STZ(30mg/kg)，2周后眶后采空腹血，測(cè)血糖FPG≥11.1mmoL/L為糖尿病造模成功，將糖尿病大鼠按血糖值隨機(jī)分為3組，分別為模型對(duì)照組、HMS5552組(7.5mg/kg/d)、HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組(7.5+0.04+0.01mg/kg/d)，每組15只，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)12周；另設(shè)立正常對(duì)照組大鼠，以普通飼料喂養(yǎng)(模型對(duì)照及正常對(duì)照大鼠每日灌胃蒸餾水)。糖尿病大鼠各組均繼續(xù)喂以高熱量飼料，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飲水及飼料不限制，實(shí)驗(yàn)12周結(jié)束時(shí)采血，測(cè)血糖以及按試劑盒說明書測(cè)定NO(硝酸還原酶法)、總一氧化氮合成酶(T-NOS)和總SOD活力；放免法測(cè)定血清血栓素(TXB₂)、前列腺素(6-keto-PGF1α,簡(jiǎn)稱PGF1α)和血漿ET。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行配對(duì)t檢驗(yàn)。

結(jié)果：HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物對(duì)血糖的影響：模型組血糖顯著升高，HMS5552可顯著降低血糖；相比HMS5552組，HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物降糖作用顯著增強(qiáng)。

HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物對(duì)NO、T-NOS、ET和NO/ET的影響：與正常組比較，模型組血漿NO降低，血清T-NOS活力顯著下降，ET含量升高，NO/ET比值降低；與模型組比較，HMS5552組僅NO有所升高，而HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組NO、T-NOS升高更明顯，ET降低，同時(shí)NO/ET比值顯著增高，提示甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂增強(qiáng)HMS5552血管內(nèi)皮保護(hù)。

HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物對(duì)TXB₂、PGF1α及兩者比值的影響：與正常組比較，模型組血漿TXB₂顯著升高，PGF1α變化不明顯，TXB₂/PGF1α比值顯著升高；與模型組比較，HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組TXB₂明顯下降，PGF1α變化幅度不大，TXB₂/PGF1α比值明顯下降，提示甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂具有增強(qiáng)HMS5552對(duì)血管栓塞的防治作用。

HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物對(duì)血清總SOD活力的影響：與正常組比較，模型組血清總SOD活力顯著降低，給藥組SOD活力均有不同程度上升。其中，與HMS5552組比較，HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組SOD活力升高更明顯，提示HMS5552/甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂組合物具有協(xié)同血管保護(hù)作用。見表4-6。

表4 HMS5552/甲酰四氫葉酸/B₁₂組合物對(duì)大鼠血糖的作用(n＝15)

注：與正常組比較，^**P<0.01；與模型組比較，^##P<0.01；與HMS5552組比較，^△ΔP<0.01。

表5 HMS5552/甲酰四氫葉酸/B₁₂組合物對(duì)大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用(n＝15)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01；與HMS5552組比較，^△P<0.05,^△ΔP<0.01。

表6 HMS5552/甲酰四氫葉酸/B₁₂組合物對(duì)大鼠血管的保護(hù)作用(n＝15)

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01；與HMS5552組比較，^△P<0.05。

糖尿病血管病變、尤其是微血管病變是糖尿病多種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是重要原因之一，而一氧化氮/內(nèi)皮素(NO/ET)和血栓素/前列腺素是兩組血管活性物質(zhì)，均由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，兩組動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能及對(duì)血流動(dòng)力學(xué)等起著重要作用。本研究結(jié)果提示，與單方相比，HMS5552與甲酰四氫葉酸/Vit B₁₂聯(lián)合應(yīng)用更有利于維持NO/ET和血栓素/前列腺素的穩(wěn)態(tài)平衡，有利于協(xié)助調(diào)節(jié)微血管的舒縮、抑制血小板聚集及血栓形成，因此具有防治糖尿病血管病變的藥理作用。