本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域，特別地，涉及一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體。此外，本發(fā)明還涉及包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

化療是一種治療腫瘤的常用的方法，雖然文獻(xiàn)報(bào)道化療能降低了死亡率，但是，也有文獻(xiàn)報(bào)道化療既不能增提高療效，也不能延長壽命，因?yàn)榛煋p害免疫系統(tǒng)使腫瘤免疫療效喪失。過去的幾十年里，免疫治療與靶向治療是兩個(gè)不同的有效策略，都被證明各有其利弊?；蚪M引導(dǎo)突變識別驅(qū)動的癌癥，促進(jìn)了靶向藥物的發(fā)展，它們在多數(shù)有腫瘤靶病變的患者中有顯著的反應(yīng)，但其作用相對短暫。在化療的情況下，聯(lián)合基因靶向藥物比單用制劑將更有效的預(yù)防癌癥。通過聯(lián)合用藥有效地提高整體存活率是可行的。然而，由于固有的基因組不穩(wěn)定性，獲得性耐藥的無數(shù)的機(jī)制和廣泛靶標(biāo)的復(fù)雜性，可能很難通過單個(gè)基因靶向策略治愈腫瘤。腫瘤免疫治療(Tumor immunotherapy)越來越受人關(guān)注。晚期腫瘤通過多種免疫機(jī)制逃脫宿主的免疫偵查和免疫清除，誘導(dǎo)腫瘤耐受，所以，有效的腫瘤免疫治療應(yīng)該促進(jìn)腫瘤-免疫循環(huán)，解除腫瘤免疫抑制。腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞，即高度特異性的細(xì)胞溶解能力。

免疫治療本質(zhì)上是多價(jià)的，因?yàn)獒槍蝹€(gè)檢查點(diǎn)可能釋放對許多不同的抗原肽特異性的T細(xì)胞，這些腫瘤內(nèi)的抗原肽目前包括腫瘤分化，進(jìn)展，甚至由于基因組不穩(wěn)定性導(dǎo)致新抗原的突變驅(qū)動癌癥的發(fā)生。這個(gè)生物過程十分復(fù)雜，目前仍處于研究之中。眾所周知，免疫療法有三大特點(diǎn)：沒有典型的耐藥性；誘導(dǎo)產(chǎn)生持久的臨床反應(yīng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生自體免疫樣毒性。腫瘤免疫治療的耐受性很好，與化療不同(1+1<2)，將多種免疫治療聯(lián)合使用可能具有更好的安全性(1+1>2)。由于增加抗腫瘤T細(xì)胞的反應(yīng)，免疫治療效果更持久，但是只在一小部分患者中有效。因此亟需一種復(fù)合抗體，以使不同靶向目標(biāo)的多個(gè)不同機(jī)制的免疫治療，有可能在更多的患者中產(chǎn)生更好的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體、制備方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有的免疫治療只對小部分患者有效的技術(shù)問題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體，復(fù)合抗體包括干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯通過非共價(jià)鍵連接，腫 瘤抗體為利妥昔單抗或曲妥珠單抗。

進(jìn)一步地，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯的比例為每200～2000單位干擾素α對應(yīng)0.1～0.5mg氧化石墨烯和1～5mg腫瘤抗體。

進(jìn)一步地，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯的比例為每2000單位干擾素α對應(yīng)0.1mg氧化石墨烯和1mg腫瘤抗體。

進(jìn)一步地，氧化石墨烯的粒徑小于22μm。

本發(fā)明另一方面提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體的制備方法，包括以下步驟：

將干擾素α和氧化石墨烯在32～42℃下混勻反應(yīng)2～4小時(shí)；

加入腫瘤抗體混勻，在32～42℃反應(yīng)4～8小時(shí)，得到包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體。

進(jìn)一步地，干擾素α和氧化石墨的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)；加入腫瘤抗體的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。

進(jìn)一步地，氧化石墨烯的制備包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料在0～4℃的條件下，通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾，得到氧化石墨烯。

進(jìn)一步地，超聲波破碎的操作包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料配置為1～2mg/ml，在超聲波破碎的強(qiáng)度為3.5的條件下，超聲2小時(shí)，超聲模式為工作10s，休息5s。

本發(fā)明還提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益效果：上述包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體，復(fù)合抗體可以有效地直接殺傷大部分的腫瘤細(xì)胞，破壞保護(hù)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，同時(shí)干擾素α刺激免疫系統(tǒng)，打破腫瘤耐受，促進(jìn)腫瘤特異性的細(xì)胞激活或者細(xì)胞因子的釋放，達(dá)到縮小清除腫瘤、防治復(fù)發(fā)和最終治愈腫瘤的目標(biāo)。

除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。下面將參照圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組小鼠的生存時(shí)間示意圖；

圖2是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組小鼠體內(nèi)的PBMCs細(xì)胞存活數(shù)量示意圖；

圖3是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組以CCK8法測定腫瘤細(xì)胞活性鑒別柱狀圖；

圖4是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組Raji細(xì)胞存活數(shù)量示意圖；

圖5是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組的淋巴瘤細(xì)胞存活數(shù)量示意圖；

圖6是各組的Treg細(xì)胞分化增殖情況示意圖；

圖7是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組的Treg淋巴瘤細(xì)胞存活數(shù)量示意圖；

圖8是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的各組的Teff/Treg比例示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。

參照圖1，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體，復(fù)合抗體包括干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯通過非共價(jià)鍵連接，腫瘤抗體為利妥昔單抗或曲妥珠單抗。

分子靶向治療和化療耐藥是目前癌癥研究的主要問題。細(xì)胞毒性化療藥物和可選擇性的特異性靶分子的靶向藥物耐藥的經(jīng)典機(jī)制有藥物靶點(diǎn)的改變、促生存的途徑激活和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡失效。通過合理的治療藥物組合和使用預(yù)測生物標(biāo)志物進(jìn)行臨床評估。影響耐藥的可能因素有：(1)藥物的運(yùn)輸與代謝，比如耐多藥最常見藥物泵，以及藥物的活化與失活；(2)藥物靶點(diǎn)的改變，例如，吉非替尼和厄洛替尼治療非小細(xì)胞肺癌對表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑的反應(yīng)率高，是因?yàn)榛罨腅GFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的突變(在19外顯子缺失和21號外顯子L858R突變)；(3)DNA損傷修復(fù)，如一些DNA損傷的藥物；(4)下游耐藥機(jī)制，凋亡負(fù)調(diào)控，自我吞噬；(5)耐藥促進(jìn)適應(yīng)性反應(yīng)：促生存信號通路激活，腫瘤旁路和路徑冗余，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；(6)腫瘤微環(huán)境，如整合素家族、細(xì)胞因子和生長因子。在實(shí)體腫瘤，微環(huán)境是由細(xì)胞外基質(zhì)，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，免疫和炎性細(xì)胞和血管組成的。在血液惡性腫瘤的微環(huán)境是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞間的細(xì)胞組成的。微環(huán)境對抗細(xì)胞毒性藥物為腫瘤細(xì)胞提供避難所，從而使他們能夠逃避細(xì)胞凋亡和獲得性耐藥導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。在大多數(shù)實(shí)體腫瘤的致癌過程均是一個(gè)多步驟的過程，分子機(jī)制解釋不了單一治療的效果。在這種情況下，單一靶向治療似乎理論上是一個(gè)不理想的策略，并不能期望得到最佳的結(jié)果。然而單一靶向治療的特異性高副作用較少，從該角度來看單一靶向治療又是理想的。因此，建立有多針對性的分子靶向藥物的聯(lián)合可能是一個(gè)在未來癌癥治療的目標(biāo)。這可能會解決腫瘤異質(zhì)性的問題，同時(shí)保持治療的選擇性。

抗腫瘤免疫的激活對于有效地消除腫瘤細(xì)胞可能是至關(guān)重要的。在這方面，小分子藥物不直接作用于免疫系統(tǒng)，應(yīng)結(jié)合免疫活性藥物治療以取得最好的治療效果。因此，努力以不同類別的藥物組合的分子靶點(diǎn)治療癌癥。單抗治療和小分子抑制劑的協(xié)同效應(yīng)逐步展現(xiàn)。同時(shí)使用不同類別的免疫活性劑得到一個(gè)特定的分子可以被認(rèn)為是最有前途的戰(zhàn)略，最大限度地抑制靶分子和克服單一治療的限制。

干擾素α(英文簡稱INFα)為一種小分子抑制劑，是數(shù)十年前發(fā)現(xiàn)的與病毒復(fù)制相關(guān)的首個(gè)細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)和抗血管生成的作用，所以多年來在惡性腫瘤治療的廣泛應(yīng)用。干擾素α屬于I型干擾素，I型共有13種，分類依據(jù)是其同源受體特異性識別、基因位點(diǎn)、其主要的氨基酸序列同源性、刺激和產(chǎn)物的細(xì)胞類型。在最近幾年，這個(gè)局面已經(jīng)改變了。在分子水平，干擾素α已在多種惡性腫瘤的治療中，表現(xiàn)出抗血管生成、誘導(dǎo)分化、增殖和凋亡的多方面影響的強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)作用。

干擾素α的直接作用是抑制細(xì)胞增殖，是通過阻滯細(xì)胞周期G1-S期在體外和體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，如p21，p-27，2-5-a-synthetase，PKR，IRF-1和IRF-2。很長一段時(shí)間以來，認(rèn)為干擾素的α對腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用是患者抗腫瘤反應(yīng)的主要機(jī)制。干擾素對腫瘤細(xì)胞的直接毒性作用的機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是最近已經(jīng)證明，干擾素α在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中有重要作用：直接和間接影響的活化、遷移、分化、存活和免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞多樹突狀細(xì)胞(DC)亞群，自然殺傷DC細(xì)胞，B細(xì)胞和T細(xì)胞。最近發(fā)現(xiàn)的干擾素α能啟動T細(xì)胞自發(fā)的抗腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)和先天免疫傳感機(jī)制，促進(jìn)他們的作用。

利妥昔單抗(英文簡稱RTX)或曲妥珠單抗(英文簡稱TRA)是分子靶向治療藥物，干擾素α作為小分子抑制劑用于免疫治療。氧化石墨烯(英文簡稱GO)，其含有sp2雜化帶羥基和羧基的苯環(huán)，不僅性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好，還可以通過π鍵、疏水作用、氫鍵和離子鍵與抗體、藥物分子、金屬離子、熒光基團(tuán)或者細(xì)胞非共價(jià)結(jié)合。其次，二維結(jié)構(gòu)的GO的表面比任何其他納米材料都高出至少4個(gè)量級，它的每個(gè)原子都暴露在表面，適合于運(yùn)載藥物。GO是其他石墨材料的基本構(gòu)建塊，可以裹成0維的球體，滾成1維的碳納米管，層疊成3維結(jié)構(gòu)的石墨。良好的藥物載體就有優(yōu)良的表面化學(xué)性質(zhì)，不僅生物相容性好，而且生物變化可控。因此，GO的結(jié)合方式目前主要分兩種：共價(jià)和非共價(jià)，前者通常是通過氧化石墨烯的非飽和結(jié)構(gòu)破壞而形成的原子摻雜或反應(yīng)的技術(shù)；后者不改變GO的自然結(jié)構(gòu)，只通過非共價(jià)鍵，如范德華力、π鍵和電荷吸引，結(jié)合更加靈活。

氧化石墨烯作為藥物載體，通過非共價(jià)鍵與抗體、INFα聯(lián)合。干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體可聯(lián)合靶向治療和免疫治療，結(jié)合二者的優(yōu)越性，既保留了靶向治療對腫瘤細(xì)胞的特異性治療，毒性低的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)又具有免疫治療的特性，通過INFα刺激免疫系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤-免疫循環(huán)，解除腫瘤免疫機(jī)制，調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤特異性的細(xì)胞激活或者細(xì)胞因子的釋放，達(dá)到縮小清除腫瘤、防治復(fù)發(fā)和最終治愈腫瘤的目標(biāo)。

本發(fā)明具有以下有益效果：上述包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體，復(fù)合抗體可以有效地直接殺傷大部分的腫瘤細(xì)胞，破壞保護(hù)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，同時(shí)INFα刺激免疫系統(tǒng)，打破腫瘤耐受，促進(jìn)腫瘤特異性的細(xì)胞激活或者細(xì)胞因子的釋放，達(dá)到縮小清除腫瘤、 防治復(fù)發(fā)和最終治愈腫瘤的目標(biāo)。

可選地，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯的比例為每200～2000單位干擾素α對應(yīng)0.1～0.5mg氧化石墨烯和1～5mg腫瘤抗體。在復(fù)合抗體中，每200～2000單位干擾素α，相應(yīng)的氧化石墨烯的質(zhì)量為0.1～0.5mg，RTX單抗或TRA單抗的質(zhì)量為1～5mg。在該比例下，三者的比例合適，對腫瘤的治愈效果好。

可選地，干擾素α、腫瘤抗體和氧化石墨烯的比例為每2000單位干擾素α對應(yīng)0.1mg氧化石墨烯和1mg腫瘤抗體。在該比例下，對腫瘤的治愈效果進(jìn)一步提升。

可選地，氧化石墨烯的粒徑小于22μm。盡管氧化石墨烯溶于水，如生理鹽水由于鹽的電荷屏蔽作用使得氧化石墨烯發(fā)生聚集。顆粒較大的氧化石墨烯在生理鹽溶液下容易發(fā)生聚集，生成沉淀，性質(zhì)不穩(wěn)定。當(dāng)復(fù)合抗體用于人體內(nèi)時(shí)，采用粒徑小于22μm的氧化石墨烯可在人血清中穩(wěn)定均勻分散。粒徑小于22μm的氧化石墨烯可直接購買或通過大顆粒的氧化石墨烯經(jīng)超聲波破碎制取。

本發(fā)明另一方面提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體的制備方法，包括以下步驟：

將干擾素α和氧化石墨烯在32～42℃下混勻反應(yīng)2～4小時(shí)。

加入腫瘤抗體混勻，在32～42℃反應(yīng)4～8小時(shí)，得到包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體。

具體的，可將GO0.2mg和INFα2000單位，37℃下持續(xù)攪拌孵育2小時(shí)。制備好的1mlINFα/GO加入1mg腫瘤抗體(RTX或者TRA)，在37℃下持續(xù)攪拌孵育12小時(shí)，備用。上述三種物質(zhì)采用上述結(jié)合順序，可保證三者的結(jié)合量較高，以保證治療效果。

可選地，干擾素α和氧化石墨的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)；加入腫瘤抗體的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。

反應(yīng)溫度選擇37℃。原因有二：第一，這個(gè)溫度下殺傷效果最好；第二，這個(gè)溫度也是生理溫度，有利于保障體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定，并為得到體外和體內(nèi)一致的結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。利妥昔單抗、抗體和氧化石墨量大，結(jié)合穩(wěn)定，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，各步驟中相應(yīng)物質(zhì)的結(jié)合數(shù)量并不會明顯增加?？紤]到時(shí)間成本，反應(yīng)時(shí)間可選優(yōu)為2小時(shí)。

可選地，氧化石墨烯的制備包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料在0～4℃的條件下，通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾，得到氧化石墨烯。

氧化石墨烯的制備很重要，嚴(yán)格控制大小和厚度?？蓮腟igma購得氧化石墨烯原材料，透析純化去除酒精。將氧化石墨烯原材料在超聲波破碎儀破碎成細(xì)小顆粒。然后將經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾?？刹捎萌淘诒旌衔镏羞M(jìn)行操作以保證反應(yīng)溫度在0～4℃的條件，以避免超聲儀探頭過熱影響儀器的工作效率，甚至損傷儀器。

可選地，超聲波破碎的操作包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料配置為1～2mg/ml，在超聲波破碎的強(qiáng)度為3.5的條件下，超聲2小時(shí)，超聲模式為工作10s，休息5s。

在美國Misonix超聲波破碎儀Sonicator 3000，強(qiáng)度3.5，持續(xù)超聲2小時(shí)，模式工作10秒，休息5秒。在該條件下，氧化石墨烯的粒徑小于50nm，厚度為1～3nm。超聲過濾處理過的GO能在人血清中穩(wěn)定均勻分散，然而未經(jīng)超聲的一般GO(即一般的顆粒較大的氧化石墨烯，如從Sigma購得的氧化石墨烯原材料，其粒徑>0.5-1μm和厚度>10nm)在4小時(shí)之內(nèi)就發(fā)生沉淀?？梢?，處理后的GO比一般GO更薄(約8.6倍)更小，穩(wěn)定性更好，生物分布更佳。

本發(fā)明還提供了一種包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的包含干擾素α/腫瘤抗體/氧化石墨烯的復(fù)合抗體具有治療腫瘤藥物的作用，尤其可治療Burkitt淋巴瘤，因而該復(fù)合抗體可應(yīng)用于治療腫瘤藥物。

本發(fā)明使用的干擾素α購自英國Merck Sharp&Dohme Limited公司。

利妥昔單抗購自美國羅氏公司。

曲妥珠單抗購自美國基因泰克公司公司。

CCK8試劑盒購自美國Sigma公司。

流式細(xì)胞儀LSR Fortessa購自美國BD Biosciences公司。

實(shí)施例1

GO 0.2mg和INFα2000單位，37℃下持續(xù)攪拌孵育2小時(shí)。制備好的1mlINFα/GO加入1mg RTX單抗，在37℃下持續(xù)攪拌孵育12小時(shí)，備用。GO為通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾的氧化石墨烯。

實(shí)施例2

GO0.1mg和INFα2000單位，37℃下持續(xù)攪拌孵育2小時(shí)。制備好的1mlINFα/GO加入5mg TRA單抗，在37℃下持續(xù)攪拌孵育12小時(shí)，備用。GO為通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾的氧化石墨烯。

實(shí)施例3

GO 0.4mg和INFα2000單位，37℃下持續(xù)攪拌孵育2小時(shí)。制備好的1mlINFα/GO加入3mg RTX單抗，在37℃下持續(xù)攪拌孵育12小時(shí)，備用。GO為通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾的氧化石墨烯。

實(shí)施例4

GO 0.5mg和INFα2000單位，37℃下持續(xù)攪拌孵育2小時(shí)。制備好的1mlINFα/GO加入5mg RTX單抗，在37℃下持續(xù)攪拌孵育12小時(shí)，備用。GO為通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾的氧化石墨烯。

實(shí)施例5

RTX/GO的制備

將0.2mg GO和1mg RTX在1ml 10％PBS(0.09％NaCl)中混合反應(yīng)，在37℃下持續(xù)攪拌孵育8小時(shí)，制備獲得RTX/GO。

TRA/GO的制備

將0.2mg TRA和1mg RTX在1ml 10％PBS(0.09％NaCl)中混合反應(yīng)，在37℃下持續(xù)攪拌孵育8小時(shí)，制備獲得RTX/GO。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

以下測試數(shù)據(jù)使用的INFα/RTX/GO為實(shí)施例1制備得到，RTX/GO和TRA/GO由實(shí)施例5制得。

外周血單核細(xì)胞的獲取

外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，其主要細(xì)胞類型為血液中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要有淋巴細(xì)胞(T/B)、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞為主。分離PBMC的主要目的是為了去除多核細(xì)胞和紅細(xì)胞，從而能夠更方便地在體外模擬血液免疫環(huán)境。

Ficoll是蔗糖的中性多聚體，分子量約為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml但仍未超出正常生理性滲透壓，也不會穿過生物膜。粒細(xì)胞，紅細(xì)胞比重比較大，離心后沉在管底。單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比重比較小，小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液中或者液面，其中以液面為主。吸取分層液液面的細(xì)胞，洗滌純化，就從外周血中分離得到單核細(xì)胞了。

具體外周血單核細(xì)胞的分離過程可為：血庫需過濾去除PBMCs細(xì)胞以制備成分濃縮紅細(xì)胞，因此可利用血庫采用的血液過濾器初步分離紅細(xì)胞和PBMCs細(xì)胞。血液過濾器全程置于冰中。準(zhǔn)備50ml注射器，抽吸30ml冷PBS以及20ml空氣，剪開過濾器的兩端軟管，逆向沖洗，直至過濾器中的血液全部沖洗下來，過濾器發(fā)白為止，全部轉(zhuǎn)入50ml試管中。在4攝氏度，以2000/min的速度離心10分鐘。離心后，血清在上層，紅細(xì)胞在下層，取兩層交界處的液體5ml。轉(zhuǎn)入15ml插入冰中的試管中。加入5ml冷PBS后搖勻，然后用裝好5ml移液玻璃管無菌電動移液槍取Ficoll 4ml從試管底部緩慢加入，始終保持分層清晰。在常溫下配平后離心，速度RCF400g，時(shí)間20分鐘，減速剎車初始設(shè)置為0，當(dāng)RCF降至60后，由0升到1。去除上清液，取分層的交界處液體3ml，轉(zhuǎn)移至另外干凈的試管中，取樣計(jì)數(shù)PBMCs濃度。結(jié)合注射的最佳體積為0.5-1ml，離心PBS洗滌，重懸于適當(dāng)?shù)捏w積。上述方法為從血液中提取分離PBMCs方法中的一種，當(dāng)然本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可采用其它方法提取。

動物實(shí)驗(yàn)1

NODragkoγko(NRG)雌性裸鼠35只，周齡6～8周(美國猶他大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供)， 分籠飼養(yǎng)，予以標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水讓其自由攝食。環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度60-80％。小鼠隨機(jī)分成7組，每組5只。在第1天，其中5組小鼠注射Raji 4×10⁶，另外2組小鼠注射4RH4×10⁶(對RTX耐藥性最好的淋巴瘤細(xì)胞株)。第8天在7組小鼠體內(nèi)注射提取的人類PBMC細(xì)胞5×10⁶。第10、12天分別對7組小鼠進(jìn)行治療，每組注射量為100ul～200ul，根據(jù)小鼠體重加以調(diào)整。根據(jù)治療方案和初始注射的淋巴瘤細(xì)胞株的區(qū)別，將7組小鼠分別命名為：(1)Raji PBS組；(2)Raji RTX組；(3)Raji RTX/GO組；(4)Raji RTX+O組；(5)Raji INFα/RTX/GO組；(6)4RH RTX/GO組；(7)4RH RTX+O組。其中O代表奧沙利鉑。2次治療后不再進(jìn)行任何治療，每天隨訪觀察記錄生存與否。

參照圖1，最先出現(xiàn)死亡的一批是：4RH RTX+O、Raji RTX+O、Raji PBS和Raji RTX治療組，該批小鼠均在治療后半個(gè)月之內(nèi)發(fā)病，其中PBS治療組在這半個(gè)月內(nèi)全部死亡，4RH RTX+O也出人意料的死亡80％。在60之內(nèi)，所有接受4RH RTX+O，Raji RTX+O，Raji PBS，Raji RTX治療的小鼠全部死亡。而對于接受Raji RTX/GO和4RH RTX/GO治療的小鼠抑制健康的存活到第80天才開始發(fā)病死亡，這兩組與前面的4組在生存曲線上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在隨后的30天以內(nèi)，Raji RTX/GO和4RH RTX/GO治療組的小鼠先后死亡，但是接受Raji INFα/RTX/GO治療的小鼠仍然健康的存活著。

在上述動物實(shí)驗(yàn)的過程中，第15天，即PBMCs輸注后的第7天，對所有NODragkoγko(NRG)雌性裸鼠行臉頰取血，經(jīng)染色，孵育，紅細(xì)胞裂解，洗滌，固定，流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)，結(jié)果整理分析，比較不同治療組的模型體內(nèi)PBMCs的數(shù)目差異。參照圖2，結(jié)果顯示，在含有化療藥物奧沙利鉑的治療組中，4RH RTX+O和Raji RTX+O，PBMCs組的PBMCs數(shù)目明顯少于其他治療組(P<0.01)。在Raji PBS組和Raji RTX組中，PBMCs的數(shù)目最多，且彼此之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有趣的是，INFα/RTX/GO增強(qiáng)了RTX/GO殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，而且沒有增強(qiáng)RTX/GO對PBMCs的作用，彼此之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示INFα/RTX/GO和RTX/GO可能輕度影響了PBMCs得總數(shù)，對但是沒有影響它的功能，反而從整體而言更好的發(fā)揮了抗腫瘤的優(yōu)勢。

體外實(shí)驗(yàn)1

采用CCK8法進(jìn)行細(xì)胞增殖-毒性檢測，檢測INFα、TRA、GO、TRA+INFα、PBS、TRA/GO和INFα/腫瘤抗體/GO對MG63的治療效果，以反映上述物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)，參照圖3～4，INFα(2000U/ml)，TRA(37.5μg/ml)，GO(7.5μg/ml)，甚至TRA+INFα，10％PBS在450nm處的吸光度都在1.0附近，彼此差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而TRA/GO(37.5/7.5μg/ml)組在450nm處的吸光度低于0.40，與前三者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在INFα/TRA/GO組吸光度約為0.15，與前面的對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。數(shù)據(jù)以相對于PBS的相對吸光度值的形式呈現(xiàn)。顯而易見，INFα在該濃度下只有輕微的直接抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，但是INFα/TRA/GO與TRA/GO差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示結(jié)合在GO上的INFα可以增強(qiáng)INFα/TRA/GO殺傷MG63的能力。如圖3可知，游離的干擾素對腫瘤細(xì)胞無殺傷。INFa/TRA/GO比TRA/GO在體外殺傷腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)。在INFα/RTX/GO治療Raji的體外實(shí)驗(yàn)也可見類似結(jié)果，如表1所示。

表1不同處理組的相對吸光度值

體外實(shí)驗(yàn)2

首先對PBMCs和Raji細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基MEM，完全培養(yǎng)基的配制以及細(xì)胞培養(yǎng)的方法可按照現(xiàn)有技術(shù)的方法完成。同時(shí)，需要加入PBMCs的刺激劑30ng/ml的OKT3(即CD3單克隆抗體)和50IU/ml的IL-2(即白細(xì)胞介素-2)，還需要加入事先培養(yǎng)好的DCs(即樹突狀細(xì)胞)，培養(yǎng)5天。PBMCs分為多組，分別予以不同藥物處理：(1)10％PBS、(2)GO、(3)RTX、(4)RTX+INFα、(5)INFα、(6)RTX/GO和(7)INFα/RTX/GO。然后經(jīng)流式細(xì)胞儀對各組分析收集數(shù)據(jù)。

檢測發(fā)現(xiàn)，參照圖5，存活淋巴瘤細(xì)胞最多的3組分別是(1)10％PBS、(2)GO和(3)RTX治療組，細(xì)胞數(shù)在17000-19000之間，彼此之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05，而與這三組相比，(6)RTX/GO治療組的存活淋巴瘤細(xì)胞數(shù)要少很多，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。有趣的是，INFα在PBMCs存在的情況能有效的抑制Raji細(xì)胞的增殖，正如在(4)RTX+INFα、(5)INFα治療組中，存活的淋巴瘤細(xì)胞數(shù)降至約10000。更重要的是，在PBMCs存在的情況下，INFα/RTX/GO組(存活的淋巴瘤細(xì)胞數(shù)約5000)比RTX/GO(存活的淋巴瘤細(xì)胞數(shù)約3000)的顯示出更好的治療效果。為了探索可能的原因，樣本經(jīng)FOXP3染色，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析收集數(shù)據(jù)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，簡稱Tregs)是控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的一類T細(xì)胞亞群Tregs與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其異常表達(dá)可誘發(fā)自身免疫性疾病。FOXP3是控制Treg細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，也是控制免疫抑制分子表達(dá)的關(guān)鍵因素。因此，闡明FOXP3的分子靶點(diǎn)是透徹理解Treg免疫抑制作用的必要條件之一。

各組的樣本的檢驗(yàn)過程如下：

1、對完成細(xì)胞表面免疫熒光染色。

2、樣本加入1X BioLegend’s FOXP3Fix/Perm緩沖液200μl，震動搖勻，在室溫避光孵育20分鐘，離心去除上清液，收集細(xì)胞。BioLegend’s FOXP3Fix/Perm緩沖液為現(xiàn)有的試劑盒。

3、用細(xì)胞染色溶液(Cat.No.420201)洗滌一次，在250g轉(zhuǎn)速下離心5分鐘去除上清液。

4、用1X BioLegend’s FOXP3破膜緩沖液洗滌一次。

5、重懸細(xì)胞于1ml 1X BioLegend’s FOXP3破膜緩沖液，室溫下閉光孵育15分鐘，離心去除上清液收集細(xì)胞，然后重懸細(xì)胞與100μl的1X BioLegend’s FOXP3破膜緩沖液。

6、加入適量的抗FOXP3的熒光抗體，在室溫避光孵育30分鐘。

7、用細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，細(xì)胞重懸于200μl的染色緩沖液，在流式細(xì)胞儀下分析收集數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6～8所示，發(fā)現(xiàn)INFα抑制了FOXP3陽性細(xì)胞的增殖，改變了Teff/Treg的比例，這些可能與INFα/RTX/GO的殺傷腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制相關(guān)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。