本發(fā)明涉及一種植物總黃酮的制備方法及其在預(yù)防或治療阿爾茨海默病領(lǐng)域的醫(yī)藥新用途。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)亦稱老年癡呆癥，為老年期多發(fā)的神經(jīng)退行性疾病，在65歲以上老年人群中發(fā)病率約為5％，且發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)逐漸增高，在85歲以上老年人群中發(fā)病率達(dá)到30-40％。罹患該病的病人由于記憶相關(guān)的神經(jīng)元進(jìn)行性死亡與丟失，因而導(dǎo)致記憶與認(rèn)知能力進(jìn)行性衰退，一般自發(fā)病起經(jīng)歷8-10年左右發(fā)展為嚴(yán)重癡呆，常因伴隨褥瘡、骨折、肺炎、營(yíng)養(yǎng)不良等繼發(fā)軀體疾病或器官衰竭而導(dǎo)致死亡。由于該病致病機(jī)理復(fù)雜，迄今仍未發(fā)現(xiàn)明確有效的阻斷甚或延緩疾病進(jìn)展的臨床治療手段，由此造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，本領(lǐng)域急需能夠有效預(yù)防或治療該疾病的臨床干預(yù)藥物。

目前較為公認(rèn)的阿爾茨海默病可能的致病機(jī)制包括β淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)的自我聚集引起的神經(jīng)元外淀粉樣蛋白沉積以及微管相關(guān)蛋白Tau的異常磷酸化導(dǎo)致的胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，二者導(dǎo)致的神經(jīng)毒性可能是誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素，因此在這兩個(gè)關(guān)鍵事件中發(fā)揮作用的一些重要蛋白與酶成為抗阿爾茨海默病藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)，包括β-secretase(BACE1)、γ-secretase、Aβ42、GSK3β等。此外，抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性以穩(wěn)定腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水平也是目前臨床改善AD患者癥狀的主要手段。另一個(gè)潛在的藥物研發(fā)靶點(diǎn)是小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨鸬腎L-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放。由于AD病因及相關(guān)致病機(jī)制的復(fù)雜性，有大量作用于單一靶點(diǎn)的候選藥物均面臨研發(fā)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，因此針對(duì)AD相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)成為更為合理的選擇。然而，發(fā)現(xiàn)同時(shí)有效作用于多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)的單一小分子成分具有相當(dāng)?shù)睦щy，這使得抗AD藥物的單體小分子研發(fā)進(jìn)展緩慢，相對(duì)而言，應(yīng)用復(fù)合成分達(dá)成這一目標(biāo)更易于實(shí)現(xiàn)。這為從傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)潛在的有效成分組合提供了理論依據(jù)。

傳統(tǒng)中藥補(bǔ)骨脂又名破故紙，為豆科植物補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifolia L.)的成熟干燥果實(shí)，其性溫，味辛，在中醫(yī)臨床學(xué)上具補(bǔ)腎助陽(yáng)之功效，廣泛成方，用于陽(yáng)痿遺精、五更泄瀉、腰膝冷痛等腎陽(yáng)不足之證；另可外用于治療白癜風(fēng)、斑禿，取得良好療效。含有補(bǔ)骨脂的中藥復(fù)方在治療老年骨質(zhì)疏松方面取得了良好的療效，此外，也有補(bǔ)骨脂復(fù)方應(yīng)用于老年癡呆癥治療的臨床報(bào)道。從該植物中提取分離得到的化學(xué)成分中，香豆素類、黃酮類及單萜酚類化合物是其主要特征成分。我們與其他人對(duì)補(bǔ)骨脂主要成分的定量研究報(bào)道證明了補(bǔ)骨脂中所含的主要小分子化合物包括：補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)、補(bǔ)骨脂素(psoralen)、異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)、補(bǔ)骨脂苷(psoralenoside)、異補(bǔ)骨脂苷(isopsoralenoside)、補(bǔ)骨脂林素(corylin)、補(bǔ)骨脂醇A(corylifol A)、補(bǔ)骨脂查爾酮(bavachalcone)、異補(bǔ)骨脂查耳酮(isobavachalcone)、補(bǔ)骨脂辛(bavachin)、補(bǔ)骨脂辛寧(bavachinin)、補(bǔ)骨脂定(psoralidine)、新補(bǔ)骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)、補(bǔ)骨脂色烯(bavachromene)等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中含量最高的是單帖酚類成分補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)和香豆素類成分補(bǔ)骨脂素(psoralen)、異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)、補(bǔ)骨脂苷(psoralenoside)、異補(bǔ)骨脂苷(isopsoralenoside)等，而各黃酮類成分的相對(duì)含量則較低。研究表明香豆素類成分是補(bǔ)骨脂治療白癜風(fēng)的主要有效成分，而補(bǔ)骨脂中含量較高的單帖酚類成分補(bǔ)骨脂酚則在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出腎毒性，因而不適宜在臨床中長(zhǎng)期應(yīng)用。

已有的研究表明，補(bǔ)骨脂中含有的主要黃酮類成分結(jié)構(gòu)特殊，均為異戊烯基化的黃酮、異黃酮或查耳酮成分(圖1)，具有多樣的生物活性，包括抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗骨吸收作用，以及神經(jīng)保護(hù)作用等。我們?cè)谇捌谘芯恐胁捎肂ACE1、Aβ42、GSK3β、AChE等多個(gè)藥物靶點(diǎn)對(duì)近70種與AD中醫(yī)臨床治療相關(guān)的常用中藥進(jìn)行了活性篩選，確定了補(bǔ)骨脂甲醇提取物對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)具有突出的抑制活性，進(jìn)而對(duì)補(bǔ)骨脂的主要成分進(jìn)行了活性跟蹤研究，確定了其主要活性部位為黃酮類成分，據(jù)此開展了補(bǔ)骨脂總黃酮的制備工藝研究及體內(nèi)抗阿爾茨海默病活性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的制備補(bǔ)骨脂總黃酮的方法以及補(bǔ)骨脂總黃酮在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明所述補(bǔ)骨脂總黃酮主要通過如下方法從中藥補(bǔ)骨脂中制備獲得：將補(bǔ)骨脂粉碎后用石油醚脫脂，然后用乙酸乙酯提取，提取物再次用石油醚脫脂，用適當(dāng)濃度甲醇溶解提取物，加入活性炭除雜，濃縮干燥可得總黃酮有效部位。本方法省去了天然產(chǎn)物提取純化過程中常用的柱層析色譜過程，大大節(jié)省了制備時(shí)間和制備成本，且所有溶劑均可回收重復(fù)利用，顯著降低了溶劑成本與有害廢物的產(chǎn)生，適合于工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。

本發(fā)明所述補(bǔ)骨脂總黃酮由以下主要成分組成：補(bǔ)骨脂林素(corylin)、補(bǔ)骨脂醇A(corylifol A)、補(bǔ)骨脂查爾酮(bavachalcone)、異補(bǔ)骨脂查耳酮(isobavachalcone)、補(bǔ)骨脂辛(bavachin)、補(bǔ)骨脂辛寧(bavachinin)、補(bǔ)骨脂定(psoralidine)、新補(bǔ)骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)，以上成分在補(bǔ)骨脂總黃酮中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)的總和高于50％，更優(yōu)選的為高于65％；而有害成分補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)以及非活性成分補(bǔ)骨脂素(psoralen)與異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)的含量均低于1％。

本發(fā)明公開了補(bǔ)骨脂所含主要黃酮類成分的多靶點(diǎn)體外抗AD活性以及補(bǔ)骨脂總黃酮在SAMP8小鼠動(dòng)物模型中表現(xiàn)出的體內(nèi)抗AD作用。發(fā)明人首先采用BACE1、Aβ42、GSK3β、AChE等多個(gè)藥物靶點(diǎn)對(duì)補(bǔ)骨脂所含11個(gè)主要成分進(jìn)行了體外活性分析，確定了補(bǔ)骨脂黃酮類成分為其主要活性成分；進(jìn)而采用SAMP8小鼠模型對(duì)補(bǔ)骨脂總黃酮的體內(nèi)抗阿爾茨海默病活性進(jìn)行了驗(yàn)證，通過動(dòng)物行為學(xué)研究證實(shí)了補(bǔ)骨脂總黃酮對(duì)于模型小鼠的記憶衰退具有顯著的改善作用，提示其可能應(yīng)用于阿爾茨海默病的預(yù)防或臨床治療。

附圖說明

圖1是中藥補(bǔ)骨脂的HPLC色譜圖及其主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2是實(shí)驗(yàn)例1中補(bǔ)骨脂總黃酮的典型HPLC色譜檢測(cè)圖(檢測(cè)波長(zhǎng)245nm)；1.補(bǔ)骨脂素(psoralen)，2.異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)，3.新補(bǔ)骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)，4.補(bǔ)骨脂辛(bavachin)，5.補(bǔ)骨脂林素(corylin)，6.補(bǔ)骨脂定(psoralidine)，7.異補(bǔ)骨脂查耳酮(isobavachalcone)，8.補(bǔ)骨脂辛寧(bavachinin)，9.補(bǔ)骨脂醇A(corylifol A)，10.補(bǔ)骨脂查爾酮(bavachalcone)，11.補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)。

圖3是實(shí)驗(yàn)例3中補(bǔ)骨脂總黃酮對(duì)Moris水迷宮中SAMP8模型小鼠的平臺(tái)探索潛伏時(shí)間的影響；R1為正常對(duì)照組，Ctrl為SAMP8模型空白對(duì)照組，低劑量組與高劑量組分別為給以低劑量和高劑量補(bǔ)骨脂總黃酮灌胃給藥的SAMP8模型組。

圖4是實(shí)驗(yàn)例3中補(bǔ)骨脂總黃酮對(duì)Moris水迷宮中SAMP8模型小鼠的平臺(tái)穿越次數(shù)的影響；R1為正常對(duì)照組，Ctrl為SAMP8模型空白對(duì)照組，低劑量組與高劑量組分別為給以低劑量和高劑量補(bǔ)骨脂總黃酮灌胃給藥的SAMP8模型組。

具體實(shí)施方式

本文所述補(bǔ)骨脂總黃酮可作為有效成分制備用于預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物，通過添加常規(guī)藥用輔料并采用恰當(dāng)?shù)闹苿┕に嚳梢灾苽溥m合臨床應(yīng)用的固體或液體制劑，例如片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、注射劑等。

本文所述補(bǔ)骨脂總黃酮的施用方法視具體情況而定，較佳的是通過口服途徑給藥，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量換算，推薦的人用量為5mg/kg或300mg/天。

本文所述補(bǔ)骨脂總黃酮可通過如下步驟制得：將補(bǔ)骨脂藥材粉碎，加入5-20倍量石油醚加熱回流脫脂2-3次；將藥渣用5-20倍量乙酸乙酯提取1-3次，合并提取液，濃縮干燥；在提取物中加入5-20倍量石油醚加熱回流脫脂2-3次，過濾得粗黃酮；用適量50-95％甲醇溶解粗黃酮，按1-5％重量比加入60-100目活性炭顆粒，加熱回流1-3小時(shí)，重復(fù)2-3次除去雜質(zhì)，即得補(bǔ)骨脂總黃酮。

本文所述補(bǔ)骨脂總黃酮可以采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，通過采用如下11個(gè)化學(xué)對(duì)照品可對(duì)其主要成分進(jìn)行含量檢測(cè)：新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂辛、補(bǔ)骨脂林素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂辛寧、補(bǔ)骨脂醇A、補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素。

制備例

補(bǔ)骨脂總黃酮的制備

本方法根據(jù)補(bǔ)骨脂中所含香豆素類與單萜酚類成分和黃酮類成分的極性差別，采用溶劑法分離提純補(bǔ)骨脂總黃酮，方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)高效。本發(fā)明的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)在于，提取溶劑皆可回收使用，石油醚及乙酸乙酯回收方便，除雜步驟中使用的乙醇可測(cè)定密度后配制循環(huán)使用，成本低廉，適合工業(yè)生產(chǎn)。

步驟1：將補(bǔ)骨脂藥材粉碎，加入10倍體積(w:v)石油醚浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次1小時(shí)。

步驟2：取脫脂后藥材粉末，加入原藥材12倍體積(w:v)乙酸乙酯，加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，提取液合并過濾，減壓濃縮至干浸膏，回收溶劑。

步驟3：取提取浸膏，按原藥材10倍體積(w:v)加入石油醚，超聲提取至浸膏分散為黃褐色粉末狀，過濾干燥，可得總黃酮粗提物。

步驟4：將步驟3所得總黃酮粗提物以70％甲醇全部溶解，按溶液3％重量比(v:w)加入60-100目活性炭顆粒，加熱回流2小時(shí)，過濾除去活性炭；本步驟重復(fù)2次，減壓干燥，即得總黃酮精制物。

實(shí)驗(yàn)例1

補(bǔ)骨脂總黃酮的主要成分測(cè)定

本發(fā)明采用高效液相色譜法對(duì)中藥補(bǔ)骨脂與本發(fā)明制備的補(bǔ)骨脂總黃酮中的11個(gè)主要成分進(jìn)行檢測(cè)及定量，以此作為制備工藝的考察指標(biāo)以及產(chǎn)成品的質(zhì)量控制方法，

具體如下：

(1)補(bǔ)骨脂總黃酮供試品：精密稱取補(bǔ)骨脂總黃酮，用甲醇溶解配制成濃度為1mg/mL的溶液，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得總黃酮供試品溶液。

(2)對(duì)照品：準(zhǔn)密稱定11個(gè)化學(xué)對(duì)照品，包括補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂辛、補(bǔ)骨脂林素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂辛寧、補(bǔ)骨脂醇A、補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂酚，用甲醇溶解為合適濃度，等比稀釋為五個(gè)濃度梯度，使其分別覆補(bǔ)骨脂總黃酮中各成分濃度范圍。

(3)HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1％冰醋酸水溶液(V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；流速為1.0mL/min；流動(dòng)相梯度：0min(40％乙腈)～15min(50％乙腈)～35min(60％乙腈)～45min(70％乙腈)～55min(80％乙腈)～60min(80％乙腈)。

(4)按照以上色譜條件建立11個(gè)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算補(bǔ)骨脂總黃酮中各指標(biāo)成分的含量，以8個(gè)黃酮類指標(biāo)成分的合計(jì)含量計(jì)算補(bǔ)骨脂總黃酮的純度。

測(cè)定結(jié)果

補(bǔ)骨脂總黃酮的HPLC色譜圖如圖2所示，按本發(fā)明工藝制備的補(bǔ)骨脂總黃酮中各黃酮組分的相對(duì)比例基本保持了原藥材中的比例，而補(bǔ)骨脂酚與主要的香豆素類成分則已大部分去除。補(bǔ)骨脂總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果如表1所示，經(jīng)過工藝優(yōu)化制備的補(bǔ)骨脂總黃酮3批樣品的純度按其中8個(gè)黃酮類指標(biāo)成分的合計(jì)含量計(jì)算均已超過65％。

表1.補(bǔ)骨脂總黃酮三批制備樣品的含量測(cè)定結(jié)果(％)

實(shí)驗(yàn)例2

補(bǔ)骨脂主要成分的多靶點(diǎn)體外抗AD活性分析

我們?cè)谇捌谘芯恐胁捎肂ACE1、Aβ42、GSK3β、AChE等多個(gè)藥物靶點(diǎn)對(duì)近70種與AD中醫(yī)臨床治療相關(guān)的常用中藥進(jìn)行了活性篩選，發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)骨脂甲醇提取物對(duì)上述靶點(diǎn)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，為了確定補(bǔ)骨脂的主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)補(bǔ)骨脂所含11個(gè)主要成分進(jìn)行了上述靶點(diǎn)的體外抗AD活性分析，結(jié)果證明補(bǔ)骨脂黃酮類成分為其體外抗AD作用的主要活性部位。

供試品：準(zhǔn)密稱定11個(gè)化學(xué)對(duì)照品，包括補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂辛、補(bǔ)骨脂林素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂辛寧、補(bǔ)骨脂醇A、

補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂酚，用DMSO溶解配制為適宜濃度，用于體外活性分析。

化學(xué)試劑：人源Aβ42合成肽，硫代黃素T(ThT)，BACE1熒光檢測(cè)試劑盒，ADP-Glo激酶檢測(cè)試劑盒，重組人源GSK3β，電鰩乙酰膽堿酯酶(AChE)，碘化乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide)，5,5'-二巰基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，二甲基亞砜(DMSO)，其他常用分析試劑。

儀器設(shè)備：MultiScan MK3酶標(biāo)儀，F(xiàn)lexStation 3酶標(biāo)儀，F(xiàn)96Pro熒光分光光度計(jì)，其他常規(guī)儀器。

Aβ₄₂聚集抑制活性分析：取HFIP處理的Aβ₄₂合成肽，用適量DMSO溶解，再用pH 7.4PBS溶液稀釋至55μM。取Aβ₄₂溶液9μL，加入不同濃度的樣品溶液1μL，混合均勻后置于37℃溫箱孵育24小時(shí)，加入40μL新鮮配制的ThT-甘氨酸溶液(25μM,pH 8.5)，充分混勻后避光放置10min，用F96Pro熒光分光光度計(jì)測(cè)量溶液熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為440nm，測(cè)定300-600nm波長(zhǎng)的發(fā)射熒光光譜，以482nm處發(fā)射熒光值作為計(jì)算依據(jù)，每個(gè)樣品在減除其自身對(duì)照的熒光值后與溶劑對(duì)照DMSO組相比較計(jì)算抑制率。

BACE1抑制活性分析：按試劑盒廠家說明書操作，在25μl熒光反應(yīng)緩沖液中含0.25U的BACE1，0.2nmol的BACE1底物，樣品濃度為1-100μM，反應(yīng)液充分混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育2小時(shí)。每樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加酶的反應(yīng)液作為樣品自身對(duì)照。置于FlexStation 3酶標(biāo)儀中，激發(fā)波長(zhǎng)320nm，發(fā)射波長(zhǎng)405nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣品在減除其自身對(duì)照的熒光值后與溶劑對(duì)照DMSO組相比較計(jì)算抑制率。

GSK-3β抑制活性分析：按試劑盒廠家說明書操作，在5μl Tris緩沖體系中含10ng的GSK-3β，100μM的ATP，1μg的底物，樣品濃度為1-100μM，反應(yīng)液充分混勻后室溫孵育1小時(shí)；加入ADP-Glo試劑5μl，室溫孵育40min；加入激酶檢測(cè)緩沖液10μl，室溫下黑暗靜置30min；每樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加酶的反應(yīng)液作為樣品自身對(duì)照。置于FlexStation 3酶標(biāo)儀中，在化學(xué)發(fā)光模式下檢測(cè)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣品在減除其自身對(duì)照的熒光值后與溶劑對(duì)照DMSO組相比較計(jì)算抑制率。

AChE抑制活性分析：在200μl PBS緩沖體系中含0.015U的AChE，0.2mM的碘化乙酰膽堿，0.3mM的DTNB，樣品濃度為1-20μM。每樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加酶的反應(yīng)液作為樣品自身對(duì)照。反應(yīng)液充分混勻后立即置于MultiScan MK3酶標(biāo)儀中，記錄405nm下吸光度值，每分鐘記錄一次，連續(xù)記錄10分鐘。所得吸光度值在減除樣品自身對(duì)照后，以時(shí)間為自變量、吸光度值為因變量進(jìn)行線性擬合，計(jì)算擬合直線斜率。每個(gè)樣品所得反應(yīng)斜率與溶劑對(duì)照DMSO組相比較計(jì)算抑制率。

補(bǔ)骨脂所含11個(gè)主要成分的多靶點(diǎn)體外抗AD活性分析結(jié)果如表2、3所示，香豆素成分補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素以及黃酮類成分補(bǔ)骨脂林素、補(bǔ)骨脂辛、新補(bǔ)骨脂異黃酮等對(duì)全部四個(gè)靶點(diǎn)均未表現(xiàn)出抑制活性，其他成分對(duì)于四個(gè)靶點(diǎn)表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的抑制活性。由于有研究報(bào)道單帖酚類成分補(bǔ)骨脂酚具有體內(nèi)腎毒性，因此將補(bǔ)骨脂體外抗AD的主要活性部位確定為黃酮類成分，其中代表性活性成分包括異補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂辛寧以及補(bǔ)骨脂定。

表2.補(bǔ)骨脂主要成分對(duì)Aβ₄₂聚集、BACE1、GSK-3β和AChE的抑制活性(％)

注：AChE活性分析中各化合物濃度為20μM，其余靶點(diǎn)活性分析中化合物濃度為100μM。

表3.補(bǔ)骨脂活性成分抑制Aβ₄₂聚集、BACE1、GSK-3β和AChE的IC50(μM)

實(shí)驗(yàn)例3

補(bǔ)骨脂總黃酮的體內(nèi)抗AD活性分析

盡管在上述體外實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)了補(bǔ)骨脂所含黃酮類成分對(duì)多個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)具有不同程度的抑制活性，然而并不能說明上述成分一定會(huì)在體內(nèi)發(fā)揮抗AD作用。由于藥物的體內(nèi)作用受到藥物吸收、代謝、分布、排泄等藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的顯著影響，因此只有經(jīng)過哺乳動(dòng)物模型的體內(nèi)藥效學(xué)驗(yàn)證的候選藥物才具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。為了確證補(bǔ)骨脂總黃酮是否具有體內(nèi)抗AD作用，我們選擇SAMP8快速老化小鼠模型對(duì)補(bǔ)骨脂總黃酮的體內(nèi)抗AD效應(yīng)進(jìn)行了研究，通過動(dòng)物行為學(xué)研究證明，補(bǔ)骨脂總黃酮能夠顯著改善快速老化模型小鼠的記憶衰退癥狀，且高劑量長(zhǎng)期給藥未見明顯毒副作用，說明補(bǔ)骨脂總黃酮可能安全應(yīng)用于老年癡呆癥的預(yù)防或臨床治療。

實(shí)驗(yàn)藥物：補(bǔ)骨脂總黃酮粉末加入食用蜂蜜研磨分散均勻，用溫水混懸，蜂蜜終濃度為2.5％，每日給藥前新鮮配制；另配制2.5％蜂蜜水作為空白溶劑。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：將3月齡雄性SAMP8小鼠(快速老化模型鼠)30只分為3組，每組10只，即為模型對(duì)照組、補(bǔ)骨脂總黃酮低劑量組、補(bǔ)骨脂總黃酮高劑量組；另選10只3月齡雄性SAMR1小鼠(同遺傳品系的正常小鼠)作為正常對(duì)照組。各組每日經(jīng)口給藥一次，每次0.5ml。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組均給以空白溶劑，補(bǔ)骨脂總黃酮低劑量組給藥劑量為10mg/kg·d，補(bǔ)骨脂總黃酮高劑量組給藥劑量為50mg/kg·d。

動(dòng)物發(fā)育與生理狀況觀察：各組動(dòng)物定期記錄體重、進(jìn)食量、飲水量、皮毛色澤、自主活動(dòng)等狀況，比較各組間差異及可能出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：分別在小鼠6、9、12個(gè)月齡時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)研究，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)考察小鼠的空間記憶能力。本實(shí)驗(yàn)所用的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為直徑1.2m的圓柱形水槽，其內(nèi)劃分為四個(gè)象限，每個(gè)象限的內(nèi)壁有不同的圖案標(biāo)示以幫助小鼠辨識(shí)，水槽上方有錄像裝置實(shí)時(shí)記錄小鼠的游泳軌跡。在水槽的其中一個(gè)象限中央位置水面下1.5cm存在一個(gè)直徑12cm的黑色塑料平臺(tái)，通過測(cè)量小鼠從入水至到達(dá)平臺(tái)位置的時(shí)間(潛伏期)來考察小鼠的空間記憶能力。該平臺(tái)在小鼠探索訓(xùn)練的前6天保持位置不變，每日由不同象限入水訓(xùn)練3次，每次游泳1分鐘，記錄小鼠從入水至首次發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的探索潛伏期。若小鼠不能在1分鐘內(nèi)發(fā)現(xiàn)平臺(tái)時(shí)則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)，同時(shí)記錄小鼠的探索潛伏期為60秒。第7日撤去平臺(tái)進(jìn)行測(cè)試，記錄小鼠探索潛伏期以及穿越平臺(tái)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)完畢后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與組間比較，判斷各組在空間記憶能力上的差異與藥物的作用效應(yīng)。

動(dòng)物發(fā)育與生理狀況觀察結(jié)果：在動(dòng)物飼養(yǎng)與給藥期間，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物在體重增長(zhǎng)、進(jìn)食量、飲水量等方面無(wú)顯著差別，但模型組小鼠在6月齡后逐漸表現(xiàn)為被毛粗糙與行為焦躁的跡象，9月齡后模型組較普遍出現(xiàn)脊柱后弓及眼周病變。小鼠全程飼養(yǎng)期間，補(bǔ)骨脂總黃酮高、低劑量給藥組與正常組小鼠相比未見與給藥相關(guān)的異常毒副反應(yīng)。

動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在小鼠增齡至6個(gè)月與9個(gè)月時(shí)進(jìn)行的水迷宮測(cè)試實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)各組在平臺(tái)探索潛伏期上的顯著性差異，說明模型組小鼠尚未表現(xiàn)出記憶顯著衰退的跡象。但在小鼠達(dá)到12月齡時(shí)，各組小鼠在空間探索記憶上出現(xiàn)非常顯著的差別(表4、圖3、圖4)，模型組小鼠的平臺(tái)探索潛伏期顯著高于正常對(duì)照組，其在相同時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)也顯著少于正常對(duì)照組，說明模型組小鼠的空間記憶能力顯著降低，而補(bǔ)骨脂總黃酮的兩個(gè)劑量給藥組相對(duì)于模型組來說其空間記憶能力均有顯著改善，且表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng)，其中高劑量組小鼠的記憶表現(xiàn)與正常對(duì)照組相似。此結(jié)果證明了補(bǔ)骨脂總黃酮口服給藥能夠顯著減輕SAMP8模型小鼠隨年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的快速記憶衰退癥狀，提示補(bǔ)骨脂總黃酮可能作為一種新的候選藥物應(yīng)用于阿爾茨海默病的預(yù)防或臨床治療。

表4.補(bǔ)骨脂總黃酮對(duì)SAMP8模型小鼠記憶衰退的改善作用(Morris水迷宮實(shí)驗(yàn))

**：與正常對(duì)照組相比，P<0.01；##：與模型對(duì)照組相比，P<0.01。